Carvedilol, ein adrenerger Blocker, unterdrückt die Melaninsynthese durch Hemmung des CAMP/CREB-Signalwegs in menschlichen Melanozyten und in menschlichen Ex-vivo-Hautkulturen

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Myoung Eun Choi 1,†, Hanju Yoo 1,2,†, Ha-Ri Lee 2,3, Ik Joon Moon 1, Woo Jin Lee 1,Youngsup Song 3,*,‡ und Sung Eun Chang 1

Abstrakt:Katecholamine wirken über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und lösen einen Anstieg der intrazellulären Konzentrationen von 30, 50- zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) in verschiedenen Zellen aus. Die Catecholaminbiosynthese und der -adrenerge Rezeptor existieren inMelanozyten; Daher können Katecholamine eine entscheidende Rolle bei der Hautpigmentierung spielen. Ihre Wirkung und Mechanismen, die die Melanogenese in der menschlichen Haut vermitteln, wurden jedoch noch nicht untersucht. Daher untersuchten wir die potenzielle anti-melanogenetische Wirkung von Carvedilol, einem nichtselektiven -Blocker mit schwacher 1--blockierender Aktivität. Carvedilol reduzierte den Melaningehalt und die Aktivität der zellulären Tyrosinase, ohne die zelluläre Lebensfähigkeit beim normalen Menschen zu beeinträchtigenMelanozytensowie in Mel-Ab immortalisierten Maus-Melanozyten. Carvedilol hat den Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktor (MITF), Tyrosinase, Tyrosinase-Related Protein (TRP)-1 und TRP-2 herunterreguliert. Die Behandlung mit Carvedilol führte zu einer Herunterregulierung des Phosphor-cAMPresponse-Element-bindenden Proteins (CREB). Darüber hinaus kehrte der Anstieg der cAMP-Spiegel bei Behandlung mit Forskolin die anti-melanogene Wirkung von Carvedilol um. Darüber hinaus verringerte Carvedilol den Melaninindex in ultraviolettbestrahlten menschlichen Hautkulturen bemerkenswert. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass Carvedilol die Melanogenese beim Menschen wirksam unterdrücktMelanozytenund ex vivo menschliche Haut durch Hemmung der cAMP/Proteinkinase A/CREB-Signalgebung. Die antimelanogene Wirkung von Carvedilol hat potenzielle Bedeutung für die HautAufhellungAgenten.

Schlüsselwörter:Carvedilol; adrenerger Blocker;Melanin-Synthese; cAMP/CREB-Signalisierung

Cistancheist in der Lage, die Melaninsynthese zu hemmen

1. Einleitung

Ein breites Spektrum von Pigmentstörungen der Haut hat erhebliche psychologische und soziale Auswirkungen auf die Patienten. Verschiedene Behandlungsmodalitäten, darunter systemische und topische Mittel sowie Lasertherapie, wurden entwickelt [1–3]. Die Ergebnisse sind jedoch oft unbefriedigend und Nebenwirkungen der Behandlung wie postinflammatorische Hyperpigmentierung (PIH) und Hypopigmentierung sind häufig. Außerdem ist die Behandlung teuer und zeitaufwändig [4–6].

Katecholamine, zu denen Dopamin, Epinephrin und Norepinephrin gehören, sind Signalmoleküle, die als Neurotransmitter und endokrine Hormone wirken. In der Haut finden die Biosynthese und der Abbau von Katecholaminen in menschlichen Keratinozyten statt, die Katecholaminsynthese in Melanozyten ist jedoch etwas anders [7–9]. Katecholamine wirken über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). Die Bindung von Katecholaminen an die GPCRs löst die Aktivierung der intrazellulären Adenylatcyclase aus, die 30, 50-zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) aus ATP synthetisiert [10]. Der Second Messenger cAMP übt seine Aktivität aus, indem er an die R-Untereinheit der Proteinkinase A (PKA) bindet, was zur Phosphorylierung des cAMP-Response-Element-bindenden Proteins (CREB) führt. GPCRs werden durch Amine und Peptide aktiviert, einschließlich Glucagon, Parathormon, Sekretin und Calcitonin [10].

