Abstrakt
Hintergrund:Die Verarbeitung chinesischer Materia Medica ist eine herausragende und einzigartige pharmazeutische Technik in der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM), die zur Reduzierung von Nebenwirkungen und zur Steigerung oder sogar Veränderung der therapeutischen Wirksamkeit roher Kräuter eingesetzt wird. Für die gesteigerte Wirksamkeit von Heilpflanzen sind in erster Linie Veränderungen der wesentlichen Bestandteile verantwortlich, die durch einen optimierten Verarbeitungsprozess hervorgerufen werden. Die Nieren-Yang-belebende Wirkung von mit Reiswein gedämpftem Cistancha deserticola (C. deserticola) war stärker als bei rohem C. deserticola (CD).
Methoden:Um den Einfluss der Verarbeitung zu ermitteln, wurde eine Vergleichsanalyse mit dem UPLC-Q-TOF-MSE mit der UNIFI-Informatikplattform durchgeführt. Zur Charakterisierung von Bestandteilen und Metaboliten in vivo wurden In-vitro-Studien durchgeführt. Die chemischen Bestandteile wurden in CD und seinen verarbeiteten Produkten bestimmt. Die multivariaten statistischen Analysen wurden durchgeführt, um Variationen zwischen ihnen zu bewerten, während OPLS-DA für den paarweisen Vergleich verwendet wurde.
Ergebnisse:Die Ergebnisse dieser Studie zeigten erhebliche Unterschiede bei Phenylethanoidglykosiden (PhGs) und Iridoiden nach der Verarbeitung. In den Extrakten von CD und seinem verarbeiteten Produkt wurden insgesamt 97 Verbindungen nachgewiesen. PhGs mit der 4'-O-Cafeoylgruppe im 8-O- -d-Glucopyranosyl-Teil, wie Acteosid, Cistanosid C, Campneosid II, Osmanthusid, nahmen nach der Verarbeitung ab, während PhGs mit der 6'- Die O-Cafeoyl-Gruppe im 8-O- -d-Glucopyranosyl-Teil, wie Isoacetosid, Isocistanosid C, Isocampneosid I, Isomartynosid, nahm zu, insbesondere in der CD-NP-Gruppe. Die Intensität von Echinacosid und Cistanosid B, deren Struktur eine 6'-O- -d-Glucopyranosyl-Einheit besitzt, nahm ebenfalls zu. In einer In-vivo-Studie wurden 10 Prototypkomponenten und 44 Metaboliten im Plasma, Kot und Urin von Ratten nachgewiesen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die Verarbeitung zu erheblichen Variationen in den chemischen Bestandteilen von CD führt und die Disposition der Verbindungen in vivo beeinflusst. Phase-II-Stoffwechselprozesse sind die Schlüsselkaskaden jeder Verbindung und die meisten Metaboliten sind mit Echinacosid oder Acetonid verbunden.
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Schlussfolgerungen:Dies ist die erste weltweite Vergleichsstudie zu rohen und verarbeiteten CDs. Diese Ergebnisse tragen zu unserem Verständnis der Auswirkungen der CD-Verarbeitung bei und liefern wichtige Daten für zukünftige Wirksamkeitsuntersuchungen.
Schlüsselwörter:Cistanche deserticola, Verarbeitung, UPLC-Q-TOF-MSE, chemische Profile, Metaboliten in vivo
Einführung
Die Verarbeitung chinesischer Materia Medica (CMM) hat eine erhebliche Anwendbarkeit in der klinischen Praxis der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) gezeigt und gilt seit mehreren Jahrhunderten als praktikable Behandlung. Dabei handelt es sich um eine einzigartige pharmazeutische Technologie, die aus der Theorie der TCM abgeleitet wurde. Bei der folgenden Verarbeitung wurden erhebliche Unterschiede im Aussehen, in den chemischen Bestandteilen, in den Eigenschaften und in der medizinischen Bedeutung aller Arten von TCM festgestellt, was zu der Annahme führte, dass die Verarbeitung die Wirksamkeit verbessern oder die toxischen Wirkungen der TCM verringern könnte.
