Charakterisierung von Caffeoylchinasäuren aus Lepisorus Thunbergianus und ihrer hemmenden Aktivität auf die Melanogenese

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hak Hyun Kim, Jae Kwon Kim, Jaehyun Kim, Se-Hui Jung* und Kooyeon Lee*

ABSTRAKT:Hyperpigmentierung, die aus der Überaktivierung von Tyrosinase resultiert, führt zu dunkleren Flecken oder Flecken auf der menschlichen Haut. Obwohl diese Phänomene harmlos sind, besteht immer noch eine große Nachfrage nach Melanogenese-Inhibitoren, um eine Hyperpigmentierung durch Hemmung der Tyrosinase, eines geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms bei der Melanogenese, zu verhindern. Obwohl Lepisorus thunbergianus in Volksheilmitteln als diuretisches und blutstillendes Mittel verwendet wurde, wurde seine Wirkung auf die Melanogenese noch nicht berichtet. In dieser Studie haben wir einen L.thunbergianus-Extrakt und seine Lösungsmittelfraktionen hergestellt und ihre biologische Aktivität gegen freie Radikale und die Melaninsynthese bewertet. Der Extrakt von L. thunbergianus hemmte die Pilz-Tyrosinase-Aktivität effizienter als und mit ähnlicher antioxidativer Aktivität wie Arbutin in vitro. Die vergleichende Bewertung der Anti-Melanogenese- und Anti-Tyrosinase-Aktivität von L. thunbergianus-Lösungsmittelfraktionen zeigte, dass die Butanol-Fraktion durch Hemmung der Tyrosinase-Aktivität das höchste Potenzial für die Hemmung der Melanogenese in Melanomzellen hat. Wir fanden durch Strukturanalyse unter Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und NMR-Spektroskopie, dass die Hauptverbindungen in der Butanolfraktion drei Caffeoylchininsäurederivate waren. Die drei Derivate hatten ähnliche Radikalfänger- und Anti-Tyrosinase-Aktivitäten in vitro, während nur 5--Caffeoylchinasäure eine hemmende Wirkung auf die -MSH-induzierte Melanogenese hatte. Die Hemmwirkung von 5--Caffeoylchininsäure wurde durch die Bestimmung des Melaningehalts und der Tyrosinaseaktivität in Melanomen nach Behandlung der Zellen mit einer handelsüblichen Verbindung verifiziert. Außerdem zeigten wir, dass 5--Caffeoylchinasäure die Melanogenese hemmte, indem sie ein Kupferkation aus einem Kupfer-Tyrosinase-Komplex chelatisierte. Daher könnte die aus L. thunbergianus isolierte 5--Caffeoylchinasäure oder Butanolfraktion in der Kosmetik als Hautaufheller nützlich sein.

Cistanche tubulosa: der Hautaufheller.

INTRODUCTION

Melanin, eine Gruppe natürlicher Pigmente, die in den meisten Organismen vorkommt, spielt eine wichtige Rolle bei der Bräunung von Früchten, Pilzen und Gemüse und der Pigmentierung der menschlichen Haut.1 Melanin wird aus der Aminosäure Tyrosin in einem mehrstufigen Prozess hergestellt, der enzymatische Oxidation und Polymerisation umfasst. 2 Beim Menschen wird das Melaninpigment von spezialisierten Melanozyten der dendritischen Zellen synthetisiert, die sich an der Verbindungsstelle zwischen Epidermis und Dermis befinden, in denen die Synthese durch Einwirkung von ultravioletten (UV) Strahlen initiiert wird.3 Das Melaninpigment wird zu den Keratinozyten transportiert, um die Haut vor UV-Strahlen und freien Radikalen zu schützen; Daher wird die Hautfarbe durch das Verteilungsmuster des Melaninpigments bestimmt.2 Eine Dysregulation der Melaninsynthese führt zu vielen Formen der Hyperpigmentierung, wie Melasma, Sommersprossen, Altersflecken, Lentigo, postinflammatorischer Hyperpigmentierung und anderen Hyperpigmentierungssyndromen.4 Mehr als a hundert Proteine ​​sind mit der Melaninsynthese verwandt, und unter ihnen ist die Tyrosinase das geschwindigkeitsbestimmende Enzym, das als verantwortlich für die Formalaninsynthese anerkannt ist.5 Daher konzentrieren sich die meisten Forschungsarbeiten zur Verhinderung von Hyperpigmentierung auf die Identifizierung, Isolierung, Synthese und Charakterisierung neuer potenter Wirkstoffe Tyrosinase-Inhibitoren zur Verhinderung der Melanogenese.1,6 Eine Reihe von Tyrosinase-Inhibitoren wie Kojisäure, Arbutin, Hydrochinon, Azelainsäure, Ellagsäure und Tranexamsäure werden in der Kosmetikindustrie allgemein als Anti-Melanogenesemittel verwendet; Aufgrund der Beschränkungen chemischer Medikamente, zu denen Zytotoxizität und Nebenwirkungen gehören, besteht jedoch immer noch Bedarf an neuen Materialien mit verbesserter Sicherheit, Stabilität und Wirksamkeit.7