Adrenerge Rezeptorantagonisten schließen -Rezeptor und -Rezeptorantagonisten ein. -Rezeptorantagonisten werden in nichtselektive, 1-selektive und 2-selektive Wirkstoffe unterteilt, während -Rezeptorantagonisten in nichtselektive, 1-selektive und 2-selektive Wirkstoffe unterteilt werden Mittel basierend auf ihren selektiven Blockierungsaktivitäten. Im Gegensatz zu nicht-selektiven -Rezeptor-Antagonisten der ersten Generation, wie Propranolol, Timolol und Nadolol, ist Carvedilol ein nicht-selektiver -Rezeptor-Antagonist der dritten Generation, der gefäßerweiternde Wirkungen entfaltet, indem er 1-Adrenorezeptoren (1-ARs) blockiert. [11]. Daher ist Carvedilol ein nicht selektiver -Blocker mit schwacher 1--Blockierungsaktivität [12]. Es wird hauptsächlich als orales Medikament zur Kontrolle von Bluthochdruck und kongestiver Herzkrankheit verwendet, ähnlich wie andere -Blocker [12]. Blocker der dritten Generation weisen jedoch angiogene, antioxidative, antiproliferative, antihypertrophe und antiapoptotische Aktivitäten auf, die einer weiteren Aufklärung bedürfen [11]. Im dermatologischen Bereich wird Carvedilol aufgrund seiner antioxidativen und entzündungshemmenden Wirkung häufig in oralen Formulierungen zur Behandlung von thematoteangiektatischer Rosacea eingesetzt [13,14]. Darüber hinaus führt die antioxidative Aktivität von Carvedilol zur Prävention von UV-induzierter Hautkarzinogenese, was es zu einem attraktiven Mittel zur Behandlung von UV-assoziierten Hauterkrankungen macht [15–18]. Die chemopräventiven Wirkungen von Carvedilola werden jedoch nicht direkt durch ARs vermittelt. [19] Obwohl der genaue Mechanismus relativ unbekannt ist, könnte der cAMP/PKA- und PKC-δ-Signalweg mit den Eigenschaften von Carvedilol gegen Hautmetastasen in Verbindung gebracht werden [20].

In den frühen Stadien der Untersuchung von Pigmentierung, MenschMelanozytenexprimierten -1-AR-Signale nach extrazellulärer Induktion mit Norepinephrin. -ARs wurden jedoch nach Stimulation mit adrenergen Signalen nicht gefundenMelanozyten[8]. Umgekehrt haben Cillbro et al. später demonstriert, dass ein spezifisches funktionelles 2-AR-Signal in menschlichen Melanozyten vorhanden ist und dass die 2-AR-Stimulation zu einer Pigmentierung über den 2-AR/cAMP-Signalweg führt [7]. Daher wurde die Rolle von Katecholaminen bei der Kontrolle der Pigmentierung vorgeschlagen, und cAMP wird als die Hauptachse für die Katecholaminkontrolle der Melanogenese angesehen.

Die Melanogenese ist ein komplexer Prozess, an dem zahlreiche Wege beteiligt sind. Tyrosinase, Tyrosinase-Related Protein 1 (TRP-1) und TRP-2, auch Dopachrom-Tautomerase (DCT) genannt, sind die drei wichtigsten melanozytenspezifischen Enzyme, an denen sie beteiligt sindMelanin-Synthese[21]. Die Melanogenese wird durch zahlreiche Faktoren induziert oder gehemmt, darunter Hormone, Zytokine, Neurotransmitter, Wachstumsfaktoren und Mikromoleküle [21–23].

Der wichtigste positive Regulator ist der Melanocortin-1-Rezeptor und seine Liganden, Melanocortine und das adrenocorticotrope Hormon [23]. Verschiedene Faktoren, die an der Melanogenese beteiligt sind, sind jedoch -Endorphin, Östrogene, Androgene, Vitamin D3 und Katecholamine [23]. Kumulative Beweise deuten darauf hin, dass L-Tyrosin und L-DOPA, die Substrate und Zwischenprodukte der Melanogenese sind, zusätzlich zu Regulatoren anderer Zellfunktionen als Induktoren und positive Regulatoren des melanogenen Signalwegs wirken [24]. Darüber hinaus haben Jeff Howe et al. schlugen vor, dass die Induktion und Regulierung der Melanogenese durch L-Tyrosin eher durch die direkte Aktivierung adrenerger Rezeptoren durch L-Tyrosin vermittelt wird als durch seine Stoffwechselprodukte wie Katecholamine [25]. In ihren Studien stimulierten Norepinephrin und Epinephrin die Tyrosinase-Aktivität, aber ihre induktive Wirkung aufMelanin-Synthesewar vergleichsweise geringer als L-Tyrosin [25].

