Apoptotische Wirkung von Cistanche-Polysacchariden auf Leukämie

Autor:

LI Jan,ZHANG Jin,ZHANG Jing-Nan,et al.

Innere Mongolei, China

Zur Untersuchung der apoptotischen Wirkung vonCistanche-Polysaccharide( CDP) auf MenschAkute LeukämieZelllinie Jurkat-Zellen．MethodenDer MTT-Assay wurde angewendet, um die Wirkung von CDP auf die Zellproliferation nachzuweisen, Western Blotting wurde verwendet, um die Aktivierung von Caspase-9 und Caspase-3 nachzuweisen., und die apoptotischen Signalmoleküle wurden ebenfalls getestet．ＲErgebnisseDie T-Zell-Proliferation wurde durch 1 mg/ml und 2 mg/ml CDP gehemmt, T-Zellen-Apoptose wurde durch 5 mg/ml CDP induziert, unddie Expression von Pro-Caspase-9 und Pro-Caspase-3 war signifikant reduziert． Die Expression der Zelloberflächenrezeptoren CD45 und CD71 wurde durch 5 mg/ml CDP signifikant gehemmt, EＲK-Phosphorylierung wurde induziert, und die JNK-Phosphorylierung wurde gehemmt.

Schlussfolgerungen

【Schlüsselwörter】Cistanche-Polysaccharide; Apoptose; ＲRezeptor; caspase-9; caspase-3

Akute lymphoblastische Leukämie (ALL) ist eine maligne klonale Erkrankung des lymphatischen Systems mit einem hohen Grad an Immunphänotyp-Heterogenität. , leicht rückfällig, und so weiter. Zu den derzeit häufig verwendeten Behandlungsmethoden gehören Knochenmarktransplantation, Induktionstherapie, Immuntherapie, kombinierte Chemotherapie usw. Aufgrund der begrenzten Fähigkeit der meisten Chemotherapeutika, Tumore anzugreifen und abzutöten, können sie ernsthafte Schäden am Verdauungssystem, Blutsystem, kardiovaskulär und zerebrovaskulär usw. Während der Behandlung wird sie oft von schwerwiegenden Nebenwirkungen begleitet, von denen einige sogar tödlich sind. Mit fortschreitender Chemotherapie neigt der Körper dazu, eine Toleranz gegenüber Chemotherapeutika zu entwickeln, was das Risiko eines Wiederauftretens der Krankheit erhöht.

Daher ist die Suche nach einer hochwirksamen, wenig toxischen und hochgradig zielgerichteten Leukämietherapie oder adjuvanten Therapie in den Fokus der gegenwärtigen Aufmerksamkeit gerückt.Cistancheheißt Chagangaoya auf Mongolisch. Sie gehört zur Familie der Ledangaceae und zur Gattung Cistanche. Es ist parasitär an den Wurzeln von Wüstenbäumen und hat den Ruf von "Wüstenginseng".

Zu den Hauptwirkstoffen von Cistanche gehören Phenylethanoidglykoside, Lignane, Betaine, Sterole, Aminosäuren und Polysaccharide. Entzündungshemmende, antivirale, antioxidative, immunregulierende und andere Wirkungen.

Das haben Studien herausgefundenCistanche-Polysaccharid (CDP),als eine seiner wichtigsten aktiven Komponenten,hat Antitumor- und immunmodulatorische Wirkungen.Die Forscher fanden heraus, dass CDP eine signifikante Abtötungswirkung auf die Leukämiezellen K562 und THP-1 hat, und schlugen vor, dass CDP eine bestimmte Rolle dabei spieltVorbeugung oder Behandlung von Leukämie. Darüber hinaus wird Cistanche in der traditionellen chinesischen Medizin zur Behandlung von Akuterkrankungen verwendetLeukämie, Cistanchespielt als eine der wichtigen Komponenten ebenfalls eine Rolle. Allerdings ist der spezifische Wirkungsmechanismus vonCistancheist nicht bekannt. In diesem Artikel wird die Isolierung und Reinigung vonCistanche CDPwurden untersucht, und die Tötungswirkung und der verwandte Mechanismus von CDP auf die humane akute Leukämie-Zelllinie Jurkat wurden untersucht.