Naturprodukte, einschließlich Pflanzen, Bakterien und Pilze, sind aufgrund ihrer geringeren Toxizität und besseren Biokompatibilität und Bioverfügbarkeit zu alternativen Quellen für die Entdeckung wirksamer hautaufhellender Inhaltsstoffe geworden.1,8 Lepisorus thunbergianus ist ein Farn, der zu den Polypodiaceae gehört und an alten Felsen wächst oder die Rinde von Bäumen und ist in den gemäßigten Regionen Ostasiens wie Korea, Japan, China, den Philippinen und Indochina verbreitet. L. thunbergianus wurde in koreanischen Volksheilmitteln als harntreibendes, blutstillendes und hustenstillendes Mittel verwendet. Frühere Studien berichteten, dass ein L. thunbergianus-Extrakt eine topische Anti-Lipid-Peroxidationsaktivität in lokaler und antioxidativer Aktivität aufweist.9 Darüber hinaus zeigte der L. thunbergianus-Extrakt eine signifikante konzentrationsabhängige Wachstumshemmung bei Mundkrebs- und Dickdarmkrebszellen.10 Der L. thunbergianus-Extrakt könnte potenzielle Anwendungen haben in der Kosmetikindustrie, da diese Pflanze verschiedene Flavonoidverbindungen und zahlreiche bioaktive Moleküle enthält, darunter Quercetin 3--Methylether-Glucosid, Vitexin, Oriental, Periodical-Glucosid, Isovitexin, Orientin, Corentin und Caffeoylchinicacid.9a Die Wirkungen der L. thunbergianus-Extrakt zur Melaninsynthese in Melanozyten muss noch aufgeklärt werden.

Abbildung 1. Analyse des L. thunbergianus-Extrakts auf (A) ABTS-Radikalfang-, (B) Anti-Tyrosinase- und (C) intrazelluläre ROS-Abfangaktivitäten

In dieser Studie haben wir den L. thunbergianus-Extrakt und seine Lösungsmittelfraktionen durch serielle Fraktionierung hergestellt und die hemmenden Wirkungen der Lösungsmittelfraktionen auf die Melaninbiosynthese in B16F10-Melanomzellen untersucht. Wir identifizierten die Butanol (n-BuOH)-Fraktion als Hauptanteil, der den natürlichen Inhibitor enthält, und charakterisierten weiter die Wirkungen von Caffeoylchinasäure-Derivaten, die aus den L. thunbergianus-Extrakten isoliert wurden, auf die Hemmung der Melanin-Biosynthese.

Cistanche Bewertung: Antioxidation

RESULTATE UND DISKUSSION

Ethanolextrakt aus L. thunbergianus fängt das 2,2′-Azinobis(3-ethyl-benzothiazolin-6-sulfonsäure (ABTS)-Radikal ab und hemmt die Tyrosinase-Aktivität.

Die Extraktion von L. Thunbergianus mit 70 Prozent Ethanol (EtOH) wurde durchgeführt, um die potentielle hemmende Aktivität natürlicher Verbindungen in der Pflanze zu bewerten. Die Radikalfängeraktivität des L.thunbergianus-Extrakts wurde im Konzentrationsbereich von 2–200 μg/mL bestimmt. Der Ethanolextrakt zeigte eine konzentrationsabhängige Radikalfängeraktivität mit einer maximalen Wirkung bei 50 ug/ml, wobei das Ergebnis mit dem von Arbutin übereinstimmte, das als Positivkontrolle verwendet wurde (Fig. 1A).

Wir bewerteten auch die hemmende Wirkung des Extrakts auf die Pilz-Tyrosinase-Aktivität, indem wir die Rate der durch Tyrosinase katalysierten Dopachrom-Synthese maßen. Der Ethanolextrakt hemmte 87 Prozent der Tyrosinase-Aktivität bei 500 ug/ml, während Arbutin nur 38 Prozent der Tyrosinase-Aktivität bei derselben Konzentration hemmte (Abbildung 1B). Dann bewerteten wir die Abfangaktivität des Extrakts auf intrazelluläres ROS, erhöht durch 100 μM Wasserstoffperoxid. Die Behandlung mit Wasserstoffperoxid induzierte einen ungefähr 2,1--fachen Anstieg des intrazellulären ROS-Spiegels von B16F10-Zellen (Abbildung 1C). Wir fanden heraus, dass der Wasserstoffperoxid-vermittelte Anstieg der intrazellulären ROS dosisabhängig vom Extrakt abgefangen wurde: Die maximale Abfangaktivität bei 100 ug/ml betrug 78 Prozent (Abbildung 1C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Ethanolextrakt von L. thunbergianus bioaktive Inhaltsstoffe enthält, die die Tyrosinaseaktivität hemmen sowie ABTS-Radikale und intrazelluläre ROS abfangen.