Katecholamine können eine wichtige Rolle im Hautpigmentierungssystem spielen; ihre Auswirkungen auf die Melanogenese im Hinblick auf die Wirkung von nicht-selektiven -Blockern der dritten Generation wurden jedoch noch nicht untersucht. Daher wollten wir in der vorliegenden Studie untersuchen, ob Carvedilol die Melanogenese beeinflusst, und seine Wirkungsmechanismen beim Menschen untersuchenMelanozytenund ex vivo menschliche Haut und ihre potenzielle Verwendung als aAufhellungProdukt.

hemmen die Melaninbildung mitHerba cistanches

2. Ergebnisse

2.1. Carvedilol unterdrückt die Melanogenese

Die Zytotoxizität von Carvedilol gegenüber normalen MenschenMelanozyten(NHMs) und Mel-ab-Zellen wurden durch einen WST-Zellproliferationsassay bewertet. Eine Carvedilol-Konzentration von 10 µM begann Zytotoxizität sowohl gegen NHMs als auch gegen Mel-ab-Zellen zu zeigen (Abbildung 1A, B). Daher verwendeten wir in weiteren Bewertungen 8 µM Carvedilol, das für NHMs nicht zytotoxisch ist.

Die Behandlung mit Carvedilol verringerte den Melaningehalt dosisabhängig, ohne die Lebensfähigkeit von NHMs zu beeinträchtigen (Abbildung 1C). Der Melaningehalt wurde um 28,36 Prozent nach der Behandlung mit 96 hof 8 &mgr;M Carvedilol verringert ( 1C ). Die Zugabe von 100 mg/ml Arbutin reduzierte den Melaningehalt in geringerem Maße als Carvedilol (Abbildung 1C). Nach 4 Tagen Carvedilol-Behandlung nahm der Melaningehalt zeitabhängig ab (Abbildung 1D). Die Behandlung mit Forskolin (FSK) für 4 Tage nach der Vorbehandlung mit Carvedilol induzierte jedoch einen Anstieg des Melaningehalts (Abbildung 1E). FSK erhöht die Transkription von MITF nach 2 h in NHMs am stärksten und wirkt vermutlich über das cAMP /PKA/CREB-Weg (Abbildung 1F).

2.2. Carvedilol hemmt die Expression von MITF und seinen Zielgenen und senkt die Phospho-CREB-Spiegel in NHMs

Da Carvedilol die Melaninakkumulation verringerte, untersuchten wir die zelluläre Tyrosinaseaktivität. Die Behandlung mit Carvedilol verringerte die zelluläre Tyrosinaseaktivität dosisabhängig in NHMs (Abbildung 2A). Die Tyrosinase-Aktivität verringerte sich um 28,48 Prozent nach 96 h Behandlung mit 8 &mgr;M Carvedilol (Abbildung 2A). Als nächstes bestimmten wir, ob Carvedilol die Expression von MITF beeinflusst, das eine entscheidende Rolle bei der Regulation von Tyrosinase und nachgeschalteten melanogenen Genen spielt. Die FSK-Behandlung erhöhte die intrazellulären cAMP-Spiegel und kehrte die anti-melanogene Wirkung von Carvedilol um. Carvedilol reduzierte die Proteinspiegel von MITF, einem zentralen Transkriptionsfaktor der Melanogenese, nach 72 h signifikant (Abbildung 2B). Darüber hinaus war die Expression seiner Zielgene wie Tyrosinase und TRP-1 nach Carvedilol-Behandlung verringert (Abbildung 2B). Diese Ergebnisse zeigen, dass Carvedilol die Melanogenese hemmt, indem es die MITF-Signalgebung herunterreguliert.

Als nächstes untersuchten wir die intrazellulären Signalwege der Melanogenese, die die MITF-Transkription regulieren, indem wir die Expressionsniveaus von Phospho-CREB und Phospho-ERK maßen. Die Phospho-ERK-Spiegel änderten sich im Laufe der Zeit nach der Behandlung mit Carvedilol nicht; die Phospho-CREB-Spiegel waren jedoch verringert (Abbildung 2B). In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen zeigten unsere Ergebnisse, dass Carvedilolin die Melanogenese hemmt, indem es den cAMP/PKA/CREB-Signalweg hemmt. Darüber hinaus kehrte die FSK-Behandlung die anti-melanogene Wirkung von Carvedilol um, indem sie die cAMP-Spiegel erhöhte.