1.1 Hauptreagenzien und Instrumente

Cistanche-Pulver wurde von Sichuan bezogen WecistancheGroup Co, Ltd., die humane akute Leukämie-Zelllinie Jurkat wurde von der Zellbank des Shanghai Institute of Cell Biology gekauft, Thiazolblau (MTT) und Natriumdodecylsulfat (SDS) wurden von Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd. gekauft, fötales Rinderserum (FBS) wurde von Hangzhou Sijiqing Bioengineering Materials Co., Ltd. bezogen, Cystein enthaltende Caspase-3, Caspase-9, CD71, CD45, phosphorylierte aminoterminale c-Jun-Kinase (S -JNK) und phosphorylierte extrazelluläre signalregulierte Kinase (p-ERK)-Antikörper wurden von Cell Signaling Technology, USA, erworben, und Aktin-Antikörper wurden von Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. erworben. Elektrochemisch Das Lumineszenz (ECL)-Substrat wurde von Thermo erworben Scientific Company of the United States, und andere Reagenzien waren von inländischer Analysequalität. Gel-View 6000 plus Intelligent Image Workstation (Produkt von Guangzhou Boluteng Biotechnology Co., Ltd.), Revolve FL Upside-Down-Fluoreszenzmikroskop (Produkt von Echo Laboratories, USA), EPOCH-Mikroplatten-Lesegerät (Produkt von Beijing Bo Teng Instrument Co., GmbH.).

1.2 Abtrennung und Reinigung von CDP Nehmen Sie 500 g davonCistanche-Extraktpulver, über Nacht in 95-prozentigem Ethanol einweichen, mit Gaze filtrieren, den Filterrückstand sammeln, mit heißem Wasser bei 60 Grad für 2 h/Zeit kochen, insgesamt 3 Mal. Nach Beendigung wurden die Filtrate dreimal vereinigt, unter vermindertem Druck auf 2/3 des ursprünglichen Volumens eingeengt, mit dem 3-fachen Volumen 95-prozentigem Ethanol versetzt und über Nacht bei 4 Grad stehen gelassen. Am nächsten Tag bei 4 000 U/min für 10 min zentrifugieren, das Präzipitat sammeln, Protein durch die Sevag-Methode entfernen, mit absolutem Ethanol präzipitieren, gefriertrocknen, um CDP zu erhalten.

1.3 Zellkultur Die menschliche akute Leukämie-Zelllinie wurde im Jurkat-Labor in flüssigem Stickstoff gelagert. Wenn sie verwendet wurden, wurden die Zellen schnell in einem Wasserbad von 37 Grad gewonnen und in RPMI1640-Medium (enthaltend 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycine) mit 10 Prozent FBS kultiviert. Die Zellen wurden in einem Zellinkubator mit 37 Grad, 5 % CO 2 kultiviert, alle 2 bis 3 Tage passagiert, und die Experimente wurden durchgeführt, als die Zellen in die logarithmische Wachstumsphase eintraten.

1.4 MTT-Experiment Jurkat-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden entnommen, zentrifugiert, um Zellpellets zu erhalten, und bei 5 × 10 5 Zellen/ml gezählt. Nehmen Sie eine Zellkulturplatte mit 96- Vertiefungen, beimpfen Sie 100 ul Zellen in jede Vertiefung und fügen Sie dann 100 ul RP-MI1640-Vollmedium als Kontrollgruppe hinzu; die experimentelle Gruppe wurde in 3 Gruppen eingeteilt, wobei zuerst RPMI1640-Medium verwendet wurde, um unterschiedliche Konzentrationen von CDP herzustellen, und dann 100 ul RP-MI1640-Medium zu jeder Vertiefung hinzugefügt wurden. ul Jurkat-Zellen und 100 ul CDP-Lösung wurden verwendet, um die Endkonzentration von CDP bei 1, 2 bzw. 5 mg/ml herzustellen. Jede Gruppe wurde mit 5 Duplikatvertiefungen eingerichtet und in einem 37-Grad-Zelleninkubator für 48 h inkubiert. Nach der Inkubation 20 ul MTT (die Konzentration der Stammlösung beträgt 5 mg/ml) in jede Vertiefung geben, zurück in den Zellinkubator geben, 4 h weiter inkubieren und schließlich 100 ul 20 Prozent zugeben SDS, um Formazan bei 37 Grad über Nacht aufzulösen und am nächsten Tag zu verwenden. Die Extinktion bei 570 nm jeder Gruppe wurde durch ein Mikroplatten-Lesegerät nachgewiesen, und die Inhibitionsrate verschiedener CDP-Konzentrationen auf die Proliferation von Jurkat-Zellen wurde durch die Formel berechnet.

