Cistanche kann Nieren-Ischämie-Reperfusionsverletzungen schützen

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Jan H. Lindeman1, Leonie G. Wijermars1, Sarantos Kostidis2, Oleg A. Mayboroda2, Amy C. Harms3, & et al.

Verzögerte Transplantatfunktion ist dieManifestation einer Ischämie-Reperfusionsverletzungim Rahmen einer Nierentransplantation. Während Hunderte von InterventionenIschämie-Reperfusionsverletzung erfolgreich reduzierenin experimentellen Modellen sind alle klinischen Interventionen fehlgeschlagen. Diese explorative klinische Bewertung untersuchte mögliche metabolische Ursprünge klinischer Ischämie-Reperfusionsverletzungen und kombinierte Daten aus 18 Gewebebiopsien vor und nach der Reperfusion mit 36 ​​aufeinanderfolgenden arteriovenösen Blutentnahmen über dem Transplantat in drei Studiengruppen. Diese Gruppen umfassten lebende und verstorbene Spendertransplantate mit und ohne verzögerte Transplantatfunktion. Die Gruppenzuteilung basierte auf den klinischen Ergebnissen. Magic-Winkel-NMR wurde für die Gewebeanalyse verwendet und auf Massenspektrometrie basierende Plattformen wurden für die Plasmaanalyse verwendet. AlleNierenwaren für ein Jahr funktionsfähig. Die Integration von Metabolomikdaten identifizierte ein diskriminierendes Profil, um eine zukünftige verzögerte Transplantatfunktion zu erkennen. Dieses Profil war durch einen ATP/GTP-Katabolismus nach der Reperfusion (signifikant beeinträchtigte Phosphokreatin-Erholung und signifikante anhaltende (Hypo)xanthin-Produktion) und signifikante anhaltende Gewebeschädigung gekennzeichnet. Trotz aktivierter Glykolyse, Fettsäureoxidation, Glutaminolyse und Autophagie kam es zu einer fehlgeschlagenen Hochenergie-Phosphatrückgewinnung, die mit einem Defekt auf der Ebene des Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplexes im Krebs-Zyklus zusammenhängt. Klinisch verzögerte Transplantatfunktion aufgrund einer Ischämie-Reperfusionsverletzung in Verbindung mit einem Stoffwechselkollaps nach der Reperfusion. Daher sollten sich Bemühungen, die verzögerte Transplantatfunktion aufgrund einer Ischämie-Reperfusionsverletzung zu löschen, auf die Erhaltung der metabolischen Kompetenz konzentrieren, entweder durch Bewahrung der Integrität des Krebs-Zyklus und/oder durch die Rekrutierung von metabolischen Rettungswegen. Kidney International (2020) 98, 1476–1488; https://doi.org/10.1016/j.kint.2020.07.026

SCHLÜSSELWÖRTER: ATP; verzögerte Transplantatfunktion; Glykolyse; Ischämie-Reperfusionsverletzung; Stoffwechsel; oxidative Phosphorylierung

Cistanche-Effekte: verhindernIschämie-Reperfusionsverletzung

Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI)ist das Phänomen der erhöhten Gewebeschädigung nach Reperfusion von zuvor ischämischem Gewebe.1,2 Es ist der Hauptverursacher von Organschäden nach Myokard- oder Hirninfarkten3 und Transplantatschäden nach Organtransplantationen.4 Obwohl unzählige Eingriffe IRI in präklinischen Modellen unterdrücken, bleibt der klinische Erfolg bestehen zu erreichen.3,4 Somit scheint es eine Übersetzungslücke zwischen präklinischen Modellen und dem klinischen Kontext zu geben.