2.3. Melanin-Index und immunhistochemische Färbung in menschlicher Ex-vivo-Hautkultur

Die epidermale Melanozytendichte und der Melaninindex in Ex-vivo-Gewebeschnitten menschlicher Hautkulturen wurden durch Melan-A- bzw. Fontana-Masson-Färbung nachgewiesen. Carvedilol hatte keinen Einfluss auf die Anzahl von Melan-A ( plus )Melanozytenin der Probe, die mit Carvedilol plus UV-Strahlung (UVR) behandelt wurde, verglichen mit der in der Probe, die nur mit UVR behandelt wurde (Abbildung 3A). HMB45(plus)-Melanozyten können darauf hindeuten, dass die Melanozytenaktivität bei UVR-Behandlung zunahm und nach Carvedilol-Behandlung umgekehrt herunterreguliert wurde (Abbildung 3B). Der Melaningehalt war jedoch bei mit Carvedilol plus UVR behandelten Proben im Vergleich zu den mit UVR allein behandelten Proben signifikant reduziert (Abbildung 3C). Zur Berechnung des Melaninindex wurde der Anteil der Fontana-Masson-Färbung an der Gesamtfläche zwischen einer UV-Strahlung ausgesetzten Probe und einer Carvedilol plus UV-Strahlung berechnet und verglichen (Abbildung 3D). Zelllysate jeder Probe wurden durch Western Blotassay analysiert, was zeigte, dass Tyrosinase, TRP1 und DCT durch UVR erhöht und durch Carvedilol-Behandlung herunterreguliert wurden (Abbildung 3E). Als Ergebnis reduzierte Carvedilol den Melaninindex und mit der Melanogenese in Verbindung stehende Proteine ​​bemerkenswert, was seine antimelanogene Wirkung auf UVR-behandelte menschliche Haut zeigt.

3. Diskussion

Melanin ist das für Haut- und Haarfarbe verantwortliche Pigment und wird in Melanosomen von synthetisiertMelanozyten. Obwohl das epidermale Melanin eine wichtige schützende Rolle gegen UV-Strahlung spielt, verursacht die Überproduktion und Akkumulation von Melanin in der Haut lästige Hauthyperpigmentierungsstörungen wie PIH, mit Lichtalterung assoziierte Dyspigmentierung, Melasma und solare Lentigines [18,26]. Daher stand die Hemmung der Melanogenese im Mittelpunkt medizinischer und kosmetischer Behandlungen für die Schönheit und Gesundheit der Haut. Es wurden beträchtliche Anstrengungen unternommen, um neue und wirksame Antipigmentierungsmittel zu identifizieren. Die Anti-Melanogenese-Mechanismen der spezifischen Wirkstoffe sind jedoch derzeit ungewiss und wurden im Allgemeinen in Mauszellen untersucht, was zu Ergebnissen führt, die nicht immer mit denen von Studien an der menschlichen Haut übereinstimmen [27,28]. Da die Melanogenese von Melanozyten durch Keratinozyten und andere benachbarte Zellen streng reguliert wird, sind kokultivierte menschliche Zellen oder ex vivo menschliche Haut zuverlässigere experimentelle Einstellungen für die Erforschung wirksamerAufhellungAgenten [29]. Die meisten Hautaufhellungsmittel, ob natürlich oder chemisch gewonnen, können Hauttoxizität oder -reizung verursachen, was bis zu einem gewissen Grad unter Verwendung von In-vitro-Zelllebensfähigkeitsassays mit Melanozyten vorhergesagt werden kann. In unserer Studie zeigte Carvedilol keine Zytotoxizität, wenn es in moderaten Dosen verwendet wurde.

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Topische Cremes mit Hydrochinon können zu unerwünschten Hypopigmentierungsstörungen und Hauttoxizität führen [30–32]. Außerdem einigeAufhellungKosmetika haben verheerende Folgen, indem sie durch den Abbau von Tyrosinaseproteinen eine Hypopigmentierung induzieren [33–35]. Aufhellungsmittel können je nach Benutzer in höheren Dosen verwendet werden, um die Aufhellung hyperpigmentärer Läsionen zu maximieren. Daher werden ständig Anstrengungen unternommen, um sichere und gesunde Hautaufhellungsmittel zu entdecken.