1,5 Western-Blot-Jurkat-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden entnommen und in einer 6--Well-Platte mit einer Dichte von 2 × 10 5 Zellen/ml, 500 ul/Well ausgesät, und 500 ul RPMI1640-Vollmedium wurden zur Kontrolle gegeben Gruppe. Richten Sie 3 experimentelle Gruppen ein, 1, 2 und 5 mg/ml Polysaccharid-Behandlungsgruppen, CDP

Vorher in RPMI1640-Vollmedium gelöst, wurden 500 ul Zellen und 500 ul CDP-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen zu der 6--Well-Platte gegeben und 48 h bei 37 Grad inkubiert. Nach der Kultur wurden die Zellsuspensionen jeder Gruppe gesammelt, bei 1 500 U/min für 5 min zentrifugiert, um Zellpellets zu erhalten, und zweimal mit vorgekühlter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Nach dem Waschen wurden jeder Gruppe 20 ul Zelllysepuffer zugesetzt, und die Zellen wurden 30 Minuten lang auf Eis lysiert. Das Gesamtprotein wurde extrahiert und die Zellkonzentration wurde unter Verwendung des Bradford-Verfahrens eingestellt. 20 ug Protein wurden jeder Gruppe für die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) entnommen, und das Protein wurde durch Elektroporation auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran übertragen. Blockiert mit fettfreiem Milchpulver bei Raumtemperatur für 1 h, Zugabe von Kaninchen-Anti-Human-Caspase-3- und -Caspase-9-Antikörpern in einem Verdünnungsverhältnis von 1:1 000, Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h h, dreimal mit einem Phosphat-Tween-Puffer (PBST)-Schüttler gespült (10 min/Zeit), Meerrettichperoxidase (HRP)-markierten sekundären Antikörper (1:1 000) zugeben, 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, spülen 3-mal mit PBST, 1-mal mit PBS spülen, ECL-Substrat zugeben und verwenden. Die intelligente Bild-Workstation wurde zur Bildgebung verwendet, und die Bandenänderungen jeder Gruppe wurden verglichen, um die durch CDP induzierte Apoptose von Jurkat-Zellen zu untersuchen. Für den Nachweis von Apoptoseweg-verwandten Proteinen waren die Zellkultur- und CDP-Behandlungsbedingungen die gleichen wie oben. Nach der Reaktion wurden die Zellen zur Proteinquantifizierung lysiert. Das Protein wurde durch SDS-PAGE und Elektroporation auf eine PVDF-Membran übertragen. Nach einstündigem Blockieren mit Magermilchpulver wurden Anti-CD71-, CD45-, p-JNK- und p-ERK-Antikörper (1:1 000) zugegeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Der HRP-markierte sekundäre Antikörper (1:1 000) wurde für 1 h inkubiert, und schließlich wurde die intelligente Imaging-Workstation für die Bildgebung verwendet, um die verwandten Signalmoleküle der CDP-induzierten Apoptose von Jurkat-Zellen zu untersuchen. Die resultierenden experimentellen Banden wurden mit Image J (1.8.0) grauskaliert.

Klicken Sie hier, um die Wirkung von Cistanche auf die Antitumor- und Antikrebswirkung zu erfahren

1.6 Statistische Analyse SPSS21.0-Software wurde für den t-Test und die Varianzanalyse verwendet

2 Ergebnisse der Cistanche-Funktion anLeukämie

2.1 Zellproliferationsniveau

Das CDP wurde erfolgreich isoliert, mit mehr als 9{{20}} Prozent Zuckergehalt und weniger als 5 Prozent Proteingehalt. Die Inhibitionsrate der Zellproliferation in der 1 mg/ml CDP-Gruppe betrug (19,1 ± 2,1) Prozent, während die in den 2 mg/ml und 5 mg/ml CDP-Gruppen (44,2 ± 5,2) betrug ) ) Prozent und (47,8 ± 4,4) Prozent, was anzeigt, dass CDP die Proliferation von Jurkat-Zellen in dosisabhängiger Weise signifikant hemmen kann. 2.2 Verglichen mit der Kontrollgruppe (0.62±0.04, 0.56±{{40}}.{{49 }}7), führte das Ausmaß der Apoptose in mit 5 mg/ml CDP behandelten Jurkat-Zellen zu den Enzymen Caspase-9 und Caspase{{30}}. Proform pro-Caspase-9 ( 0. 09 ± 0. 02) und Pro-Caspase-3 ( {{ 63}}. 12 ± 0. 01) waren signifikant reduziert und die 1 mg/ml und 2 mg/ml CDP-Gruppen waren signifikant weniger wirksam für Pro-Caspase-3 in Zellen. Der Gehalt an Caspase-9 (0,58 ± 0,04, 0,51 ± 0,01) und Pro-Caspase-3 (0,48 ± 0,04, 0,44 ± 0,05) hatte keine signifikante Wirkung, d. h. eine niedrige CDP-Konzentration wurde nicht induziert Apoptose von Jurkat-Zellen, sondern hemmte hauptsächlich die Zellproliferation, wie in Abbildung 1 gezeigt.

