Kombination von Mikrobläschen-Kontrastmittel mit gepulster Laserbestrahlung zur transdermalen Arzneimittelabgabe Teil 1

Abstrakt: Der optodynamische Prozess der laserinduzierten Mikroblasenkavitation (MB) in Flüssigkeiten wird in verschiedenen medizinischen Anwendungen genutzt. Allerdings lässt sich kaum abschätzen, wie einfallende Laserstrahlung mit MBs als Ultraschallkontrastmittel interagiert, wenn die Flüssigkeit bereits stabile MBs enthält. Die vorliegende Studie untersuchte die Effizienz der laservermittelten Kavitation von Albumin-umhüllten MBs bei der Verbesserung der transdermalen Arzneimittelabgabe. Zunächst wurden verschiedene Arten und Bedingungen der laservermittelten Trägheitskavitation von MBs bewertet. Für die Kombination mit MBs in den In-vitro- und In-vivo-Experimenten wurde ein CO2-fraktionierter gepulster Laser ausgewählt. Die In-vitro-Hautpenetration von Arbutin nach 2 Stunden war in der Gruppe, die einen Laser mit MBs kombinierte, doppelt so hoch wie in der Kontrollgruppe. In Kleintierversuchen erhöhte sich der aufhellende Effekt auf die Haut von C57BL/6J-Mäusen in der Gruppe, die einen Laser mit MBs auf der Haut plus durchdringendem Arbutin kombinierte, (signifikant) um 48,0 Prozent am 11. und 5. Tag 0,0 Prozent am 14. Tag und tendierte dann dazu, sich für den Rest des 20-tägigen Versuchszeitraums zu stabilisieren. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Kombination eines CO2-Lasers mit MBs mit Albuminhülle die Hautdurchlässigkeit erhöhen kann, um die Abgabe von Arbutin zu verbessern und so die Melanogenese bei Mäusen zu hemmen, ohne die Haut zu schädigen.

Laut einschlägigen StudienCistancheist ein weit verbreitetes Kraut, das als „Wunderkraut, das das Leben verlängert“ bekannt ist. Sein Hauptbestandteil istCistanosid, was verschiedene Auswirkungen hat, wie zAntioxidans, Antiphlogistikum, UndFörderung der Immunfunktion. Der Mechanismus zwischen Cistanche undHautaufhellungliegt in der antioxidativen Wirkung vonCistanche-Glykoside. Melanin in der menschlichen Haut entsteht durch die katalysierte Oxidation von TyrosinTyrosinase. Die Oxidationsreaktion erfordert die Beteiligung von Sauerstoff, daher werden die sauerstofffreien Radikale im Körper zu einem wichtigen Faktor, der die Melaninproduktion beeinflusst. Cistanche enthält Cistanosid, ein Antioxidans, das die Bildung freier Radikale im Körper reduzieren kannHemmung der Melaninproduktion.

Klicken Sie auf Cistanches Herba zum Aufhellen

Für mehr Information:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Einleitung

Kavitation bezieht sich auf die Bildung von Hohlräumen in einer Flüssigkeit und tritt normalerweise auf, wenn die Flüssigkeit schnellen Druckänderungen ausgesetzt ist. Solche Druckänderungen können mit vielen verschiedenen Methoden induziert werden, wobei akustische Kavitation ausgelöst wird, wenn die Amplitude eines angelegten akustischen Drucks einen bestimmten Schwellenwert überschreitet [1]. Bei der akustischen Kavitation kommt es zur Bildung, zum Wachstum, zum Pulsieren und zum Kollabieren von Mikroblasen (MBs) in Flüssigkeiten während der Beschallung durch hochintensive Ultraschallwellen (US). Es wird angenommen, dass diese Phänomene für die Vermischung, Fragmentierung, Erosion, Benetzung, sonokapillare Wirkung und andere Effekte verantwortlich sind, die verschiedene praktische industrielle Anwendungen haben [1].