Daher wurde die vorliegende Studie so konzipiert, dass sie in normalen menschlichen Zellen und ex vivo menschlicher Haut durchgeführt wird. Darüber hinaus glaubten wir, basierend auf dem etablierten Wirkungsmechanismus der Katecholamine der G-Signalübertragung, der den zellulären cAMP-Spiegel erhöht, dass ein adrenerger Blocker die cAMP-Spiegel senken und den UVR/cAMP/CREB-Signalweg hemmen könnte, der der Hauptmechanismus für UV-induzierte Hauthyperpigmentierung ist [36,37]. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass adrenerge Blocker, die die cAMP-Spiegel senken, diese reduzierenMelanin-Synthese.

Darüber hinaus sicher zu entwickelnAufhellungWirkstoffen sollten parallel verlässliche und reproduzierbare Mechanismen der Antimelanogenese verfolgt werden. Der physiologisch bedeutendste Stimulus ist UV und unter den UVR-Signalen an die EpidermisMelanozytenist die CREB-Achse der etablierteste Weg für die Regulation der Melanogenese in der menschlichen Epidermis [29]. UV-Exposition aktiviert sukzessive die scAMP-Produktion, PKA und den Transkriptionsfaktor CREB, der wiederum die Expression von MITF und nachgeschalteten melanogenen Zielgenen induziert [38,39]. Zusätzlich zur CREB-Phosphorylierung durch PKA haben neuere Studien gezeigt, dass die Rekrutierung von CREB-reguliertem Transkriptions-Coaktivator (CRTC) 3 zum CREB-Transkriptionskomplex auch für cAMP-stimuliertes MITF erforderlich ist. MITF spielt die wichtigste Rolle bei der Regulierung vonMelanin-Syntheseund die resultierende Transkription melanogener Enzyme [26,40,41]. Während dieses intrazellulären Signalprozesses wird die Melanogenese durch ein Schlüsselenzym, Tyrosinase, und zusätzliche enzymatische Proteine ​​wie TRP-1 und DCT [1–4] reguliert. In der vorliegenden Studie reduzierte Carvedilol effektiv die Phosphorylierung von CREB, die weist darauf hin, dass es MITF- und Tyrosinase-Proteine ​​reduziert, indem es die MITF-Transkription hemmt (Fig. 4). In Anbetracht dessen, dass die MITF-mRNA-Genregulierung durch andere intrazelluläre Signalmoleküle und Coaktivatoren kompliziert kontrolliert und gerettet wird, ist die Regulierung der Transkriptionsebene von MITF eine vielversprechende Strategie zur Erforschung gesunder Hautaufhellungsbestandteile, da die Überlebensfunktion von MITF erhalten und gerettet wird [1,38,40]. Als wir die FSK-induzierte MITF-Transkription untersuchten, wurde tatsächlich festgestellt, dass MITF-mRNA ihre eigene Peak-Response-Kurve für die Melanogenese und das zelluläre Überleben für die zelluläre Homöostase hat. Die biologischen Funktionen vonMelanozytenschien intrinsisch durch andere Feedback-Signale in menschlichen Melanozyten reguliert zu werden. Darüber hinaus hat Carvedilol ein geringeres Risiko für unerwünschte Ereignisse wie Hypopigmentierung, da es die zelluläre Tyrosinase-Aktivität im Laufe der Zeit und nicht abrupt abschwächt.

