Änderungen in Aminosäureprofilen und bioaktiven Verbindungen von thailändischen Seidenkokons, die durch Wasserentnahme betroffen sind Teil 2

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2.8. Korrelationen

Eine Korrelationsanalyse (Pearson-Test) wurde verwendet, um Vergleiche (als Korrelationskoeffizienten, r) zwischen Werten für Gesamtphenolgehalt, Gesamtflavonoidgehalt, DPPH-Radikalfängeraktivität, ABTS plus, FRAP-Assay, Anti- --Amylase durchzuführen , Anti- --Glucosidase und Antiglykation von SPE in Nangsew- und Eri-Stämmen (Tabellen 5 und 6). Jeder aus der Studie erhaltene Parameter zeigte starke positive Korrelationen zwischen TPC, TFC, DPPH, ABTS, FRAP-Anti- --Amylase, Anti- --Glucosidase und Anti-Glykation. Dies kann daran liegen, dass die im Seidenextrakt enthaltenen bioaktiven Verbindungen verschiedene freie Radikale und Anti- -amylase, Anti- -glucosidase und Antiglykation abfangen können. Unsere Ergebnisse haben auch gezeigt, dass es eine hochsignifikante lineare Korrelation zwischen den Ergebnissen für die beiden Stämme gibt. Diese Ergebnisse stimmten mit denen von Benzie und Stezo [29] überein, die eine starke positive Korrelation zwischen dem Gesamtphenolgehalt und dem FRAP-Assay fanden. Ähnliche Ergebnisse wurden auch zwischen TPC und DPPH (R2=0.711) bzw. FRAP (R2=0.948) in bitterem Kürbis gefunden, wie von Kubola berichtet [30]. Kumar et al.[31] führten eine Bewertung der antioxidativen Aktivität und des Gesamtphenols in verschiedenen Sorten von Lantana Camara-Blättern durch. Die Extrakte zeigten starke Korrelationen zwischen dem Phenolgehalt und den Abfangaktivitäten von DPPH, FRAP und ABTS. Die höchste Korrelation (r=0.998, R2=0.997) wurde zwischen dem Gesamtphenolgehalt und dem ABTS-Scavenging-Assay gefunden. Darüber hinaus wurde von Kaewseejan et al. über positive Korrelationen zwischen ABTS und TPC(R2=0.885) bzw. DPPH(R2=0.999) in Blättern von Gynura procumbens berichtet. [32].

Die Korrelationen zwischen biologischen Eigenschaften und inhibitorischer Aktivität wurden in der Forschung von Quan et al. gefunden.[33] die die antioxidativen und potenziell diabetischen hemmenden Eigenschaften von C.tramdenum-Rindenextrakten untersuchten. Das ergaben auch ihre ErgebnisseAntioxidansAssays (einschließlich DPPH, ABTS, Reduktionskraft und Stickoxid) korrelierten stark mit dem -Amylase- und -Glucosidase-Inhibitionsassay bei p<>

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3. Materialien und Methoden 3.1.Silk Coc00ns

Nangsew- und Eri-Stämme von thailändischen Seidenkokons wurden gesammelt. DasNangsew-Stamm(gelbe Kokons) wurde von Baan Hua Saban, Distrikt Phutthaisong, Provinz Buriram, Thailand, erhalten. Der Eri-Stamm (weiße Kokons) stammte aus der Gemeinde Nong Ya Plong, Mancha Khiri, Provinz Khon Kaen, Thailand.

3.2. Chemikalien und Reagenzien

Alle Standards wurden von Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) bezogen, einschließlich der essentiellen Aminosäuren: Phenylalanin, Valin,Tryptophan, Threonin, Isoleucin, Methionin, Histidin, Arginin, Lysin und Leucin. Die untersuchten nicht-essentiellen Aminosäuren waren Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Glutamin, Serin, Tyrosin, Alanin und Asparagin. Die Reagenzien zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität wurden von Sigma-Aldrich Co: Folin-Ciocalteu Reagenz, 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH),2,4,6-tripiridyl-s-triazine erhalten (TPTZ), 2,2'-und-bis(3-thylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)(ABTS). Die bei der HPLC-Analyse verwendeten Lösungsmittel und Reagenzien wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Die -Amylase (aus Aspergillus oryzae), -Glucosidase (aus Bacillus stearothermophilus), p-Nitrophenyl- -D-glucopyranosid (PNP-G), Rinderserumalbumin (BSA) und Natriumazid wurden von Sigma-Aldrich bezogen Co.