Auch die US-induzierte Kavitation von MB-Kontrastmitteln spielt sowohl bei diagnostischen als auch bei therapeutischen medizinischen Anwendungen eine wichtige Rolle. US-Kontrastmittel sind stabilisierte und beschichtete MBs, die intravasal injiziert werden, um die Auflösung der diagnostischen US-Bildgebung zu verbessern [2]. Zahlreiche Studien belegen, dass das Vorhandensein von MB-Kontrastmitteln im Blut die Schwelle für verschiedene US-induzierte biologische Wirkungen sowohl in vitro als auch in vivo senken kann, wie z. B. Hämolyse, Kapillarruptur und Sonoporation [3]. Einige Studien haben darauf hingewiesen, dass das Vorhandensein von MB-Kontrastmitteln im Blut die Schwelle für US-induzierte vorzeitige Herzkontraktionen deutlich senkt [4,5]. Die Resonanz von MBs (stabile Kavitation) führt zu nichtlinearen harmonischen Emissionen, die in der MB-spezifischen Kontrastbildgebung genutzt werden können. Die Trägheitskavitation und die Zerstörung von MBs können starke mechanische Belastungen hervorrufen, die die Durchlässigkeit von Zellmembranen und der Blut-Hirn-Schranke erhöhen und so die Abgabe therapeutischer Wirkstoffe verbessern. In unseren früheren Studien haben wir die durch die USA induzierte Trägheitskavitation von MBs angewendet, um die transdermale Arzneimittelabgabe (TDD) zu verbessern, da festgestellt wurde, dass Trägheitskavitation im Vergleich zur stabilen Kavitation zu einer weitaus größeren Permeabilitätssteigerung des Stratum Corneum führt [6–8] .

Laserbestrahlung ist ein alternativer Ansatz zur Verbesserung der Arzneimittelpermeation und damit zur Erleichterung der Arzneimittelabgabe in oder über die Haut. Wenn ein Laserimpuls mit einer Intensität über einem bestimmten Schwellenwert auf eine Flüssigkeit fokussiert wird, kann eine explosionsartige Verdampfung der Flüssigkeit auch MB-Kavitation induzieren [9,10]. Die aggressive Natur der laserinduzierten Kavitation hat dazu geführt, dass sie in einem breiten Anwendungsspektrum eingesetzt wird, darunter Zelllyse, Zellmembranporation und Augenchirurgie [11]. Kürzlich wurden Strategien zur sicheren Verbesserung des Erscheinungsbilds von postoperativen, atrophischen und Aknenarben unter Verwendung fraktionierter ablativer und nichtablativer Laser demonstriert [12]. Die ablative Laser-Hauterneuerung bietet die größten klinischen Verbesserungen, die postoperative Genesung dauert jedoch mehrere Wochen [13]. Nichtablative Laserverfahren eignen sich möglicherweise besser für Patienten, die eine längere postoperative Heilung nicht tolerieren können oder wollen. Eine frühere Herpes-simplex-Infektion kann jedoch nach einer nichtablativen Laser-Hautremodellierung aufgrund der starken Hitze, die durch den Laser oder eine andere Lichtquelle erzeugt wird, reaktivieren [13].

Es wurden einige Methoden entwickelt, um die durch Laserbestrahlung erzeugte Wärme zu reduzieren, beispielsweise die Verwendung von Kontaktkühlhandstücken oder dynamischen Kryogeräten, die in der Lage sind, Kühlspraystöße mit variabler Dauer abzugeben [14]. Es besteht jedoch noch kein Konsens darüber, welche Kühlmethode während der Behandlung am effektivsten ist. Darüber hinaus bleibt, anders als in den USA, der Mechanismus, der den Auswirkungen der laserinduzierten Kavitation mit stabilisierten beschichteten MBs in Flüssigkeiten zugrunde liegt, unklar.