Cistanche Deserticola-Extrakt: hemmt die Tyrosinase-Aktivität.

Hemmpotential von L. thunbergianus-Fraktionen gegen Melanogenese.

A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >CH2Cl2 > Hex, was mit dem vorherigen Bericht übereinstimmt.10b Darüber hinaus stiegen die inhibitorischen Wirkungen verschiedener Lösungsmittelfraktionen auf die Tyrosinase-Aktivität konzentrationsabhängig an: Die maximalen inhibitorischen Aktivitäten von n-Hex- und CH2Cl2-Fraktionen lagen unter 65 Prozent, aber die von EtOAc und n-BuOH-Fraktionen waren über 70 Prozent (Abbildung 2B). Die Hemmaktivität lag in der Reihenfolge n-BuOH > EtOAc > CH2Cl2 > n-Hex. Diese Ergebnisse legen nahe, dass hydrophilere Fraktionen, einschließlich n-BuOH- und EtOAc-Fraktionen, eine höhere Radikalfängeraktivität und eine bessere Hemmaktivität zeigten als die lipophilen n-Hex- und CH2Cl2-Fraktionen .

Als nächstes wurden die Wirkungen der L. thunbergianus-Lösungsmittelfraktionen auf die Proliferation von Melanomzellen untersucht, indem B16F10-Zellen mit jeweils 200 ug/ml der verschiedenen Fraktionen oder 2 mg/ml Arbutin behandelt wurden Vorhandensein eines -Melanozyten-stimulierenden Hormons ( -MSH), von dem bekannt ist, dass es die Melanogenese durch Mikrophthalmie-assoziierte Transkriptionsfaktor (MITF)-Induktion fördert.11 Die Ergebnisse zeigten, dass keine der Fraktionen eine signifikante Wirkung auf die Proliferation von Melanomzellen hatte (Abbildung 2C). Wir untersuchten dann die inhibitorische Wirkung der Lösungsmittelfraktionen auf die durch -MSH stimulierte Melanogenese in Melanomzellen. Die Behandlung mit -MSH induzierte einen etwa 2,0--fachen Anstieg des intrazellulären Melaningehalts von B16F10-Zellen (Abbildung 2D). Wir fanden heraus, dass die -MSH-vermittelte Melanogenese vollständig durch die n-BuOH-Fraktion (p < 0,01)="" und="" teilweise="" durch="" die="" etoac-fraktion="" (40="" prozent,="" p="">< 0,01)="" gehemmt="" wurde,="" während="" die="" -msh-vermittelte="" melanogenese="" durch="" n-hex="" nicht="" signifikant="" verändert="" wurde="" und="" ch2cl2-fraktionen="" (abbildung="" 2d).="" ferner="" wurden="" die="" hemmenden="" wirkungen="" von="" lösungsmittelfraktionen="" auf="" die="" durch="" -msh="" vermittelte="" tyrosinaseaktivierung="" bestimmt,="" da="" tyrosinase="" eine="" schlüsselrolle="" bei="" der="" melanogenese="" spielt="" durch="" -msh,="" während="" n-hex-="" und="" ch2cl2-fraktionen="" dies="" nicht="" taten,="" wie="" in="" abbildung="" 2e="" gezeigt.="" darüber="" hinaus="" wurde="" der="" abfangende="" effekt="" verschiedener="" lösungsmittelfraktionen="" auf="" den="" intrazellulären="" ros-anstieg="" durch="" wasserstoffperoxid="" stimuliert.="" alle="" lösungsmittelfraktionen="" kehrten="" den="" durch="" wasserstoffperoxid="" vermittelten="" intrazellulären="" ros-anstieg="" um,="" wie="" in="" abbildung="" 2f="" gezeigt.="" diese="" ergebnisse="" zeigen,="" dass="" die="" buoh-fraktion="" von="" l.="" thunbergianus="" die="" -msh-induzierte="" melaninsynthese="" durch="" hemmung="" der="" intrazellulären="" tyrosinase-aktivität="" in="" b16f10-zellen="" hemmte.="" darüber="" hinaus="" legen="" diese="" ergebnisse="" nahe,="" dass="" die="" bioaktiven="" inhaltsstoffe,="" die="" die="" melaninsynthese="" hemmen,="" hydrophil="" waren="" und="" hauptsächlich="" in="" der="" n-buoh-fraktion="" gefunden="">

Abbildung 2. Wirkungen von Lösungsmittelfraktionen auf ABTS-Radikalfänger-, Anti-Tyrosinase- und Anti-Melanogenese-Aktivitäten.