Verzögerte Transplantatfunktion (DGF) ist die Manifestation von IRI in der Einstellung vonNiereTransplantation.5 DGF ist definiert als die Notwendigkeit einer Dialyse in der ersten Woche oder Wochen nach der Transplantation.6 Obwohl DGF im Zusammenhang mit Lebendspende-Transplantationsverfahren extrem selten ist, betrifft es bis zu 90 Prozent der Transplantationen verstorbener Spender.6 Früher Die Arbeit zeigte einen Zusammenhang zwischen auftretendem DGF und normoxischer Glykolyse nach der Reperfusion.7 Diese Beobachtung impliziert, dass DGF mit einem Defekt in der Transplantatenergiehomöostase als Folge einer mitochondrialen Dysfunktion in der Reperfusionsphase zusammenhängt.7 Auf dieser Grundlage stellten wir die Hypothese auf, dass klinisches DGF beteiligt ist und kann durch einen Stoffwechseldefekt (oder Defekte) getrieben werden. Das Ziel dieser Studie war es, eine eingehende Analyse der metabolischen Reaktionen auf durchzuführenIschämie-Reperfusionmit und ohne IRI (DGF). Diese explorative metabolische Bewertung basiert auf einem integrierten, zeitaufgelösten Ansatz, der eine sequentielle Bewertung der Unterschiede in der arteriovenösen Konzentration (AV) bei reperfundierten Transplantaten und eine parallele Profilerstellung von Transplantat-(Gewebe-)Biopsien umfasste. Drei Studiengruppen wurden eingeschlossen: Transplantate von verstorbenen Spendern mit und ohne spätere IRI und lebende Spendertransplantate. Die Gruppenzuordnung von Transplantaten verstorbener Spender (þDGF bzw. –DGF) erfolgte retrospektiv auf der Grundlage ihres klinischen Ergebnisses. Transplantate lebender Spender wurden als Referenz eingeschlossen, da diese Transplantate mit einer sofortigen funktionellen Wiederherstellung nach der Reperfusion verbunden sind. Um die primären Aspekte der metabolischen Homöostase abzudecken, lag der Fokus in dieser Studie auf den folgenden groben metabolischen Clustern: Nukleotidtriphosphat-Metabolismus, Fettsäure(b)-Oxidation, Glykolyse/Glutaminolyse, Autophagie, Krebszyklus (Defekte) und Zellschädigung. Die Daten werden entsprechend dargestellt.

(Korrespondenz: Jan H. Lindeman, Department of Surgery, Leiden University Medical Center, PO Box 9600, 2300 RC Leiden, Niederlande. E-Mail: Lindeman@lumc.nl Eingegangen am 20. Januar 2020; überarbeitet am 8. Juni 2020; angenommen am 2. Juli 2020; online veröffentlicht am 8. August 2020)

Cistanche-Effekte: verhindernIschämie-Reperfusionsverletzung

ERGEBNISSE

Die Studienstichprobe umfasste 53 Patienten. Bei 18 Patienten wurden gepaarte Gewebebiopsien entnommen, und bei 36 Patienten wurde eine sequentielle AV-Probenentnahme durchgeführt. Bei einem Patienten wurden beide Biopsien entnommen und es wurde eine AV-Probenentnahme durchgeführt. Klinische Details für die 3 Studiengruppen sind in den Ergänzungstabellen S1A (Gewebebiopsien) und S1B (AV-Probenentnahme) dargestellt. Alle DGF-Fälle erforderten mehrere Dialysen über einen Zeitraum von mindestens 7 Tagen, und alle zeigten eine angemessene funktionelle Erholung. Keiner der verstorbenen Spender ohne DGF benötigte nach der Transplantation eine Dialyse. Das Transplantatüberleben nach einem Jahr betrug 100 Prozent.