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3.3. Extraktion mit destilliertem Wasser

Die Extraktion erfolgte nach der Methode von Sangwong et al. [34]. Seidenkokons wurden in kleine Stücke geschnitten. Zwei Gramm dieser Stücke wurden mit 200 ml destilliertem Wasser bei 100 Grad für die angegebenen Extraktionszeiten extrahiert. Die Extrakte wurden mit einer Zentrifuge (Universal 320/320R, Hettich, Boucherville, QC, Kanada) 10 Minuten bei 5000 × g zentrifugiert. Die Extrakte wurden unter Vakuum durch Whatman-Papier Nr. 1 filtriert, um unlösliches Material zu entfernen, wodurch der Seidenproteinextrakt (SPE) hergestellt wurde.

3.4. Proteinbestimmung

Die Proteinbestimmung wurde durch den Bradford-Assay [35] beschrieben bestimmt. SPE (0,5 ml) wurde zu 1,0 ml Bradford-Lösung gegeben und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Als Standardreferenzprotein wurde Rinderserumalbumin (BSA) verwendet. Die Extinktion der Proben wurde bei 595 nm mit einem sichtbaren Spektrophotometer (DR 2700rM Portable Spectrophotometer, Hach, Loveland, CO, USA) gemessen.

3.5.Amin0-Säuregehalt durch LCMS/MS

Die Aminosäureanalyse umfasste ein LC-MS-MS (Shimadzu LCMS-8030) Triple-Quadrupol-Massenspektrometer, einen Elektrospray-Ionisationsmodus (ESI), gefolgt von einer Analyse in einem Shimadzu HPLC-System (Shimadzu, Kyoto, Japan) (Chumroenphat et al. [36). Die HPLC-Analyse umfasste eine Flussrate von 0,2 ml/min; die Temperatur des Säulenofens betrug 38 Grad und die des Autosamplers 4 Grad. Die mobilen Phasen wurden aus (A) wässriger Ameisensäure {{10}},1 Prozent (o/o) und (B) Methanol-Wasser (50:50) hergestellt; dann war der Mischer Ameisensäure 0,1 Prozent (o/v). Die Autosampler-Nadel wurde vor und nach dem Ansaugen der Probe mit Methanol gespült. Die Analysen wurden dreifach durchgeführt.

3.6. Gesamtphenolgehalt (TPC)

Der Gesamtphenolgehalt im Seidenproteinextrakt wurde nach der Folin-Ciocalteu-Methode [30] analysiert. Kurz gesagt wurden 0,3 ml SPE mit 2,25 ml 10-prozentigem Folin-Ciocalteu-Reagenz, gelöst in destilliertem Wasser, gemischt. Nach 5-minütiger Inkubation wurden 2,25 ml einer 6-prozentigen Natriumcarbonatlösung (NazCO) zugegeben und die Mischungen 90 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Extinktion der Lösungsproben wurde bei 725 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen. Die TPC in Bohnen wurde als mg Gallussäureäquivalente (GAE) pro g Trockengewicht (mg GAE/g DW) ausgedrückt. Die Analysen wurden dreifach durchgeführt.

3.7. Gesamtflavonoidgehalt (TFC)

Der Gesamtflavonoidgehalt von SPE wurde nach Kubota und [30] modifiziert bestimmt. Kurz gesagt wurden 0,5 ml jeder Probenlösung mit 2,25 ml destilliertem Wasser und 0,15 ml 5-prozentiger NaNO-Lösung (w/v) gemischt. Die Lösung wurde 6 min lang stehengelassen und dann wurden 0,3 ml 10-prozentiges AlCl3 (w/v) zu der Lösung gegeben. Nach 5 min wurden 0,1 ml 1 M NaOH (w/ø)-Lösung zugegeben und dann wurde die Extinktion bei 510 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen. Die Ergebnisse wurden als mg Rutin-Äquivalente (RE) pro g Trockengewicht (mg RE/g DW) ausgedrückt.