Identifizierung und Charakterisierung bioaktiver Verbindungen des L. thunbergianus-Extrakts.

Um Inhaltsstoffe zu identifizieren und zu charakterisieren, die die Melanogenese hemmen, wurde eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Analyse für alle Lösungsmittelfraktionen durchgeführt. Die HPLC-Analyse der Lösungsmittelfraktionen ergab, dass alle Fraktionen drei Hauptverbindungen bei Retentionszeiten von 21, 28 und 29 min für die Verbindungen 1, 2 bzw. 3 enthalten (Abbildung 3A–D). Diese drei Hauptverbindungen wurden durch präparative HPLC-Reinigung weiter isoliert. Die Mengen der drei Hauptverbindungen in der n-BuOH-Fraktion wurden unter Verwendung handelsüblicher Caffeoylchinasäure-Derivate als interne Standardmoleküle gemäß dem vorherigen Bericht bestimmt.12

Die isolierten Verbindungen wurden dann durch Vergleich ihrer 1H- und 13C-NMR-Daten mit der Literatur identifiziert und stimmten mit den vorgeschlagenen Strukturen überein (Abbildung 4).13 Abbildung 3E zeigt die Molekülstruktur der drei Verbindungen. Verbindung 1 (Ausbeute 3,2 ± 0,1 mg/100 mg n-BuOH-Fraktion) wurde als blassgelbes Pulver erhalten. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,66 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,49 (1H, d, J=15,9 Hz), 7,04 (1H, s), 6,99 ( 1H, d, J=8,2 Hz), 6,78 (1H, d, J=8,1 Hz), 6,23 (1H, d, J=15,9 Hz), 5,20( 1H, m), 5,08 (1H, brs), 4,89 (1H, brs) 4,13 (1H, m), 3,84 (1H, m), 3,56 (1H, s), 3,35 (1H, s), 1,99 (1H, m), 1,92 (1H, m), 1,89 (1H, m), 1,79 (1H, m). 13C{1H}-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (176,42, 168,10, 148,14, 145,53, 144,75, 125,65, 121,07, 115,75, 114,71, 114,22, 72,88, 71,01, 70,29, 6). Verbindung 1 wurde durch NMR-Analyse und durch Vergleich mit der vorherigen Literatur als 3--Caffeoylchinasäure identifiziert.13b

Verbindung 2 (Ausbeute 14,1 ± 0,1 mg/100 mg n-BuOH-Fraktion) wurde als blassgelbes Pulver erhalten. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,64 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,52 (1H,d, J=15,9 Hz), 7,06 (1H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8,1 Hz) 6,79 (1H, d, J=7,9 Hz), 6,30 (1H, d, J=15,9 Hz), 4,85 ( 1H, brs), 4,70 (1H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1H, brs), 3,95 (1H, m), 1,97 (2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H}-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (176,02, 166,27, 148,28, 145,55, 144,77, 125,54, 121,19, 115,76, 114,68, 114,57, 76,66, 73,92, 66,31, 40). Verbindung 2 wurde durch NMR-Analyse und durch Vergleich mit der früheren Literatur als 5-Caffeoylchinasäure identifiziert.13c

Verbindung 3 (Ausbeute 3,9 ± 0,2 mg/100 mg n-BuOH-Fraktion) wurde als blassgelbes Pulver erhalten. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,64 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,52 (1H,d, J=15,9 Hz), 7,06 (1H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8,1 Hz) 6,79 (1H, d, J=7,9 Hz), 6,30 (1H, d, J=15,9 Hz), 4,85 ( 1H, brs), 4,70 (1H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1H, brs), 3,95 (1H, m), 1,97 (2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H}-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (176,02, 166,27, 148,28, 145,55, 144,77, 125,54, 121,19, 115,76, 114,68, 114,57, 76,66, 73,92, 66,31, 40). Verbindung 3 wurde durch NMR-Analyse und durch Vergleich mit der früheren Literatur als 4-Caffeoylchinasäure identifiziert.13a

Abbildung 3. HPLC-Chromatogramme von (A) n-Hex-, (B) CH2Cl2-, (C) EtOAc- und (D) n-BuOH-Fraktionen von L. thunbergianus und (E) Struktur der drei Hauptverbindungen.

Hemmpotential von aus L. thunbergianus isolierten Caffeoylchinasäurederivaten gegen Melanogenese.