Seit Hunderten von Jahren wird Cistanche deserticola (Roucongrong auf Chinesisch, CD) in der klinischen TCM-Praxis häufig zur Ergänzung der Nierenfunktionen eingesetzt. Es hilft auch bei der Befeuchtung des Darms, was zu einer Entspannung des Darms führt [1]. Cistanche wurde erstmals in ShenNongBencaoJing aufgenommen. Es kommt häufig in trockenen und halbtrockenen Lebensräumen in Eurasien und Nordafrika vor, einschließlich Iran, China, Indien und der Mongolei [2]. Die Verarbeitung von CD erfolgte durch Dämpfen mit Reiswein unter Normaldruck, eine im chinesischen Arzneibuch dokumentierte Zubereitungsmethode (Jiucongrong auf Chinesisch, im Folgenden „CD-NP“ genannt). Und das CD-Dämpfen mit Reiswein unter hohem Druck ist eine effektivere Zubereitungsmethode (im Folgenden „CD-HP“ genannt) [3, 4]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass sich die pharmakologischen Wirkungen von CD von denen seiner verarbeiteten Produkte unterscheiden [5]. CD kann das Nieren-Yang stärken und den Darm entspannen, während nach dem Dämpfen mit Reiswein die Wirkung der Wiederauffüllung des Nieren-Yang verstärkt wird. In unserer früheren Studie wurde festgestellt, dass CD-NP die Sonifikation der Niere verstärken und Yang unterstützen und die Auswirkungen der Befeuchtung des Darms und des Stuhlgangs lindern kann [6–8]. In der klinischen Praxis sind verarbeitete Produkte die am häufigsten verwendete Form.
Bisher wurden in mehreren Studien die chemischen Bestandteile von CD analysiert und anschließend mehr als 100 Verbindungen isoliert und identifiziert [9–11], wie z. B. Phenylethanoidglykoside (PhGs), Iridoide, Lignane und Oligosaccharide als chemische Hauptbestandteile . Es wurde auch berichtet, dass es viele pharmakologische Aktivitäten von PhGs gibt, darunter immunmodulatorische, neuroprotektive, hepatoprotektive, entzündungshemmende, antioxidative usw.[12–14]. Iridoide besitzen entzündungshemmende Aktivitäten [15, 16]. Frühere Studien haben auch gezeigt, dass einige chemische Komponenten während der Verarbeitung Schwankungen aufwiesen [17–20]. Basierend auf diesen Berichten kann davon ausgegangen werden, dass die Variationen in der chemischen Zusammensetzung durch die Nachbearbeitung zu verschiedenen pharmakologischen Wirkungen führen, die weiter untersucht werden müssen.
In der aktuellen Studie wurde eine empfindliche und effektive Methode, nämlich Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE), zur vergleichenden Analyse durchgeführt und In-vitro-Studien zur qualitativen Analyse der Extrakte durchgeführt von CD, CD-NP und CD-HP zur Aufklärung ihrer chemischen Profile. Im Allgemeinen wurden exogene Chemikalien mit hoher Exposition in den Zielorganen als wirksame Komponenten angesehen. Daher wurden Ratten CD bzw. seine verarbeiteten Produkte oral verabreicht und anschließend charakterisiert. Die vorliegende Studie zeigt erstmals eine vergleichende Studie (sowohl in vitro als auch in vivo) von rohem und verarbeitetem CD. Die erzielten Ergebnisse würden unser Verständnis der Wirkung der CD-Verarbeitung erweitern, was für weitere Studien hilfreich sein könnte.
Materialen und Methoden
Materialien
Standardverbindungen von Ajugol (180120) und 2'-Actylacetosid (M0601AS) wurden von Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, China) bereitgestellt. Cistanosid F (MUST-17022620), Echinacosid (D1105AS), Cistanosid A (M0906AS) und Isoacteosid (M0106AS) wurden von Must Company (Sichuan China) bereitgestellt; Acteosid (O0618AS), Salidrosid (J0526AS), Catalpol (S0728AS), Geniposid (A0407AS) und Geniposidsäure (MB6001-S) wurden von Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Dalian, China) erworben. 8-Epideoxylogansäure (B31123) wurde von Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, China bezogen. Methanol und Acetonitril hatten MS-Qualität und wurden von Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland, bezogen. Methansäure (CH2O2) in HPLC-Qualität wurde von Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland) bereitgestellt. Das in der vorliegenden Studie verwendete Wasser wurde über das Milli-Q-System (18,2 MΩ, Millipore, Ma, USA) verarbeitet. Reiswein wurde von Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, China) bereitgestellt.