1-4: Referenzgruppe,

1 mg/ml CDP-Gruppe, 2 mg/ml CDP-Gruppe, 5 mg/ml CDP-Gruppe; das gleiche wie in der folgenden Abbildung

Abbildung 1 Die Wirkung von CDP auf Caspase-9 und Caspase-3 in Jurkat-Zellen

Einfluss von Cistanche-Polysacchariden Wirkung auf Leukämie

2.3 Die relativen Expressionsniveaus von CD71 und CD45 in der Apoptose-Rezeptor-Kontrollgruppe betrugen 1,00±0,04, {{10}},54± 0.{{20}}2. Die Gruppe mit 5 mg/ml CDP konnte CD71 signifikant hemmen (0.05±0.02). 01) und CD45 (0. 13 ± {{40}}. 03); 1 mg/ml und 2 mg/ml CDP-Gruppen konnten die Expression von CD71 (0,52 ± 0,06, 0,43 ± 0,07) bis zu einem gewissen Grad hemmen. Es gab keine signifikante Wirkung auf die Expression von CD45 (0,51 ±0,01, 0,48 ±0,02). Siehe Abbildung 2.

Abbildung 2 Die Wirkung von CDP auf die Expression von Rezeptoren auf der Zellmembranoberfläche

2.4 Apoptose-bezogene Signalwege

Die relativen Expressionsniveaus von p-JNK und p-ERK in der Referenzgruppe betrugen 1,20±0,08 und 0,21±0 .03. Die 5 mg/ml CDP-Gruppe induzierte Apoptose und verringerte signifikant das Phosphorylierungsniveau von JNK. (0. 32 ± 0. 04) erhöhte signifikant das Phosphorylierungsniveau von ERK (1. 13 ± 0. 05); 1 mg/ml, 2 mg/ml CDP erhöhte den Phosphorylierungsspiegel von JNK (1,12 ± 0,06, 1,06 ± 0,06) hatte keine signifikante Wirkung, erhöhte aber immer noch den Phosphorylierungsspiegel von ERK (0,54 ± 0,04, 0,63 ± 0,02). Siehe Abbildung 3.

Abbildung 3 Die Wirkung von CDP auf die Phosphorylierung von JNK und ERK

3 Diskussion

In den letzten Jahren haben Studien herausgefunden, dass CDP eine gewisse hemmende Wirkung auf Leukämie-Zelllinien hat, aber der spezifische Wirkungsmechanismus ist noch nicht bekannt.

Im Prozess der Apoptose ist Caspase-9 eines der vorgeschalteten Signalmoleküle im Caspase-abhängigen Apoptoseprozess. Nach der Signalstimulation wird die Pro-Caspase -9 massiv hydrolysiert, um eine aktivierte Form der gespaltenen Caspase -9 zu produzieren, die weiterhin apoptotische Signale nach unten überträgt, um den Prozess der Apoptose zu fördern. Caspase-3 ist ein Effektor-artiges Caspase-Molekül und ein wichtiges Signalmolekül im Prozess der zellulären Caspase-abhängigen Apoptose. Es existiert unter normalen Bedingungen auch in Form von Pro-Enzym (Pro-Caspase-3). Einmal durch Hydrolyse aktiviert, wird eine große Menge an gespaltener Caspase produziert. -3, wird es eine Vielzahl wichtiger Proteinmoleküle in Zellen lysieren und schließlich Apoptose induzieren. CDP gehört zu den aktiven Polysacchariden biologischer Makromoleküle und kann nicht ungehindert durch die Zellmembran in Zellen eindringen. Daher induziert CDP Apoptose, indem es die Expression und Verteilung von Rezeptoren auf der Oberfläche von Jurkat-Zellmembranen beeinflusst, wodurch Signale in das Innere von Zellen übertragen werden und schließlich die Caspase-Familie aktiviert wird. Protein, was zu Zellapoptose führt. Diese Studie zeigt, dass eine niedrige CDP-Konzentration keine Apoptose von Jurkat-Zellen induziert, sondern hauptsächlich die Zellproliferation hemmt. CD71, auch als Transferrinrezeptor bekannt, ist ein Typ-II-Transmembran-Glykoproteinrezeptor, der an der Eisenabsorption und Regulierung von Zellwachstum und -entwicklung beteiligt ist. CD71 wird bei Patienten mit akuter Leukämie stark exprimiert und ist mit primärer Arzneimittelresistenz, d. h. der Expression von CD71, assoziiert. Je höher der Wert, desto schlechter die Wirkung der ersten Chemotherapie. Daher ist CD71 einer der Marker für die Hilfsdiagnostik. CD45 wird auf der Oberfläche aller Arten von Leukozyten exprimiert, auch bekannt als allgemeines Leukozytenantigen. Es gehört zum Transmembran-Glykoprotein Typ I und ist eng mit der Entwicklung und Differenzierung von T-Zellen verbunden. CD45 weist bei verschiedenen Arten von Leukämie unterschiedliche Expressionsniveaus und allosterische Typen auf, sodass es als einer der Marker für die Differentialdiagnose und Immunphänotypisierung von Leukämie verwendet werden kann. Der monoklonale CD45-Antikörper wird in großem Umfang bei der Behandlung von Leukämie, insbesondere arzneimittelresistenter Leukämie, verwendet. Friesenet al. festgestellt, dass Radionuklide