Um den biologisch aktiven Inhaltsstoff zu identifizieren, der der potenten Anti-Melanogenese zugrunde liegt, bestimmten wir als Nächstes die inhibitorische Aktivität der drei aus L. thunbergianus isolierten Caffeoylchinasäure-Derivate gegen die Melaninsynthese in Melanomzellen. Zunächst wurden die Wirkungen der drei Derivate auf den Radikalfänger von ABTS untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die drei Derivate ähnliche ABTS-Radikalfängeraktivitäten hatten (Fig. 5A). Wir untersuchten dann die inhibitorische Wirkung der drei Derivate, die aus der Ontyrosinase-Aktivität von L. thunbergianus isoliert wurden. Die drei Derivate zeigten eine konzentrationsabhängige Hemmung der Tyrosinaseaktivität, mit maximaler Hemmung bei einer Konzentration von 200 μM ( 5B ). Ferner untersuchten wir die hemmende Wirkung der drei Derivate auf die -MSH-induzierte Melaninsynthese in B16F10-Zellen. Die Behandlung mit -MSH induzierte einen etwa 2,0--fachen Anstieg des intrazellulären Melaningehalts von B16F10-Zellen (Abbildung 5C). Interessanterweise erhöhten die Verbindungen 1 (3-Caffeoylchininsäure) und 3 (4-Caffeoylchininsäure) die Melaninsynthese signifikant um 25 bzw. 23 Prozent (Abbildung 5C, S< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">

Abbildung 4. 1H-NMR-Spektren von (A) 3--Caffeoylchinasäure, (B) 4--Caffeoylchinasäure und (C) 5--Caffeoylchinasäure und 13C-NMR-Spektren von (D) {{ 6}}Caffeoylchinasäure, (E) 4-Caffeoylchinasäure und (F) 5-Caffeoylchinasäure

Verifizierung der Anti-Melanogenese-Wirksamkeit von 5-Caffeoylchinasäure.

Um die hemmende Wirkung von {{0}}-Caffeoylchinasäure auf die Melanogenese zu verifizieren, bestimmten wir die hemmende Wirkung von kommerzieller 5--Caffeoylchinasäure auf die durch -MSH vermittelte Melaninsynthese. Die Behandlung mit niedrigeren Konzentrationen von 0,1 und 0,2 mM 5--Caffeoylchinasäure erhöhte leicht die Melaninsynthese und die intrazelluläre Tyrosinaseaktivität, während höhere Konzentrationen von 0,5 und 1 mm der Verbindung die -MSH-vermittelte Melanogenese umkehrten und intrazelluläre Tyrosinase-Aktivität (Abbildung 6A, B), wobei die Ergebnisse mit dem vorherigen Bericht übereinstimmen.14

Kaffeeoylchinasäure ist eine phenolische Verbindung, die durch die Esterbindung zwischen Kaffeesäure und L-Chinasäure gebildet wird. Es ist bekannt, dass Caffeoylchininsäure-Derivate Anti-Melanogenese- und Anti-Tyrosinase-Aktivitäten sowie ROS-Abfangaktivität aufweisen. Tyrosinase ist ein multifunktionales kupferhaltiges Metalloenzym mit zweiwertigen Kupferkationen.1 Caffeoylchinasäure-Derivate können die Tyrosinaseaktivität hemmen, indem sie ein Kupferkation chelatisieren, das für die Aufrechterhaltung des aktiven Zustands der Tyrosinase verantwortlich ist. Um die Wechselwirkung zwischen 5--Caffeoylchinasäure und Tyrosinase vorherzusagen, wurde eine Computer-molekulare Docking-Studie unter Verwendung des Maestro-Programms durchgeführt. Die beste Pose für die Verbindung, angedockte Totyrosinase, ist in Abbildung 6C, D dargestellt. Die molekulare Docking-Studie ergab, dass 5--Caffeoylchinasäure mit dem Kupferion in einem Abstand von 2,43 Å interagiert und eine Reihe von π-π-Stapelungen mit His etabliert 259, Asn 260, His 85 und His 263 Reste und eine H-Bindung mit Arg 268. Außerdem betrug die Bindungsenergie zwischen Tyrosinase und 5- Caffeoylchinasäure –4,425 kJ/mol. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass 5-Caffeoylchinasäure die Tyrosinase-Aktivität durch Kupferchelation hemmen könnte. Um den hemmenden Mechanismus der Melanogenese durch 5--Caffeoylchininsäure zu verifizieren, bestimmten wir die Kupfer-Chelatisierungsfähigkeit von 5--Caffeoylchinasäure. Die Kupferchelatbildungsfähigkeit von 5--Caffeoylchinasäure wurde konzentrationsabhängig erhöht (Fig. 6E). Dieses Ergebnis legt nahe, dass 5--Caffeoylchinasäure die Melaninsynthese durch Chelatisierung eines mit Tyrosinase wechselwirkenden Kupferkations hemmt.

Abbildung 5. Wirkungen der drei Caffeoylchinasäure-Derivate auf die Radikalfänger-, In-vitro-Anti-Tyrosinase- und Anti-Melanogenese-Aktivität in B16F10-Zellen.