Cistanche deserticola wurde von Neimenggu wangyedi cistanche Co. Ltd. gesammelt. Die Proben wurden von Prof. Yanjun Zhai (Pharmazieschule der TCM-Universität Liaoning) identifiziert. Die Proben wurden an die Liaoning-Universität für Traditionelle Chinesische Medizin geschickt.
Tiere
Männliche Sprague-Dawley-Ratten (SPF-Klasse) mit einem Gesamtkörpergewicht von 180–220 g wurden von Liaoning Changsheng Biotechnology Co. Ltd. (Laboratory Animal Resource) bereitgestellt
Zentrum der Provinz Liaoning, Lizenznummer: SCXK- 2015–0001). Diese Ratten wurden eine Woche lang in einem Zuchtraum mit gut aufrechterhaltener Temperatur und Luftfeuchtigkeit, dh 20–26 Grad, 50–70 Prozent, gehalten. Vor dem Experiment wurden die Ratten mit dem üblichen Laborfutter und Wasser gefüttert. Die Tiere ließen über Nacht fasten, das Wasser wurde jedoch vor dem Experiment ad libitum bereitgestellt. Die Ratten wurden mit einem 10-prozentigen Chloralhydrat-Anästhetikum hingerichtet. Die institutionelle Tierethikkommission des Liaoning Provincial Hospital of Chinese Medicine genehmigte alle Versuchsprotokolle (25.3.2019, 2019015).
Vorbereitung von CD-, CD-NP- und CD-HP-Extrakt
CD-NP und CD-HP wurden aus derselben Charge Cistanch deserticola verarbeitet. Zur Herstellung von CD-NP wurden trockene CD-Stücke (5 mm dick, 100 g) mit Reiswein (30 ml) befeuchtet und 16 Stunden lang bei 100 Grad gedämpft, gefolgt von einer Trocknung bei 55 Grad in einem Trockenofen. Während CD-HP durch Infiltration trockener CD-Stücke (5 mm dick, 100 g) mit Reiswein (30 ml) und anschließendes 4-stündiges Dämpfen bei 1,25 Atmosphärendruck hergestellt wurde. und anschließend im Trockenofen bei 55 Grad getrocknet.
In einem 100-ml-Messkolben wurde ein Gramm des Pulvers über Sieb Nr. 4 gesiebt, gefolgt von der Zugabe von 50 Prozent Methanol (50 ml) und dann fest verschlossen und gemischt. Diese Mischung wurde gewogen, gefolgt von einer halben Stunde. Mazeration. Nach der Mazeration wurde die Mischung 40 Minuten lang mit Ultraschall behandelt (Leistung 250 W, Frequenz 35 kHz), anschließend abgekühlt und erneut gewogen. Der Gewichtsverlust wurde mit 50-prozentigem Methanol ausgeglichen, richtig gemischt und stehen gelassen, anschließend wurde der Überstand filtriert und dann das erhaltene Filtrat als Testlösung verwendet.
MSE-Analyse aktiver Komponenten
Zubereitung von Standardsubstanzen: Tableside-A (3,02 mg), Echinacosid (3,00 mg), 2'-Acetylacteosid (2,34 mg), Acetonid (2,45 mg), Isoacteosid (0,61). mg), Cistanosid-F (2,14 mg), Salidrosid (3,39 mg), Geniposid (2,84 mg), Ajugol (1,58 mg), Katalog (2,39 mg), Teniposidsäure (2,56 mg) und 8-Epideoxylogansäure (2,34 mg) wurden in einen 10-ml-Messkolben gegeben, maßstabsgetreu mit konstantem Methanolvolumen versetzt und zu einer entsprechenden Konzentrationsreferenzlösung konfiguriert. Jeder der 100 μL wurde zu einer gemischten Referenzlösung konfiguriert.