Wir untersuchten zunächst mutmaßliche Unterschiede in den metabolischen Signaturen für die 3 Spendergruppen (die lebenden [Referenz] Spendertransplantate, die –DGF verstorbenen Spendertransplantate und þDGF [IRI] verstorbene Spendertransplantate), indem wir das Plasmametabolom (AV-Unterschiede) für die { {1}} Minuten nach der Reperfusion (Abbildung 1a) und dieGewebe Metabolom(Gewebebiopsien) für den Zeitpunkt 40- Minuten nach der Reperfusion (Abbildung 1b). Diese Zeitpunkte wurden gewählt, um Störungen durch Auswaschen von Metaboliten zu vermeiden, die sich während Ischämie oder Kühllagerung angesammelt haben oder die Bestandteile der Konservierungsflüssigkeit waren (z. B. Histidinauswaschung aus lebenden Spendertransplantaten; ergänzende Abbildung S1 zeigt die selektive Verwendung von H [Histidin] TK-Konservierungsflüssigkeit in diesen Transplantaten).7 Die Ergebnisse (z-Scores) für diese Zeitpunkte sind in den Wärmekarten in Abbildung 1a (AV-Unterschiede) und 1b (Gewebe) zusammengefasst. Die Gruppierung der Daten erfolgte nach den 6 Clustern, die alle Stoffwechseldaten abdecken: (i) Nukleosidtriphosphat-Katabolismus, (ii) b-Oxidation, (iii) Glykolyse/Glutaminolyse, (iv) Autophagie, (v) Krebszyklus-Defekte, und (vi) Zellschädigung.

Wärmekarten für die AV-Unterschiede zeigen parallele metabolische Signaturen für die lebenden Spender- und –DGF-Transplantate und eine deutlich unterscheidbare Signatur für die þDGF-Transplantate (Abbildung 1a). Ein ähnliches, wenn auch weniger ausgeprägtes Muster wurde für die Gewebemetaboliten beobachtet (Abbildung 1b). Die ausschließliche Kartierung von –DGF- und þDGF-Transplantaten (ohne das Lebendspender-Transplantat) führte zu ähnlichen Schlussfolgerungen (nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass die Einbeziehung der Lebendspender-(Referenz-)Daten in die Analyse die Schlussfolgerungen der Analyse nicht beeinträchtigte. Zusammen liefern die Daten eine grobe metabolische Signatur für Nieren-IRI.

Der Übersichtlichkeit halber werden die Daten der einzelnen Metaboliten bezogen auf die 6 Stoffwechselcluster dargestellt. Um Störungen durch das anfängliche Auswaschen von Metaboliten zu vermeiden, die sich während der Kühllagerung innerhalb der ersten Minuten der Reperfusion angesammelt haben, basieren die Schätzungen für die Nettofreisetzung oder -aufnahme nach der Perfusion auf der Integration der AV-Unterschiede für 10- bis {{3 }}Minuten Zeitintervalle nach der Reperfusion (Fläche zwischen den Kurven).

Der erste Cluster von Metaboliten ("Nukleosid-Triphosphat-Katabolismus") signalisiert aanhaltende PostreperfusionStoffwechselinkompetenz ("Power Shutdown") bei Transplantaten mit späterem DGF (þDGF). Diese Schlussfolgerung basiert auf einer beeinträchtigten Wiederherstellung des hochenergetischen Phosphatpuffers Phosphokreatin nach Reperfusion in þDGF-Transplantaten (P < 0.001;="" abbildung="" 2a)="" und="" durch="" anhaltende="" post="" -reperfusion="" adenosintriphosphat/guanosintriphosphat="" (atp/gtp)-katabolismus.="" letzteres="" spiegelt="" sich="" in="" der="" fortgesetzten="" freisetzung="" (av-unterschiede)="" von="" hypoxanthin="" und="" xanthin="" wider="" (fig.="" 2b="" und="" c,="" p="">< 0,0001="" bzw.="" 0,02),="" den="" terminalen="" abbauprodukten="" von="" atp="" und="" gtp="" aus="" diesen="" transplantaten.="" die="" daten="" für="" die="" gewebebiopsien="" vor="" der="" reperfusion="" zeigten="" abgestufte="" grade="" der="" inosin-="" und="" hypoxanthinakkumulation="" am="" ende="" der="" ischämischen="" lagerungsperiode,="" wobei="" der="" niedrigste="" gehalt="" in="" lebenden="" und="" der="" höchste="" in="" verstorbenen="" spendertransplantaten="" gefunden="" wurde="" (abbildung="" 2d="" und="" e).="" post-reperfusion="" (t="" ¼="" 40="" min)="" hypoxanthin-="" und="" inosin-gewebegehalte="" waren="" ähnlich="" und="" niedrig="" in="" allen="" 3="" spendergruppen="" (abbildung="" 2d="" und="">