MATERIALEN UND METHODEN

Materialien

L. thunbergianus wurde vom Onlinemarkt www.jirisangol.com (Korea) gekauft und vor der Verwendung in dieser Studie unter Umgebungsbedingungen getrocknet. Reagenzien wie 2,2′-Zinkbis(3-ethyl-benzothiazolin-6-sulfonsäure (ABTS) und 3-(4,5-dimethylthiazol-2- yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT), ein -Melanozyten-stimulierendes Hormon (-MSH) und Enzyme wie Pilztyrosinase wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) Kaliumpersulfat (K2S2O8), Brenzkatechinviolett und 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin (L-DOPA) wurden von Alfa Aesar (Haverhill, MA, USA) gekauft.

Extraktion und Fraktionierung von L. thunbergianus.

Getrockneter L. thunbergianus (80 g) wurde unter Verwendung eines Pulverisators (HBL-3500S, Samyang Electronics, Korea) pulverisiert und dreimal mit 70 Prozent EtOH (jeweils 800 ml) extrahiert ) bei 70 Grad für 3 Tage. Der erhaltene Extrakt wurde unter Verwendung von Advantec-Filterpapiernr. 1 und 2 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan) hergestellt und unter Verwendung eines Hei-Vap Advantage Rotationsverdampfers (Heidolph, Deutschland) konzentriert, um 17,2 g des EtOH-Rohextrakts zu erhalten. Dieser Rohextrakt wurde in dH2O (180 ml) suspendiert und nacheinander mit Hex, CH2Cl2, EtOAc und n-BuOH fraktioniert, um Hex (1,51 g, 8,8 Prozent), CH2Cl2 (0,88 g, 5,1 Prozent), EtOAc (3,95 g, 23,0 Prozent) und n-BuOH (3,02 g, 17,6 Prozent), wie zuvor beschrieben.15 Die resultierenden Extrakte und Fraktionen wurden gefriergetrocknet und vor der Verwendung bei –80 Grad gelagert.

Bestimmung der ABTS-Aktivität zum Abfangen freier Radikale.

Um die antioxidative Aktivität von L.thunbergianus-Extrakten und seinen Lösungsmittelfraktionen zu bewerten, wurde die ABTS-Radikalfängeraktivität wie zuvor beschrieben bestimmt.16 Um das ABTS-Radikal zu erzeugen, wurden 10 ml 7 mMABTS mit 176 μl 140 mM gemischt Kaliumperoxydisulfat in dH2O versetzt und vor Gebrauch 16 h im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Die ABTS-Radikallösung wurde mit absolutem Methanol verdünnt, um eine Extinktion von nahe 0,7 bei 734 nm zu erhalten. Aliquots von 100 &mgr;L jedes Extrakts oder Fraktionen im angegebenen Konzentrationsbereich von 2–200 &mgr;g/mL wurden zu 100 &mgr;L der verdünnten ABTS-Radikallösung gegeben und für 10 min im Dunkeln bei RT inkubiert. Die Extinktion wurde dann bei 732 nm unter Verwendung eines SpectraMaxM5-Multimode-Mikroplattenlesegeräts (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) gemessen. Die Radikalfängeraktivität von ABTS wurde wie folgt berechnet

ABTS-Radikalfängeraktivität (Prozent) =1−(AProbe/AKontrolle)×100 (1)

In-vitro-Tyrosinase-Hemmung.

Die hemmende Wirkung von L.thunbergianus-Extrakten und ihren Lösungsmittelfraktionen auf die Tyrosinaseaktivität wurde anhand der Menge an Dopachrome bestimmt, die durch die katalytische Reaktion von Tyrosinase synthetisiert wurde.2a,17Kurz gesagt wurden 50 μl jedes Extrakts oder jeder Fraktion im angegebenen Konzentrationsbereich mit 50 μl 50 gemischt U/mL Pilz-Tyrosinase in 50 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 8,1 mM Na2HPO4, 1,2 mM KH2PO4, pH 6,8, 2,7 mMKCl und 138 mM NaCl) in einer 96--Well-Platte und 30 min bei RT inkubiert. Dann wurden 100 &mgr;l 1 mM L-DOPA in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer Inkubation für weitere 10 min bei 37 Grad. Die Extinktion der resultierenden Lösung wurde bei 475 nm unter Verwendung des SpectraMax M5 Multimode-Mikroplattenlesegeräts gemessen.

Zellkultur.

B16F10-Mäuse-Melanomzellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, USA), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (Gibco), 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin (Gibco) bei 37 Grad kultiviert unter befeuchtetem 5 Prozent CO2.

Zellengesundheit.