2. Materialien und Methoden

2.1. Herstellung von MBs mit Albuminhülle

Mit Albumin umhüllte MBs wurden gemäß dem in unseren früheren Studien verwendeten Verfahren hergestellt [7,15]. Kurz gesagt, Albumin-umhüllte MBs wurden durch Ultraschallbehandlung in 10 ml einer Lösung erzeugt, die 140 mg Albumin (Octapharma, Wien, Österreich) und Perfluorkohlenstoffgas in physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,4, { {21}},9 Prozent Natriumchlorid) mit einem Ultraschallgerät (Branson Ultraschall, Danbury, CT, USA) für 2 Minuten. Die Anzahl der mit Perfluorkohlenstoff gefüllten Albumin-MBs in der Lösung wurde mit dem MultiSizer III-Gerät (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) mit einer Sonde mit 30-µm-Apertur und Messgrenzen von 0,6–20 µm gemessen. Die Größenverteilung in der Suspension wurde anhand der dynamischen Lichtstreuung (Zetasizer Nano, ZS90, Malvern, UK) gemessen, die ergab, dass die mit Albumin umhüllten MBs einen Durchmesser von 1,02 ± 0,11 µm (Mittelwert ± Standardabweichung) und eine Konzentration von 1,40 aufwiesen × 108 MB/ml.

2.2. Laserinduzierte MB-Störung 

Frühere Studien haben gezeigt, dass eine US-vermittelte MB-Störung (dh Trägheitskavitation) für eine wirksame TDD erforderlich ist [8,16,17]. In der vorliegenden Studie wurde die Effizienz der MB-Disruption beim Einsatz verschiedener Lasertypen unter verschiedenen Bedingungen gemessen. Die Konzentration der MBs wurde in einem Eppendorf-Röhrchen auf 2,8 × 107 MBs/ml (fünffache Verdünnung) und 1,4 × 107 MBs/ml (zehnfache Verdünnung) eingestellt, und die Bestrahlung erfolgte durch vier Lasertypen: Luftgekühlter Argon-Ionen-Laser (515 nm, kontinuierliche Welle), Superkontinuum-Faserlaser (1064 nm, gepulste Welle), Nd: YAG-Laser (532 nm, gepulste Welle) und CO2-Fraktionslaser (10.600 nm, gepulste Welle). Die detaillierten Bedingungen für die verschiedenen Lasertypen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Ein Beispiel für den optischen Aufbau ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Temperaturänderung während der Laserbestrahlung wurde mit einem Thermometer (Optris LS, Optris, Berlin, Deutschland) gemessen. Anschließend wurden nach der Laserbestrahlung 100 µL der MB-Lösung zur Beobachtung auf einen Objektträger gegeben. Die Anzahl der MBs in Lichtmikroskopbildern vor und nach der Laserbestrahlung wurde mit MATLAB (The MathWorks, Natick, MA, USA) in 8--Bit-Graustufenbilder umgewandelt, um die Beobachtung von MB-Störungen zu erleichtern. Die Zerstörungsrate von MBs wurde anhand der beschädigten Bereiche mithilfe der folgenden Gleichung quantifiziert:

2.3. Eindringtiefe in Schweinsleder

2.4. In-vitro-Hautpenetration durch -Arbutin-Lösung

Eine {{0}}mm dicke Probe Schweinehaut wurde mit einem Humby-Messer entnommen, sorgfältig mit PBS gereinigt und in quadratische Stücke (2 cm × 2 cm) geschnitten. Kreisförmige Bereiche auf den Hautproben mit einem Radius von 1,5 cm und einer Höhe von 5 mm wurden mit Gel umschlossen, um ein Auslaufen zu verhindern, wenn die Probe mit 5{{30}}0 µL MBs beladen wurde. Nach siebenmaliger Bestrahlung der Probe (die Bedingungen sind in Tabelle 1 aufgeführt) mit einem CO2-Fraktionslaser wurde die Hautpenetration mit statischen Franz-Diffusionszellen auf einer Fläche von 2,14 cm2 gemäß dem zuvor beschriebenen experimentellen Design getestet [7]. Die Temperatur der Diffusionsanordnung wurde bei 37 °C gehalten. -Arbutin (30 mg/ml, 500 µl, 4-Hydroxyphenyl- -D-Glucopyranosid, Molekularmasse=272,25 Da; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) war Auf die epidermale Seite der Haut aufgetragen und mit Parafilm (Pechiney Laboratory Safety Products and Apparel, Chicago, IL, USA) verschlossen. Die der Hautseite zugewandte Rezeptordiffusionskammer wurde mit 12 ml PBS (pH 7,4) gefüllt, das von einem mit 600 U/min rotierenden Magnetstab gerührt wurde. Testlösungen, die keine MBs enthielten, wurden durch einen 0,2-µm Mikroporenfilter (Nalgene, Rochester, NY, USA) oder einen 0,22-µm Mikroporenfilter (Millex, Darmstadt, Deutschland) filtriert. Aliquote (200 µL) der Rezeptorlösung wurden nach 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 und 24 Stunden entnommen und durch das gleiche Volumen frischer Rezeptorlösung ersetzt.

2.5. HPLC-Analyse von -Arbutin

Zur Messung der Arbutinkonzentrationen wurde eine Inspire™ C18-Säule (250 mm × 4,6 mm, 5 µm Partikelgröße; Dikma Technologies, Lake Forest, CA, USA) verwendet. Das HPLC-System war mit einer binären Pumpe (PU-2089, Jasco, Tokio, Japan) ausgestattet und die Wellenlänge des Ultraviolettdetektors (UV-2075, Jasco) wurde auf 280 nm eingestellt. Die mobile Phase bestand aus Methanol:destilliertem Wasser (pH 5,5, 70:30 v/v) [18] mit einer Geschwindigkeit von 0,6 ml/min. Alle zu analysierenden Proben wurden in einem Volumen von 20 µL injiziert. Die Retentionszeit von -Arbutin betrug etwa 4,3 Minuten.

2.6. Tierbehandlungen

Der Melaningehalt von Organoiden wurde im C57BL/6J-Mausmodell untersucht [19]. Fünf Wochen alte Mäuse mit einem Gewicht von 20–25 g wurden von Bio Lasco (Taipeh, Taiwan) bezogen. Das Versuchsprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des National Defense Medical Center, Taipei, Taiwan, genehmigt. Die Verfahren zur Tierpflege entsprachen den institutionellen Richtlinien und Vorschriften (Genehmigungsnr. IACUC-17-092). Während der gesamten Experimente wurden die Tiere in Edelstahlkäfigen in einem klimatisierten Raum mit einer Temperatur von 25–28 °C und abwechselnden Hell-Dunkel-Zyklen von jeweils 12 Stunden gehalten.

Die Tiere wurden vor dem Experiment 7 Tage lang akklimatisiert. Nachdem ihre Haare auf einer Fläche von 2 cm × 2 cm entfernt worden waren, wurde die Hautfarbe mit einem Chromameter (CR-400, Konica Minolta Sensing, Tokio, Japan) gemessen. Anschließend wurden die Tiere dreimal ultravioletter B-Strahlung (UVB) (G8T5E, Sankyo, Tokio, Japan) ausgesetzt, um eine Hyperpigmentierung auszulösen (Gesamtenergiedosis pro Exposition=1 J/cm2, Wellenlänge=306 nm). Woche für 2 Wochen), und dann wurde die Hautfarbe erneut gemessen.