Katecholamine umfassen Dopamin, Epinephrin und Norepinephrin und werden durch die Wirkung von Enzymen aus Tyrosin in der Nahrung synthetisiert [42]. Die Biosynthese und der Abbau von Katecholaminen finden in einer Vielzahl von Zellen statt, einschließlich der Neuronen des Sympathikus und des Gehirns, Adrenomedullaryzellen, Endothelzellen, Neutrophilen und mononukleären Zellen [43–45]. In der menschlichen Haut findet die Katecholaminsynthese in Keratinozyten statt. Umgekehrt exprimieren Melanozyten auch mRNA und Enzyme für die autokrine Synthese von Norepinephrin, aber nicht von Epinephrin [7,42]. Im MenschenMelanozyten, -1-AR kann bei der Reaktion auf Norepinephrin wichtig sein, aberMelanin-Synthesewird auch durch funktionelle 2-AR-Signale beeinflusst [7,8]. Interessanterweise haben Patienten mit Vitiligo eine erhöhte 2- AR-Dichte in Keratinozyten [46]. Erhöhte Norepinephrinspiegel werden im Urin und Plasma von Patienten mit nicht-segmentaler Vitiligo gefunden, was darauf hindeutet, dass der Katecholaminstoffwechsel mit der Entwicklung und dem Fortschreiten von Vitiligo in Verbindung gebracht werden kann [47]. Darüber hinaus produzieren Melanozyten zusätzlich zu den klassischen Stress-Neurotransmittern Neuropeptide und Hormone wie den Corticotropin-Releasing-Faktor und Proopiomelanocortin. Diese Produktion wird durch UV-Strahlung und andere Wirkstoffe stimuliert, die im neuroendokrinen System der Haut wirken [48]. Daher sind die Wirkung von Catecholaminen und die melanozytische Funktion in einer Vielzahl komplexer Wege eng miteinander verbunden. Darüber hinaus könnte Carvedilol die chemischen Reaktionen im melanogenen Stoffwechselweg stören, und diese Möglichkeit sollte weiter untersucht werden. Carvedilol kann Vorteile haben, da es gleichzeitig entzündungshemmende Wirkungen hat, da die meisten hyperpigmentären Erkrankungen bei dunkelhäutigen Patienten klinisch oder subklinisch durch PIH verursacht werden. Da die Permeation von Carvedilol durch die Haut sowohl in vitro als auch ex vivo untersucht wurde, kann Carvedilol als topisches Mittel entwickelt werdenAufhellungAgent in der Zukunft [49–51].

Die systemische Verabreichung von Carvedilol kann Bradykardie, Schwindel, Hypotonie, Kopfschmerzen und Benommenheit verursachen. Die topische Anwendung von Carvedilol verursacht normalerweise keine systemischen Symptome; jedoch sollten wir diesen Symptomen bei der Anwendung bei Patienten mit gestörter Hautbarriere, wie z. B. solchen mit atopischer Dermatitis, besondere Aufmerksamkeit schenken. Darüber hinaus wird in seltenen Fällen bei der Einnahme von Carvedilol über Ekzeme, Pruritus und lichenoide Eruptionen berichtet. Diese dermatologischen Nebenwirkungen sowie Kontaktdermatitis sollten auch bei der topischen Anwendung von Carvedilol berücksichtigt werdenAufhellungAgent.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass Carvedilol die Melanogenese beim Menschen wirksam reduziertMelanozytenund menschliche Ex-vivo-Haut durch Hemmung des cAMP/CREB/MITF-Signalwegs, was seine potenzielle Verwendung als wirksames Aufhellungsmittel nahe legt. Weitere Untersuchungen zur funktionellen Beteiligung des Adrenergrezeptors durch Carvedilol in menschlichen Melanozyten sollten folgen.

4. Materialien und Methoden

4.1. Materialien

Carvedilol, 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin (L-DOPA), Choleratoxin (CT) und 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) wurden von Sigma-Aldrich Co. bezogen. (St. Louis, MO, USA). Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) und Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung wurden von WelGENE (Daegu, Korea) gekauft. Fötales Rinderserum (FBS), Antibiotikum-Antimykotikum und Trypsin-EDTA wurden von Gibco (Grand Island, NY, USA) bezogen. Medium 254 (CascadeBiologics, Portland, OR, USA) und FSK ([3R-(3 ,4a ,5 ,6 ,6a ,10 ,10a ,10b )]-5-(Acetyloxy)-3-ethenyldodecahydro{ {24}},10,10b-Trihydroxy-3,4a,7,7,10a-Pentamethyl-1H-naphtho[2,1-b]pyran-1-on ) wurden von Tocris Bioscience (Bristol, UK) erworben.

4.2. Zelllinien und Zellkultur

Von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) erhaltene primäre NHMs wurden in Medium 254 (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) gehalten, das mit menschlichem Melanozyten-Wachstumszusatz (Thermo Fisher) ergänzt war. Mel-ab-Zellen, eine von der Maus stammende spontan immortalisierte Melanozyten-Zelllinie, wurden von der Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea) erhalten und in DMEM gehalten, das mit 10 Prozent FBS, Penicillin-Streptomycin, 100 nM TPA und 1 nM ergänzt war CT. Alle Zellen wurden routinemäßig bei 37 °C in einer befeuchteten Umgebung mit 5 % CO2 gehalten.