Die Lebensfähigkeit von B16F10-Zellen wurde unter Verwendung eines MTT-Assays bestimmt, wie zuvor beschrieben.18 Kurz gesagt, B16F10-Zellen wurden in 24--Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen pro Well ausgesät. Nach 24 h wurden die Zellen mit den angegebenen Konzentrationen von L. thunbergianus-Extrakten oder -Fraktionen für 48 h behandelt. Die Zellen wurden dann mit MTT-Lösung für 4 h inkubiert und die reduzierten Formazan-Kristalle wurden in DMSO gelöst. Die resultierende Lösung wurde in 96--Well-Platten überführt, und die Extinktion wurde bei 540 nm unter Verwendung des SpectraMax M5-Multimode-Mikroplatten-Lesegeräts gemessen.

Bestimmung der intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS).

Der intrazelluläre ROS-Spiegel wurde unter Verwendung eines DCF/H2DCFDA-Zell-ROS-Testkits (ab113851, Abcam) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Kurz gesagt wurden B16F10-Zellen in Platten mit 48- Vertiefungen mit einer Dichte von 2 × 10 4 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Nach einer 24-stündigen Kultur wurden die Zellen 1 Stunde lang mit den angegebenen Konzentrationen von L. thunbergianus-Extrakten oder Lösungsmittelfraktionen in 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) enthaltendem Kulturmedium ohne Phenolrot behandelt. Die Zellen wurden dann mit 100 &mgr;M Wasserstoffperoxid für 30 min inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit 25 &mgr;MH 2 DCFDA in PBS für 45 min behandelt. Der ROS-Gehalt wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Synergy H1, Biotek, Vermont, USA) analysiert, das mit einem Fluoreszenzfilter bei 485/545 nm (Anregungs-/Emissionswellenlänge) ausgestattet war. Die durchschnittliche relative Fluoreszenzintensität der Kontrolle wurde mit 100 Prozent gleichgesetzt, wobei die Behandlungsbedingungen proportional berechnet wurden.

Bestimmung des Melaningehalts.

Der Melaningehalt wurde, wie zuvor beschrieben, mit einigen Modifikationen bestimmt.19 Die Melanomzellen wurden in einer Platte mit sechs Vertiefungen für 24 h kultiviert. Sie wurden mit den angegebenen Konzentrationen des L. thunbergianus-Extrakts oder seiner Lösungsmittelfraktionen für weitere 48 h in Gegenwart von 100 nM -MSH behandelt. Gibco) wurden die resultierenden Zellen durch Inkubation mit einer Trypsin-EDTA-Lösung abgelöst. Nach Zentrifugation bei 1000 U/min für 3 min wurde das Zellpellet in 150 &mgr;l 1 M NaOH, enthaltend 10 Prozent DMSO, für 1 h bei 60 Grad für 1 h gelöst. Der Melaningehalt wurde durch die Extinktion bei 405 nm unter Verwendung des Mikroplatten-Lesegeräts bestimmt.

Cistanche-Extrakt hemmt Melanin.

Bestimmung der zellulären Tyrosinaseaktivität in Melanomzellen.

Die Tyrosinaseaktivität in B16F10-Zellen wurde basierend auf der Dopachrommenge untersucht, die durch die katalytische Reaktion von intrazellulärer Tyrosinase produziert wurde.20 Kurz gesagt, Melanomzellen wurden in einer Platte mit sechs Vertiefungen für 24 h kultiviert, gefolgt von einer Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen des L.thunbergianus-Extrakts oder seines Lösungsmittels Fraktionen für weitere 48 h in Anwesenheit von 100 nM -MSH. Nach zweimaligem Waschen mit eiskaltem D-PBS wurden die Zellen in 200 &mgr;l Radioimmunopräzipitationsassay (RIPA)-Puffer (Sigma-Aldrich), der Protease- und Phosphatase-Inhibitoren enthielt, lysiert. Nach 15-minütiger Zentrifugation des aus jeder Vertiefung gesammelten Zelllysats bei 15,000g wurden 100 μl des Überstands mit 100 μl 1 mM L-DOPA in PBS (pH 6,8) gemischt, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad . Die Extinktion von Dopachrom wurde bei 475 nm unter Verwendung des Mikroplattenlesegeräts gemessen. Die Daten wurden mit der durch den Bicinchoninsäure-Assay bestimmten Proteinkonzentration normalisiert.

Isolierung und Charakterisierung bioaktiver Verbindungen mittels HPLC.