Der ATP-Katabolismus nach der Reperfusion in þDGF-Transplantaten trat trotz einer offensichtlichen Wiederherstellung der Fettsäure-b-Oxidation (ergänzende Abbildung S2), der aktivierten Glykolyse/Glutaminolyse (Abbildung 3) und der Autophagie (Abbildung 4) nach der Reperfusion auf. Alle 3 Transplantattypen zeigten eine einheitliche Wiederherstellung des Gehalts an b-Hydroxybutyrat im Gewebe (ergänzende Abbildung S2A) und eine selektive Clearance (Aufnahme) von mittelkettigen Fettsäuren (C8–C12) aus dem Kreislauf (ergänzende Abbildungen S1 und S2B–E), was auf eine Einheitlichkeit hinweist Wiederherstellung der b-Oxidation. Die Gewebeakkumulation von Acetylcarnitin in den –DGF- und þDGF-Transplantaten verstorbener Spender (ergänzende Abbildung S2F) und das Auswaschen (AV-Unterschiede) von Acetylcarnitin aus þDGF-Transplantaten (ergänzende Abbildung S2G, P <0.03) implizieren="" abgestufte="" defekte="" bei="" der="" entsorgung="" von="" dabei="" gebildeten="">

Cistanche-Kraut

Die Kartierung von Glykolyse/Glutaminolyse-Netzwerken (Abbildung 3) zeigte gleiche Gewebeglukosespiegel (Abbildung 4a) und bestätigte eine anhaltende normoxische Glykolyse nach der Reperfusion als exklusives Merkmal von þDGF-Spendertransplantaten (nämlich anhaltende Laktat- und Pyruvatfreisetzung (Abbildung 3b und c, P<0.0001 and=""><0.04, respectively)="" and="" release="" of="" the="" transamination="" products="" alanine="" and="" aspartate="" (figure="" 3e="" and="" f,="" p="" <="" 0.02="" and="" <="" 0.0001,="" respectively).="" serine="" (figure="" 4b)="" and="" phosphoserine="" (supplementary="" figure="" 3d)="" released="" from="" þdgf="" grafts="" may="" (partially)="" reflflect="" transamination="" of="" the="" glycolysis="" intermediate="" phosphoglycerate.="" persistent="" post-reperfusion="" glutamate="" release="" (figure="" 3k,="" p="" <="" 0.002),="" selective="" release="" of="" the="" transamination="" products="" alanine="" and="" aspartate="" (figure="" 3e="" and="" f),="" and="" exhaustion="" of="" the="" tissue="" asparagine="" pool="" (figure="" 3j,="" p="" <="" 0.03)="" in="" þdgf="" grafts="" imply="" continued="" post-reperfusion="" glutaminolysis="" (alanine)="" and="" glutamine="" shuttling="" (asparagine="" aspartate)8="" in="" the="" post-reperfusion="" phase="" of="" these="" grafts.="" moreover,="" the="" exclusive="" release="" of="" serine,="" methionine,="" and="" tyrosine="" (figure="" 4a–c,="" all="" ps="" <="" 0.0005),="" along="" with="" disposal="" of="" butyryl="" carnitine="" and="" isovaleryl="" carnitine="" (figure="" 4d="" and="" e,="" p=""><0.006 and=""><0.003, respectively),="" deamination="" products="" of="" the="" branched-chain="" amino="" acids9,10="" from="" þdgf="" grafts,="" but="" not="" from="" the="" other="" graft="" types="" (figure="" 4a–e),="" implies="">PostreperfusionAutophagie in diesen Grafts.11.