Markierte CD45-mAb können Apoptose in arzneimittelresistenten Leukämie-Zelllinien induzieren, indem sie Proteine ​​der Caspase-Familie (einschließlich Caspase-3, Caspase-8 und Caspase-9) aktivieren. CDP induziert die Apoptose von Jurkat-Zellen, indem es zunächst auf die Zellmembran-Oberflächenrezeptoren CD45 und CD71 einwirkt, die Expression und Verteilung der beiden beeinflusst, Apoptosesignale in die Zellen überträgt und schließlich Caspase-9 und Caspase{{8} aktiviert }}, Apoptose auslösend. Sowohl Caspase-9 als auch Caspase-3 befinden sich jedoch stromabwärts des apoptotischen Wegs, und stromaufwärts gelegene Signalmoleküle müssen weiter erforscht werden. In dieser Studie induzierte CDP bei einer Konzentration von 5 mg/ml die Apoptose von Jurkat-Zellen, während es die Expression von CD45 hemmte, die ähnlich der des oben beschriebenen monoklonalen CD45-Antikörpers war. Aus Sicht der Apoptose-assoziierten Rezeptoren CD45 und CD71Cistanchehat ein gewisses Potenzial für die Behandlung oder adjuvante Behandlung von Leukämie.Mitogen-aktivierte Proteinkinasesysteme (MAPKs) werden in allen eukaryotischen Zellen exprimiert.

Cistanche-Tabletten zur Verbesserung des Immunsystems bei der Behandlung von Leukämie

Es ist ein sehr wichtiger Informationsübertragungsweg, der die extrazelluläre Stimulationssignaltransduktion zur intrazellulären leitet und aus Serin/Threonin-Proteinkinasen, einschließlich ERK, JNK und p38MAPK, besteht. Seine Phosphorylierung und Dephosphorylierung sind Schalter von Zelllebensaktivitäten und sind beteiligt und regulieren den Prozess des Zellwachstums, der Proliferation, der Differenzierung, der Aktivierung und der Apoptose. Diese Studie legt nahe, dass die JNK-Dephosphorylierung an der CDP-induzierten T-Zell-Apoptose beteiligt ist, während die ERK-Phosphorylierung an den beiden Prozessen beteiligt ist, da CDP die Zellproliferation hemmt und Apoptose induziert.

Abschließend,Cistanche CDPhat eine zytotoxische Wirkung auf die T-Lymphozyten-Leukämie-Zelllinie Jurkat, was zeigt, dass niedrige Konzentrationen (unter 2 mg/ml) die Zellproliferation hemmen, während hohe Konzentrationen (5 mg/ml) Apoptose induzieren.Cistanche CDPinduziert Apoptose in Jurkat-Zellen hauptsächlich durch Beeinflussung und Veränderung von Zellen.

Die Expression der mit Apoptose in Verbindung stehenden Rezeptoren CD71 und CD45 auf der Membranoberfläche überträgt Signale ins Zellinnere, was eine weitere ERK-Phosphorylierung und JNK-Dephosphorylierung und schließlich die Aktivierung von Caspase-9 bewirkt, die wiederum Caspase{{4} aktiviert. } um Apoptose zu induzieren.