3.8. Radikalfängeraktivität von DPPH

Die antioxidativen Aktivitäten der SPE wurden als Abfangaktivität des stabilen freien Radikals 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) nach Brand-Williams et al.[37] bestimmt. Seidenproteinextrakt 0,1 ml wurde zu 3 ml 0,001 M DPPH in Methanol gegeben. Die Mischung wurde 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die Extinktion wurde bei 517 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers bestimmt. Die Gleichung zur Berechnung der DPPH-Hemmung war wie folgt:

(1) Hemmung (Prozent)=[(Abs. Kontrolle- Abs.Probe)/Abs. Steuerung]×100)

wo die abs. die Probe ist die Extinktion der Probe und Abs. Kontrolle ist die Extinktion der Kontrolle.

3.9.Antioxidans-Aktivität durch ABTS-Assay

Das ABTS-Radikalkationenverfahren von Re et al. (1999) [22] wurde modifiziert, um die Radikalfängerwirkung zu bewerten. Die ATBS-Arbeitslösung wurde hergestellt, indem 7,4 mM ABTS und 2,6 mM Kaliumpersulfat im Verhältnis 1:1 (v/v) kombiniert, 12 h im Dunkeln bei Raumtemperatur reagieren gelassen und dann mit deionisiertem Wasser verdünnt wurden . Die Extinktion wurde bei 734 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers bestimmt, bis sie 1,1 ± 0,02 erreichte. Dann wurden 150 μl der SPE und 2850 μl der ATBS-Arbeitslösung im Dunkeln 2 h unter Mischen umgesetzt und die Extinktion bei 734 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers; 100 Prozent Methanol wurde als Kontrolle verwendet. Die Gleichung zum Berechnen der Hemmung war wie Gleichung (1).

3.10. Eisen(III)-Reduktions-/Antioxidans-Power-Assay (FRAP)

Die Reduktionskraft von Extrakten wurde anhand des FRAP-Assays ermittelt [23]. Das frische FRAP-Reagenz wurde durch Mischen von 100 ml Acetatpuffer (0,3 mol LI, pH 3,6), 10 ml TPTZ-Lösung, gelöst in 10 ml 40 mmol L -1HC, und 10 ml 20 mmol L hergestellt -1FeCl; im Verhältnis 10∶1∶1 und 120 ml destilliertes Wasser bei 37 Grad . Kurz gesagt, 60 &mgr;l SPE und 180 &mgr;l deionisiertes Wasser wurden zu 1,8 ml FRAP-Reagenz gegeben. Die Lösung wurde durch Vortex-Mischen geschüttelt. Nachdem die Lösung 4 min in einem Wasserbad bei 37 Grad inkubiert worden war, wurde die Extinktion bei 593 nm gegen eine Kontrolle gemessen. FRAP-Werte wurden als mg FeSO4 pro g Trockenbasis (mg FeSO4/g DW) angezeigt.

3.11. Inhibitorische Aktivität gegen das Enzym -Amylase

-Amylase-Enzym-Hemmaktivität wurde unter Verwendung des Verfahrens von Xiao et al. (2006)[38] mit leichten Modifikationen. Das Substrat wurde durch 5-minütiges Kochen von 100 mg Kartoffelstärke in 5 ml Phosphatpuffer (pH 7,0) und anschließendes Abkühlen auf Raumtemperatur hergestellt. SPE (50 μl), Substrat (300 μl) und 5 μg/ml Amylaselösung (20 μl) wurden gemischt und die Lösung wurde 15 Minuten lang bei 37 Grad inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 &mgr;l 1 M HCl gestoppt, und dann wurden 50 &mgr;l Jodlösung zugegeben. Die Extinktion wurde bei 650 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Acarbose wurde als positive Kontrolle verwendet. Der Hemmungsprozentsatz von x-Amylase wurde als Gleichung (1) bestimmt.

3.12. Inhibitorische Aktivität gegen das Enzym Glucosidase

Der -Glucosidase-Enzym-Hemmtest wurde nach dem Verfahren von Wang und Zhao[39].SPE (2 ml gelöst in Dimethylsulfoxid; DMSO) und 0,5 U/ml a-Glucosidase(40) ​​durchgeführt. ml) wurden in 12 0 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gemischt. Nach 5-minütiger Vorinkubation wurde 5 mM p-Nitrophenyl- --D-glucopyranosid-Lösung (40 ml) zugegeben, und die Lösung wurde 30 min lang bei 37 Grad inkubiert. Die Absorption wurde bei 405 nm mit einem UV/Vis-Absorptionsspektrophotometer-Mikroplattenlesegerät gemessen. Der Hemmungsprozentsatz von -Glucosidase wurde als Gleichung (1) bestimmt.