Abbildung 1|Geclusterte Wärmekarten für die arteriell-venösen Metabolitenkonzentrationsunterschiede über das Spendertransplantat 30 Minuten und Gewebemetabolitengehalte 40 Minuten nach Reperfusion. (a) Geclusterte Heatmap für die arteriell-venösen Metabolitenkonzentrationen bei t ¼ 30 Minuten nach Reperfusion. Die Spalten repräsentieren die 3 Spendergruppen (lebende Spendertransplantate [Referenzgruppe, n ¼ 10]; verstorbene Spendertransplantate ohne spätere verzögerte Transplantatfunktion [DGF {–DGF, n ¼ 10}] und verstorbene Spendertransplantate mit späterer DGF [þDGF, n ¼ 16]). Die Verbindungen werden gemäß den 5 metabolischen Clustern geclustert und innerhalb jedes Clusters basierend auf dem Z-Score der Gruppe der Lebendspender geordnet. Grün gibt die Nettoaufnahme durch das Transplantat wieder und Rot gibt die Nettofreisetzung aus dem Transplantat wieder. (Fortsetzung)

Abbildung 1 (Fortsetzung) (b) Geclusterte Heatmap für Gewebemetaboliten, die in der Kernspinresonanzanalyse mit HR-magischem Winkel von Transplantatbiopsien identifiziert wurden, die 40 Minuten nach der Reperfusion entnommen wurden. Die Spalten repräsentieren die 3 Spendergruppen (lebende Spendergruppe [Referenzgruppe, n ¼ 6, verstorbene Spendertransplantate ohne spätere DGF [–DGF, n ¼ 6] und verstorbene Spendertransplantate mit späterer DGF [þDGF, n ¼ 6]). Rot gibt einen Gewebegehalt oberhalb und Grün einen Gewebegehalt unterhalb des geometrischen Mittels der 3 Gruppen wieder.

Acetylcarnitin-Akkumulation (Gewebe) nach der Reperfusion in –DGF- und þDGF-Transplantaten (Abbildung 2f) und anfängliche (lebende Spender- und –DGF-Transplantate) und fortgesetzte (þDGF-Transplantate) Acetylcarnitin-Freisetzung (P < 0).{{10="" }}3)="" weisen="" auf="" eine="" vorübergehende="" (–dgf-transplantate)="" oder="" anhaltende="" (þdgf-transplantate)="" beeinträchtigte="" acetyl-coenzym-a-entsorgung="" nach="" reperfusion="" hin="" (ergänzende="" abbildung="" 2g).="" obwohl="" diese="" akkumulation="" aus="" einer="" übertriebenen="" glykolyse="" und="" b-oxidation="" resultieren="" kann,="" kann="" sie="" auch="" auf="" eine="" beeinträchtigte="" acetyl-entsorgung="" als="" folge="" von="" krebszyklus-defekten="" hindeuten.="" bei="" þdgf-transplantaten="" wird="" letzterer="" mechanismus="" durch="" die="" selektive="" und="" anhaltende="" freisetzung="" des="" krebszyklus-zwischenprodukts="" a-ketoglutarat="" (abbildung="" 5c,="" p="">< 0,0005)="" als="" exklusives="" merkmal="" in="" diesen="" transplantaten="" und="" durch="" eine="" beeinträchtigte="" erholung="" von="" gewebesuccinat="" in="" den="" þdgf-transplantaten="" unterstützt="" (abbildung="">

Ein letztes Cluster diskriminierender Metaboliten bezieht sich auf andauernde Zellschäden. Zu diesem Cluster gehören diePostreperfusionFreisetzung von Uracil, einem etablierten Marker für Zellschäden12,13 (Ergänzende Abbildung S3A, P <0.0001) und="" von="" aminosäurederivaten,="" die="" damit="" assoziieren="" die="" hydrolyse="" von="" plasmalogenen="" (nämlich="" phosphoethanolamin,="" ethanolamin="" und="" phosphoserin;="" ergänzende="" abbildung="" s3bd,="" p=""><0.001; ergänzende="" abbildung="" s1).="" obwohl="" in="" der="" þdgf-gruppe="" keine="" av-unterschiede="" für="" cholin="" vorhanden="" waren="" (p="0,60)," steht="" diese="" beobachtung="" im="" gegensatz="" zu="" einer="" netto-cholinaufnahme="" in="" der="" lebendspender-="" und="" –dgf-gruppe="" (p="">< 0,0001="" bzw.="" 0,02).="" daher="" kann="" in="" &bgr;dgf-transplantaten="" die="" hydrolyse="" von="" cholin-plasmalogenen="" durch="" die="" aufnahme="" von="" cholin="" maskiert="" werden.="" ein="" solcher="" mechanismus="" wird="" durch="" die="" selektive="" und="" fortschreitende="" freisetzung="" von="" betain,="" dem="" oxidationsprodukt="" von="" cholin14="" in="" der="" þdgf-gruppe,="" unterstützt="" (ergänzende="" abbildungen="" s3g,="" p=""><>