Bedingung für die MS-Analyse: Der TE-Massenwert wurde vor dem Experiment korrigiert und der Negativionenmodus verwendet. Der Massenbereich betrug 50–1200 Da, und die Probe wurde durch einige Injektionspumpen injiziert. Die Kegelgeschwindigkeit betrug 100 l/h, die Lösungsmitteldurchflussrate wurde auf 800 l/h eingestellt. Die Kapillar- und Konusspannungen wurden entsprechend auf 2500 und 40 V festgelegt. Die Temperatur der Ionenquelle und des Lösungsmittelgases betrug 100 Grad bzw. 400 Grad und die Signalerfassungsfrequenz betrug 0,5 S−1.
UPLC-Q-TOF-MSE-Analyse von CD-Extrakt
Chromatographische Auswertungen wurden in einem Waters ACQUITY I-CLASS UPLC-System (Waters Corporation, Milford, MA, USA) durchgeführt. Einschließlich ACQUITY UPLC® BEH C18-Säule (50×2,1 mm, 1,7 μm, Waters). Die mobile Phase bestand aus Wasser mit 0,1 Prozent Ameisensäure (A) und Acetonitril mit 0,1 Prozent Ameisensäure (B). Die Elutionsbedingungen waren wie folgt: 97 bis 85 Prozent A (0–5 Min.), 85 Prozent bis 75 Prozent A (5–15 Min.), 75 Prozent bis 65 Prozent A (15–16 Min.), 65 Prozent bis 55 Prozent A (16–18 Min.) . Die Durchflussrate betrug 0,3 ml min−1, während die Temperatur des Autosamplerraums und der Säule getrennt 30 Grad und 8 Grad betrug. Das Injektionsvolumen betrug 1,0 μL.
Die massenspektrometrische Auswertung erfolgte mittels Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, USA), bestehend aus einer ESI-Quelle. Die Durchflussrate des Stickstoffgases wurde auf 800 l·h-1 bei einer Temperatur von 400 °C festgelegt, die Quellentemperatur wurde auf 100 °C festgelegt und das Kegelgas wurde auf 50 l·h-1 eingestellt. Die Spannung des Konus und der Kapillare wurde entsprechend auf 40 und 2000 V eingestellt. Die Kollisionsenergie der Rampe wurde im Bereich von 20–30 V verwendet. Die Schwerpunktdaten aller Proben wurden von 50 bis 1200 Da mit einer 5-Scanzeit von 0,5 s über eine Analysezeit von 10 min erhalten . Zur Validierung der Massenpräzision wurde LockSpray TM eingesetzt. Als Sperrmasse wurde das [M–H]−-Ion von Leucin-Enkephalin (200 pg·μL-1 Infusionsflussrate 10 μL min-1) bei m/z 554,2615 verwendet. Für die genaue Masse, die Zusammensetzung der Vorläuferionen und die Berechnung der Fragmentionen wurde die Software MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, USA) verwendet.
Datenanalyse in der Masslynx-Plattform
Darüber hinaus wurde auf Basis der Literatur eine firmeninterne Bibliothek mit dem Namen der Verbindung, ihrer Struktur und der Summenformel (in Mol) erstellt. Alle Verbindungen wurden in einer speziellen, in Excel erstellten Vorlage notiert. Darüber hinaus wurden auch die mol-Dateien (ChemDraw Ultra 8.0, Cambridge soft, USA) und die Excel-Dateien aller einzelnen Verbindungsstrukturen auf dem lokalen PC gespeichert. Sie erstellten eine Excel-Tabelle mit wichtigen Daten, die direkt in die wissenschaftliche Bibliothek in UNIFI importiert wurden.
UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, UK wurde für die Bewertung struktureller Merkmale, insbesondere der charakteristischen Fragmente und der MS-Fragmentierung, eingesetzt. Für die 2D-Peakerkennung wurde eine minimale Peakfläche von 500 festgelegt. Bei der Darstellung von 3D-Peaks wurde eine Peakintensität bei niedriger Energie von mehr als 300 Counts und eine Peakintensität bei erhöhter Energie von mehr als 80 Counts gewählt. Es wurde festgestellt, dass der Massenfehler bei bekannten Verbindungen bis zu ±10 ppm betrug und die Retentionszeittoleranz auf einen Bereich von ±0,1 min eingestellt wurde. Wir haben die negativen Addukte ausgewählt, die –H plus HCOOH enthalten. Die Verarbeitung der von MS erhaltenen Rohdaten erfolgte über eine optimierte UNIFI-Software, um mithilfe der selbst erstellten Datenbank und der hauseigenen Bibliothek für traditionelle Medizin schnell die chemischen Komponenten zu identifizieren, die den Standards entsprachen.
Um die chemische Struktur jeder Zielverbindung zu überprüfen, wurden die Isomere anschließend anhand ihrer charakteristischen MS-Fragmentierungsmuster, die in den berichteten Studien aufgedeckt wurden, und durch Vergleich der Retentionszeiten von Referenzstandards unterschieden.
Metabolomics-Analyse basierend auf multivariater statistischer Analyse
Vor der Verarbeitung der Rohdaten wurden die Parameter festgelegt, z. B. die Masse im Bereich von 150 bis 1200 Da, der Bereich der Retentionszeit (0 bis 20 Minuten) und die Schwellenwertintensität ( 2000 Zählungen), Massentoleranz, d. h. 5 mDa, während Masse und Retentionszeitfenster 0,20 min bzw. 0,05 Da betrugen. In der nachfolgenden Liste der Datenbank wurden die Ionen anhand der RT-m/z-Paare hinsichtlich ihrer Elutionszeiten identifiziert. Die gleichen Werte für RT und m/z in verschiedenen Probenchargen wurden als dieselbe Verbindung betrachtet.
Multivariate statistical analysis was conducted to evaluate effective biomarkers that considerably contributed to variations among different groups. During the analysis, principal component analysis (PCA) was employed to indicate the maximum differences and pattern recognition for obtaining an overview and classification. The OPLS-DA is a modeling tool that provides visualization of the OPLS-DA predictive component loading to assist model evaluation. Variable importance for the projection (VIP) was used for assessing the evaluation of various components, and the metabolites with VIP values>1.0 und P-Wert<0.05 were regarded as effective markers. Furthermore, a permutation test was conducted for providing reference distributions for the R2/Q2 values that could show statistical significance.
Tierversuche
Die Ratten wurden zufällig in vier Gruppen eingeteilt (n=6 für jede Gruppe), gefolgt von der oralen Verabreichung verschiedener Extrakte: (1) Blindkontrollgruppe: Den Ratten wurde normale Kochsalzlösung (2 ml/100 g) verabreicht; (2) CD-Gruppe: Den Ratten wurde CD-Extrakt (2 ml/100 g) verabreicht; (3) CD-NP-Gruppe: Den Ratten wurde CD-NP-Extrakt (2 ml/100 g) verabreicht; (4) CD-HP-Gruppe: Den Ratten wurde CD-HP-Extrakt (2 ml/100 g) verabreicht. Die weitere Kategorisierung aller Gruppen erfolgte entsprechend in drei Untergruppen für Plasma, Urin und Kot. Zwei Stunden später wurde jeder Ratte die gleiche Menge an Extrakten oral verabreicht.
Nach der Verabreichung erfolgte die Entnahme von Blutproben um 1,0 h, 2,0 h und 4,{5}} h in heparinisierten 1,5-ml-Polyethylenröhrchen (aus Augenhöhlenvenen). , gefolgt von einer 15-minütigen Zentrifugation (bei 4500 U/min) aller Proben.