4.3. Antikörper und Western Blots

Die Zellen wurden einmal mit kaltem PBS gewaschen und in Proteinlysepuffer (1 Prozent SDS in 1 0 mMTris und 5 mM EDTA, pH 7,4) lysiert, gefolgt von einer Inkubation bei 98 °C für 10 min. Die Proteinproben wurden durch 8-prozentige SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt, auf Nitrozellulosemembranen (GE Healthcare Life Sciences, Chicago, IL, USA) geblottet und dann mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,5 Prozent Tween 20 und 5 Prozent BSA enthielt, blockiert einem Immunoblot unterzogen. Tyrosinase und TRP-1-Antikörper wurden von Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA) gekauft, und MITF wurde von Abcam (Cambridge, UK) gekauft. -Tubulin (Gentex, Holland, MI, USA) wurde als interne Ladekontrolle verwendet.

4.4. Melaningehalt

Die zytotoxische Wirkung von Carvedilol wurde unter Verwendung des Ez-Cytox Cell Viability Assay Kit (Dogen-Bio Co., Ltd., Seoul, Korea) gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet. Mel-Ab-Zellen und NHMs wurden in Platten mit sechs Vertiefungen ausgesät bei einer Dichte von 6 × 105 bzw. 3 × 105 Zellen/Vertiefung. Die Zellen wurden, wie in den Abbildungen gezeigt, für 3 oder 5 Tage (d) mit Carvedilol behandelt. Vor der Messung des Melaningehalts wurden die Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop beobachtet und fotografiert (Olympus, Tokyo, Japan). Die Zellen wurden in 550 µl 1 N NaOH bei 100 ◦C für 30 min gelöst und bei 13, 000 rpm für 5 min zentrifugiert. Die Extinktion der Überstände wurde bei 405 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Der intrazelluläre Melaningehalt wurde in Prozent relativ zur unbehandelten Kontrolle der Zellen dargestellt. Arbutin (100 mg/ml) wurde als positive Kontrolle verwendet.

4.5. Zelluläre Tyrosinase-Aktivität

Die Tyrosinase-Aktivität wurde durch Messen der Rate der Dopachrombildung von L-DOPA bewertet. Nach der Inkubation mit Carvedilol wurden die Zellen in eiskaltem PBS gewaschen und in Tyrosinase-Lysepuffer (Phosphatpuffer, pH 6,8, enthaltend 1 Prozent Triton X{ {5}}) mit wiederholten Einfrier-/Auftauzyklen. Die Lysate wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 15,000 U/min bei 4 ◦C geklärt. Nach Quantifizierung der Proteinspiegel des Lysats und Anpassung der Proteinkonzentrationen mit Lysepuffer wurden 90 µl Überstand gemischt mit 10 µl 10 mM L-DOPA in Tyrosinase-Lysepuffer bei 37 °C inkubiert. Die zelluläre Tyrosinaseaktivität wurde durch Ablesen der Extinktion bei gemessen 475 nm mit einem Mikroplattenlesegerät alle 10 min für mindestens 1 h. Arbutin (100 mg/ml) wurde als positives Kontrollmittel verwendet.

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4.6. Immunhistochemische Analyse

In Paraffin eingebettetes menschliches Hautgewebe wurde in 6- µm dicke Schnitte geschnitten und mit Melan-A (Novocastra, Newcastle, UK), Fontana-Masson-Kits (ID Labs, London, ON, Kanada) und HMB45 (Santa Clara , CA, USA), gemäß den Anweisungen des Herstellers. Der Melaninindex wurde bestimmt, indem der Prozentsatz der gefärbten Fläche zur gesamten Gewebefläche unter Verwendung der ImageJ 1.52a-Software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) gemessen wurde.

4.7. Statistische Analyse

Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt, und die statistische Signifikanz wurde durch einen ungepaarten Student-t-Test unter Verwendung der GraphPad Prism5-Software (San Diego, CA, USA) bestimmt. In dieser Studie wurden p < 0,05,="" p="">< 0,01="" und="" p="">< 0,001="" als="" statistisch="" signifikant="" betrachtet="" und="" durch="" *,="" **="" und="" ***="" dargestellt.="">

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