Die vorangegangenen Beobachtungen assoziieren Vorfall-IRI mit persistentPostreperfusionATP-Katabolismus und anhaltende Zellschädigung im Zusammenhang mit mitochondrialem Versagen und Aktivierung von glykolytischen und lipolytischen Signalwegen (Abbildung 6). In Anbetracht der lebenswichtigen Rolle von ATP bei der zellulären Homöostase und dem Überleben wurde argumentiert, dass die Rekrutierung zusätzlicher ATP-regenerativer Wege (d. h. unabhängig von der mitochondrialen Atmung) vorteilhaft wäre. In diesem Zusammenhang betrachteten wir Inosin, ein Nukleosid, das ATP auf nicht-traditionellen Wegen erzeugen kann. Wie in 7 gezeigt, rettete weder die präventive noch die rettende Inosinzufuhr (in Konzentrationen bis zu 10 mMol/l) die ATP-Erschöpfung nach einer chemisch induzierten metabolischen Lähmung.

Abbildung 3|Glykolyse und Glutaminolyse nach der Reperfusion. Kurven für die arteriell-venösen Unterschiede (rote Kurve ist arteriell, die blaue Kurve ist venös). Gewebebiopsien (Balkendiagramme): weiße Balken stellen Biopsien vor der Reperfusion dar; graue Balken stellen Post-Reperfusionsbiopsien dar (t ¼ 40 min nach Reperfusion). *P < 0,05.="" (a)="" gewebeglukosegehalt.="" (b–i)="" glykolyse-zwischenprodukte:="" laktat,="" pyruvat,="" alanin,="" aspartat="" und="" asparagin.="" (k,="" l).="" glutaminolyse="" vermittelt="" glutamin="" und="" glutamat.="" gewebe-kernspinresonanz="" (nmr;="" n="" ¼="" 6="" pro="" gruppe):="" (a)="" gewebe-glucose-gewinnung="" beim="" lebenden="" spender.="" (d,="" f,="" h)="" stabile="" laktat-,="" alanin-="" und="" aspartat-gewebeinhalte="" spiegeln="" das="" auswaschen="" dieser="" zwischenprodukte="" wider="">

Abbildung 3 (Fortsetzung) von der Niere. (j) Nicht messbares Gewebe-Asparagin in Biopsien mit verzögerter Transplantatfunktion (DFG) nach Reperfusion. Arteriell-venöse (AV) Konzentrationsunterschiede (n ¼ 10, 10 und 16 in den lebenden, –DGF- bzw. þDGF-Gruppen): (b,c) anhaltendes Laktat nach Reperfusion (P < 0.0001)="" und="" pyruvat="" (p="">< 0,04)="" aus="" diesen="" transplantaten="" freigesetzt.="" (e)="" alanin="" (p="">< 0,02),="" (g)="" asparaginsäure="" (p="">< 0,0001)="" und="" (þk)="" glutamatfreisetzung="" (verzögerte="" transplantatfunktion="" (dgf-transplantate="" weisen="" auf="" normoxische="" glykolyse="" in="" p="">< 0,002="" hin)="" aus="" þdgf-transplantaten="" weisen="" auf="" eine="" fortschreitende="" glutaminoxidation="" hin="" diese="" transplantate.es="" wurden="" keine="" signifikanten="" av-unterschiede="" für="" glutamin="" (i)="">

Cistanche-Effekte: verhindernNierenerkrankungen

DISKUSSION

Aus dieser Studie, die im Zusammenhang mit klinischer Nierentransplantation durchgeführt wurde, ergibt sich das Bild, dass IRI (DGF) eine Folge eines fast sofortigen und anhaltenden Ausfalls der oxidativen Phosphorylierung und der aktivierten normoxischen Glykolyse nach der Reperfusion ist, die nicht in der Lage ist, die Energiehomöostase aufrechtzuerhalten. Im Gegenzug werden die energiereichen Phosphatvorräte zunehmend erschöpft, und die Zellintegrität kann nicht erhalten werden, was zu anhaltenden Gewebeschäden führt.