HPLC wurde auf YL{{0}} (Young Lin Instrument, Korea), ausgestattet mit einer TC-C18-Säule (4,6 mm, 250 mm und 5 μm, Agilent, USA), in Verbindung durchgeführt mit einem Gradientensystem bestehend aus Lösungsmittel A (0,2 % Ameisensäure) und Lösungsmittel B (MeOH). Das Steigungslösungsmittelverhältnis wurde auf 0 –5 min, 15 Prozent B; 5−10 min, 15−20 Prozent B; 10-15 min, 20-30 Prozent B; 15-30 min, 30-40 Prozent B; 30-37 min, 40-60 Prozent B; 37–40 min, 60–100 Prozent B; 40-45 min, 100 Prozent B; 45–50 Minuten, 100–15 Prozent B; und 50–55 min, 15 Prozent B. Um die Inhaltsstoffe in Lösungsmittelfraktionen zu identifizieren, wurde die mobile Phase mit einer Flussrate von 1 ml/min zugeführt, und die Elutionsdetektion wurde bei 330 nm durchgeführt. Um die insolventen Fraktionen der bioaktiven Bestandteile zu sammeln, wurde die mobile Phase mit einer Flussrate von 15,0 ml/min zugeführt, und der Nachweis der Elution wurde bei 330 nm unter Verwendung von präp-HPLC (YL-9100 s, Young Lin Instrument, Korea) durchgeführt ), ausgestattet mit einer Prep-C18-Säule (4,6 mm, 212 mm, 10 μm, Agilent, USA), in Verbindung mit einem Gradientensystem aus Lösungsmittel A (0,2 Prozent Ameisensäure) und Lösungsmittel B (MeOH). Das Slope-Lösungsmittelverhältnis wurde auf 0–10 min, 10 Prozent B; 10–20 min, 10–15 Prozent B; 20-40 min, 15 Prozent B; 40-60 min, 15-20 Prozent B; und 60-70 min, 30 Prozent B.

Molekulare Modellierung.

Die Kristallstruktur von Pilztyrosinase für die molekulare Modellierung war eine Agaricustyrosinase (PDB does: 2Y9X), die von der Protein DataBank (PDB) erhalten wurde. Das Enzym wurde unter Verwendung des in das Maestro-Programm eingebetteten Proteinwizard-Vorbereitungsworkflows (Maestro, Version 11.9.011, Schrödinger, LLC, New York, NY, USA, 2019) hergestellt. Wasser und alle anderen in den PDB-Dateien vorhandenen Moleküle wurden entfernt. Molekulares Docking wurde unter Verwendung des Induced Fit Docking (IFD)-Protokolls (Schrödinger Suite 2019 Induced Fit Docking Protocol) durchgeführt, wie zuvor berichtet.21

Fähigkeit zur Chelatisierung von Kupfer.

Die Kupferchelatisierungsfähigkeit der aus L. thunbergianus isolierten Verbindungen wurde gemäß dem vorherigen Bericht bestimmt.22 Jedes Caffeoylchinasäure-Derivat (10 μl) in der angegebenen Konzentration wurde mit 280 μl 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 6,0) gemischt, 6 μL einer 4 mM Pyrocatechol-Violett-Lösung, die im gleichen Puffer hergestellt wurde, und 10 μL von 1 μL CuSO4·5H2O. Das Verschwinden der blauen Farbe wurde durch Messen der Extinktion bei 632 nm unter Verwendung des SpectraMax M5 Multimode-Mikroplattenlesegeräts beobachtet. Wasser wurde als Kontrolle anstelle einer Probe verwendet. Die prozentuale Kupferchelatbildungsaktivität wurde aus der Extinktion bei 632 nm berechnet, die wie folgt ist

Kupferchelatbildungsfähigkeit (Prozent)=1− (Eine Probe/Eine Kontrolle)×100 (2)

Statistische Analyse.

Alle Daten in dieser Studie wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Die Unterschiede zwischen den Mittelwerten der Kontroll- und der exponierten Gruppen wurden unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Dunnett's Post-Hoc-Test, analysiert. Der Schwellenwert für die statistische Signifikanz für alle Analysen war p < 0,05="">

SCHLUSSFOLGERUNGEN

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die L. thunbergianus-Extrakte ABTS-Radikale abfangen und eine starke hemmende Wirkung auf die Melanin-Biosynthese ohne signifikante Zytotoxizität aufweisen. Ein bioaktiver Inhaltsstoff, der in L. thunbergianus vorkommt und die Melanogenese hemmt, wurde in der n-BuOH-Fraktion isoliert. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die drei Caffeoylchinasäure-Derivate Hauptverbindungen sind, die in der n-BuOH-Fraktion vorkommen, und dass 5--Caffeoylchinasäure ein wichtiger Inhaltsstoff dafür ist Unterdrückung der Melanogenese in Melanomzellen durch Hemmung der zellulären Tyrosinaseaktivität. Hier isolierten wir einen natürlichen Inhibitor der Verbindung 5- Caffeoylchininsäure aus dem L.thunbergianus-Extrakt, um Hyperpigmentierung zu verhindern, und deckten seinen Hemmungsmechanismus auf, der der Melanogenese zugrunde liegt. Daher legen unsere Ergebnisse nahe, dass 5-Caffeoylchinasäure und die aus L. thunbergianus isolierte n-BuOH-Fraktion in Kosmetika als Hautaufhellungsmittel nützlich sein könnten.

Cistanche-Scheiben