Für Urin- und Kotproben wurden die Ratten in Stoffwechselkäfigen gehalten, und dann wurde die Sammlung von Urin- und Kotproben 24 Stunden nach der Verabreichung durchgeführt. Die Zentrifugation der Urinproben erfolgte 15 Minuten lang bei 45 00 U/min, während die Kotproben im Schatten getrocknet und zu Pulver gemahlen wurden. Anschließend wurden 0,2 g entnommen und in 0,5 ml gegeben Kochsalzlösung, Ultraschall für 5 Minuten und Zentrifugation bei 12,000 U/min für 15 Minuten. Alle Bioproben wurden bis zur Analyse bei –80 Grad aufbewahrt.
Vorbereitung biologischer Proben
Die Zugabe von Plasma-, Urin- und Kotproben erfolgte mit 3 Volumina Methanol, gefolgt von 3-minütigem Vortexen. Als nächstes wurde die Zentrifugation (bei 12 000 U/min) der Mischungen für 10 Minuten durchgeführt, gefolgt von der Überführung des Überstands in das EP-Röhrchen und der anschließenden Trocknung mit Stickstoff bei 37 Grad. Darüber hinaus erfolgte die Zugabe von 200 μL HCN-H2O (50-prozentig)-Lösung. Dann wurde der Wirbel zum Mischen (1 Minute) verwendet, gefolgt von einer Zentrifugation (bei 12 000 U/min) für 5 Minuten. Der Überstand (5 μl) der behandelten Proben wurde in das UPLC-Q-TOF-MSE-System injiziert.
Flüssigchromatographischer und massenspektrometrischer Zustand
Die Analyse auf Metaboliten wurde ebenfalls mit dem Waters UPLC-Instrument über eine ESI-Schnittstelle durchgeführt. Die Trennungen wurden mit einer Acquity UPLC HSS T3-Säule (100 mm×2,1 mm, 1,8 µm) durchgeführt, die mobile Phase war 0,1 Prozent Ameisensäure (A): Acetonitril (B), die Gradientenelutionsbedingungen waren 0–3 Minuten (99,8 Prozent → 98 Prozent A), 3–5 Minuten (98 Prozent → 95 Prozent A), 5–8 Minuten (95 Prozent → 90 Prozent A), 8 –12 Min. (90 Prozent → 85 Prozent A), 12–17 Min. (85 Prozent → 70 Prozent A), 17–22 Min. (70 Prozent → 60 Prozent A), 22–23 Min. (60 Prozent → 58 Prozent A) , 23–25 Minuten (58 Prozent A), 25–32 Minuten (58 Prozent → 45 Prozent A) und 32–37 Minuten (45 Prozent → 35 Prozent A), 0,4 ml min−1 war die Flussrate. Die Temperatur für die Säule und den Probenraum wurde auf 40 Grad bzw. 8 Grad eingestellt. Es wurden die oben genannten Massenspektrometriebedingungen verwendet.
Strategie zur systematischen Analyse von Metaboliten in Bioproben
Zur Datenverarbeitung wurde die Software UNIFI (1.8.2) eingesetzt. Zur Identifizierung wirksamer Metaboliten wurde die Binary Compare-Funktion verwendet. Die ausgewerteten Metaboliten waren in der entsprechenden Kontrollprobe nicht vorhanden oder lagen bei niedrigen Ionenintensitäten vor. Der relative Intensitätsschwellenwert wurde auf 3 oder 5 festgelegt und Metaboliten, die die unterstrichenen Kriterien erfüllten, konnten bewertet werden. Anschließend wurden durch EIC häufige und vorhersehbare Metaboliten bestimmt. Zur Suche nach zweiphasigen Metaboliten wurde die NLF-Funktion angewendet. Beispielsweise könnten in der UNIFI-Software die Parameter auf 176.0321 eingestellt werden, um nach möglichen Glucuronsäure-Konjugaten zu suchen. Durch Nachbearbeitung kann ein neutraler Verlust in der Methode eingestellt bzw. identifiziert werden. MassFragment wurde zur Bestimmung oder Charakterisierung der Strukturen erkannter Metaboliten verwendet. Die Spektralinterpretationsfunktion eines UNIFI ist die Hauptfunktion zur Analyse der sekundären Fragmentierung der Elternkomponenten. Diese Funktion kann sinnvoll zur schnellen Überprüfung des Fragmentierungspfads verwendet werden.
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