Diese klinische Studie basiert auf der Integration von Stoffwechseldaten, die aus Gewebebiopsien stammen, die unmittelbar vor und 40 Minuten nach der Reperfusion entnommen wurden, und aus der sequentiellen Bewertung der AV-Unterschiede über das reperfundierte Transplantat. Diese AV-Unterschiede liefern nicht nur einen Hinweis auf das Tempo und die Dauer metabolischer (Fehl-)Anpassungen, sondern ermöglichen auch Richtungstrends, die in den gepaarten Gewebebiopsien beobachtet werden, und eine Beurteilung der Metaboliten-Clearance von (z. B. Laktat) oder Aufnahme aus (z. B. Medium). -kettige Fettsäuren) in den Kreislauf.15,16 Die Auflösung des AV-Ansatzes wird deutlich durch die Acylcarnitin-Daten veranschaulicht, die nicht nur eine selektive Aufnahme von mittelkettigen Fettsäuren zeigen, sondern auch darauf hindeuten, dass die ungesättigten C14-Carnitin-Spezies Tetradecenoyl- und Tetradecadienyl-Carnitin sind verhalten sich ähnlich wie mittelkettige Fettsäuren (ergänzende Daten S1) und sind möglicherweise nicht auf spezifische Fettsäuretransporter angewiesen.17 Tatsächlich wurde im Prozess der Datenanalyse beobachtet, dass das alleinige Vertrauen auf Gewebebiopsien die meisten Schlussfolgerungen in dieser Studie verschleiert hätte weil die Mehrzahl der gebildeten Metaboliten effizient in den Kreislauf ausgeschieden wird. Stabile arterielle Blutkonzentrationen zeigen, dass die Bluthomöostase aufrechterhalten wird und folglich freigesetzte oder absorbierte Metaboliten effektiv entsorgt oder an anderer Stelle wieder aufgefüllt werden.15,16 Beobachtete stabile Gewebeinhalte, aber deutliche AV-Unterschiede stellen die Gültigkeit von gewebebasierten metabolomischen Bewertungen in Frage. Beachten Sie, dass im Zusammenhang mit den Nieren verstorbener Spender und dem Zeitrahmen der Studie die Harnausscheidung kein störender Faktor ist, da alle Transplantate verstorbener Spender für das Messintervall von 40- Minuten anurisch waren.

Die Kartierung der Daten identifiziert einen metabolischen Fußabdruck, der für IRI vollständig diskriminierend ist. Insbesondere die Reperfusionsphase von Transplantaten mit zukünftigem DGF ist einheitlich und deutlich gekennzeichnet durch eine stark beeinträchtigte oxidative Phosphorylierung (histotoxische Hypoxie)18 und eine kompensatorische normoxische Glykolyse, die die ATP-Regeneration nicht aufrechterhalten kann. Die letztere Schlussfolgerung basiert auf der unvollständigen Wiederherstellung des hochenergetischen Phosphatpuffers Phosphokreatin19 und auf einem anhaltenden ATP/GTP-Katabolismus nach der Reperfusion, der sich in einer fortgesetzten (Hypo-)Xanthinfreisetzung widerspiegelt. Tatsächlich ist die Annäherung der Adenosinverluste für þDGF-Transplantate basierend auf der Hypoxanthinfreisetzung (AV-Unterschiede) in den 30 Minuten nach der Reperfusion (Annäherung basierend auf den gemeldeten Flussraten nach der Reperfusion, 20 DurchschnittNierengewebeKörpermasse21 und renaler ATP-Gehalt22) deutet auf eine nahezu Erschöpfung des ATP-Pools des Transplantats nach 30 Minuten hinPostreperfusion. Eine kritische Erschöpfung des ATP-Pools kann zu einem katabolischen Lockdown führen, der die Zelle unempfänglich für die Wiederherstellung der Protonen-motivierenden Kräfte macht, die die ATP-Erzeugung antreiben, wodurch die Zelle nicht mehr auf Rettungsstrategien reagiert.