3.13. Bewertung der Anti-AGEs-Bildungsaktivität

Die Hemmkapazitäten der AGE-Bildung des Seidenproteins und seiner Fraktionen wurden unter Verwendung der Methode von Vinson und Howard [40] gemessen. Das Gesamtvolumen der Glykationsreaktionslösung (2,5 ml) wurde durch Mischen von 5{{10}}0 μl SPE, 500 μl 20 mg/ml BSA in Phosphatpuffer und 500 μl 0,5 M Glucose hergestellt Phosphatpuffer und 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,4, enthaltend 0,02 Prozent (w/v) Natriumazid. Diese Mischung wurde bei 37 Grad für 5 Tage im Dunkeln inkubiert und dann wurde die Anzahl der gebildeten fluoreszierenden AGEs unter Verwendung eines Fluoreszenzspektrometers mit einer Anregungswellenlänge von 330 nm und einer Emissionswellenlänge von 410 nm bestimmt. Der Prozentsatz der Bildung von Anti-AGEs wurde basierend auf der resultierenden Fluoreszenzintensität (FI) unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet: (2) n =[1-(FI-Probe - FI-Probe leer)/(Kontrolle-Kontroll-Leerprobe). )]×100 wobei FlProbe die Fluoreszenzintensität der Probe ist, Probenleerwert die Fluoreszenzintensität des Probenleerwerts ist, Kontrolle die Fluoreszenzintensität der Kontrolle ist und FIKontrollleerwert die Fluoreszenzintensität des Probenkontrollleerwerts ist.

3.14. Statistische Analyse

Alle Daten wurden mit der SPSS-Software (IBM SPSS, Chicago, IL, USA) analysiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von drei Wiederholungen angegeben, und die Daten wurden unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Test der geringsten signifikanten Differenz (LSD) analysiert, um die Signifikanz relativ zur Kontrolle und die Pearson-Korrelation zu bestimmen Test zur Beurteilung der Korrelationen zwischen den Mittelwerten. In allen Fällen, S<0.05 was="" considered="">

4. Schlussfolgerung

Unsere Studie über die Auswirkungen der Extraktion von Seidenprotein umfasste eine sechsstündige Extraktion mit destilliertem Wasser bei 100 Grad; Dieses Verfahren lieferte die höchsten Werte für Proteingehalt, Aminosäuren, Gesamtphenolgehalt (TPC), Gesamtflavonoidgehalt (TFC), DPPH-Radikalfängeraktivität, ABTS-Radikalfängerkapazitätsassay, FRAP-Assay, Anti- -amylase, Anti-a-Glucosidase und Antiglykation im Vergleich zu anderen Extraktionszeiten. Darüber hinaus lieferte die SPE der Nangsew-Stämme im Vergleich zu den Extrakten der Eri-Stämme einen höheren Gehalt an all diesen ernährungsphysiologisch vorteilhaften Substanzen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Nangsew die bevorzugten Stämme für unsere laufenden Pläne zur Entwicklung eines natürlichen Zusatzstoffs für funktionelle Lebensmittel auf der Basis von Sericin wären, das während der Kokonbehandlung extrahiert wird, was Möglichkeiten für eine Alternative bei der Herstellung von funktionellen Getränken bietet.

Autorenbeiträge:Konzeptualisierung, CBand SS; Methodik, CBand SS; Validierung, CBand SS; Formale Analyse, CBand SS; Untersuchung, CBand SS; Schreiben – Vorbereitung des Originalentwurfs, CBand SS; Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, CBand SS; Visualisierung, CBandS.S. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und sind damit einverstanden.

Finanzierung:Diese Forschung wurde von Thailand Science Research and Innovation (TSRI) und Siam Natural Products Co., Ltd. finanziert.

Erklärung des Institutional Review Board:Unzutreffend.

Einverständniserklärung:Unzutreffend. Erklärung zur Datenverfügbarkeit: Nicht zutreffend.

Danksagungen:Das Laboratory Equipment Center der Mahasarakham University hat für die Zusammenarbeit und wissenschaftliche Hilfestellung gesorgt. Dank auch an Colin Wrigley, University of Queensland, Australien, für das englische Korrekturlesen.

Interessenskonflikte:Die Autoren geben keinen Interessenkonflikt an.

Dieser Artikel ist ein Auszug aus Molecules 2021, 26, 2033. https://doi.org/10.3390/molecules26072033 https://www.mdpi.com/journal/molecules