Die Tiere wurden in die folgenden fünf Gruppen eingeteilt (n {{0}} pro Gruppe, Behandlung einmal alle 3 Tage für 20 Tage): (1) keine Behandlung (Gruppe C); (2) Anwendung von penetrierendem Arbutin allein (300 µg/ml, 0,2 ml/cm2) (Gruppe A); (3) direkte Laserbestrahlung der Haut mit der Anwendung von durchdringendem Arbutin (300 µg/ml, 0,2 ml/cm²) (Gruppe L plus A); (4) Laserbestrahlung der mit Kochsalzlösung bedeckten Haut und Anwendung von durchdringendem Arbutin (300 µg/ml, 0,2 ml/cm²) (Gruppe L plus S plus A); und (5) Laserbestrahlung der Haut in Kombination mit MBs auf der Haut und der Anwendung von penetrierendem Arbutin (300 µg/ml, 0,2 ml/cm2) (Gruppe L plus MBs plus A). Die durch jede der Behandlungen hervorgerufene Veränderung der Hautfarbe wurde zu vorgegebenen Zeitpunkten mit dem Chromameter beurteilt. Der Leuchtkraftindex L [20] wurde an jedem Messtag vor und nach der Behandlung berechnet.

2.7. Histologische Studie

Unmittelbar nach den Experimenten wurden Hautgewebeproben (ca. 8 mm × 8 mm) aus dem Behandlungsbereich entnommen und in einer 10-prozentigen Formalinlösung aufbewahrt. Es wurde eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (HE; Sigma-Aldrich) angewendet und die Proben von einem erfahrenen Dermatopathologen (HWG) analysiert. Einige andere Proben wurden mit Fontana-Masson-Silbernitrat (Kojima Chemical, Kashiwabara, Japan) 30 Minuten lang bei 60 °C gefärbt, dann mit destilliertem Wasser gewaschen und 2 Minuten lang in 5-prozentiger Natriumthiosulfatlösung (Duksan, Seoul, Korea) fixiert min, bevor erneut mit destilliertem Wasser gewaschen wird. Anschließend wurden die Proben 5 Minuten lang mit nuklearer Echtrotlösung (Fluka, Buchs, Schweiz) gefärbt und zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Abschließend wurden die Proben in 95-prozentigem Ethanol und anschließend in 100-prozentigem Ethanol dehydriert und anschließend zweimal mit Xylol (Duksan) gewaschen [21].

2.8. Statistische Analyse

Die erhaltenen Daten wurden statistisch mit dem Student-t-Test analysiert. Ein Wahrscheinlichkeitswert von p < 0.05 wurde als Hinweis auf einen signifikanten Unterschied angesehen.

3. Ergebnisse

3.1. Laserinduzierte MB-Störung

Mikroskopbilder von fünffach verdünnten MBs ohne und mit Bestrahlung durch einen kontinuierlichen 10,8-mW-Laser (luftgekühlter Argon-Ionen-Laser) und einen gepulsten 10,8-mW-Laser (Superkontinuumsfaser) für 60, 120 und 180 s sind in Abbildung 2 dargestellt Die Zerstörungsraten des gepulsten Lasers stiegen um 17,66 Prozent, 20,52 Prozent und 39,05 Prozent im Vergleich zum kontinuierlichen Laser bei 60, 120 bzw. 180 s. Abbildung 3 zeigt die Zerstörungswirksamkeit von fünf- und zehnfach verdünnten MBs bei Verwendung eines gepulsten Nd:YAG-Lasers bei 60, 120 und 180 s. Die Zerstörungsraten von fünf- und zehnfach verdünnten MBs betrugen 72,46 Prozent bzw. 78,59 Prozent bei 60 Sekunden, 88,06 Prozent, 96,10 Prozent bei 120 Sekunden, 85,22 Prozent und 98,80 Prozent bei 180 Sekunden. Abbildung 4 zeigt die Zerstörungswirksamkeit zehnfach verdünnter MBs bei ein-, drei- und siebenmaliger Bestrahlung mit dem klinischen CO2-Fraktionspulslaser. Die Zerstörungsrate stieg mit der Bestrahlungsdauer und lag bei siebenmaliger Bestrahlung bei nahezu 100 Prozent. Daher wurde diese Bedingung in den nachfolgenden In-vitro- und In-vivo-Experimenten verwendet.

Für weitere Informationen: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501