Das ATP-Defizit nach der Reperfusion und die histotoxische Hypoxie in &bgr;DGF-Transplantaten können der selektiven Freisetzung von Aminosäuren zugrunde liegen, die mit der Hydrolyse von Phospholipiden (Plasmalogenen) in &bgr;DGF-Transplantaten verbunden sind. Experimentelle Studien identifizierten die Hydrolyse von Plasmalogenen und Phospholipiden als ein frühes Merkmal von Gewebehypoxie,23 und die Hydrolyse von Plasmalogenen wurde im Zusammenhang mit ischämischer Nierenschädigung beschrieben.24 Mechanistisch wurde dieses Phänomen mit einer Membrantranslokation und Aktivierung eines zytosolischen Calcium- unabhängige Phospholipase A2, die aus der hypoxiegetriebenen Komplexbildung zwischen Phospholipase und einem Phosphofructokinase-Regulationselement resultiert.25,26 Die Aufhebung der Hypoxie oder ATP-Behandlung dissoziiert den Phospholipase-Phosphofructokinase-Komplex und hebt die Phospholipase-Aktivität auf. Beachten Sie, dass die Dynamik der Postreperfusionseinstellung der (Phospho-)Ethanolaminfreisetzung aus lebenden Spendern und –DGF-Transplantaten sowie die anhaltende Freisetzung in þDGF-Transplantaten unterschiedliche Grade und Geschwindigkeiten der metabolischen Erholung widerspiegeln können. Während jedoch frühere Berichte eine Rolle einer zytosolischen calciumunabhängigen Phospholipase A2,25,26 implizieren, deuten beobachtete AV-Unterschiede für Betain und (Phospho-)Ethanolamin auf eine umfassendere Aktivierung von Phospholipasen hin, an der auch Phospholipasen vom Typ C (Phosphoethanolamin) beteiligt sind. und D-Phospholipasen (Ethanolamin/Cholin). In ähnlicher Weise kann der Abbau von Gewebe-Asparagin (Abbildung 4j) und die Freisetzung von Aspartat (Abbildung 4g) aus βDGF-Transplantaten eine beeinträchtigte Asparagin-Synthase-Aktivität aufgrund von ATP-Abbau widerspiegeln.

Abbildung 4|Aktivierte Post-Reperfusions-Autophagie in DGF-Transplantaten (delayed graft function).. Kurven für die arteriell-venösen Unterschiede (rote Kurve ist arteriell, die blaue Kurve ist venös). Gewebebiopsien (Balkendiagramme): weiße Balken stellen Biopsien vor der Reperfusion dar; graue Balken stellen Post-Reperfusionsbiopsien dar (t ¼ 40 min nach Reperfusion). *P < 0,05.="" (a–c)="" freisetzung="" von="" methionin,="" serin="" und="" tyrosin="" nach="" der="" reperfusion="">

Abbildung 5|Krebszyklus-Defekt nach Reperfusion bei Transplantaten mit zukünftig verzögerter Transplantatfunktion (DGF). Kurven für die arteriell-venösen Konzentrationsunterschiede (AV) (rote Kurve ist arteriell, blaue Kurve ist venös). Gewebebiopsien (Balkendiagramme): weiße Balken stellen Biopsien vor der Reperfusion dar; graue Balken stellen Post-Reperfusionsbiopsien dar (t ¼ 40 min nach Reperfusion). *P < {{10}}.05.="" (a–h)="" av-unterschiede="" für="" die="" zwischenprodukte="" des="" krebszyklus="" (n="10," 10="" und="" 16="" in="" den="" lebenden,="" –dgf-="" bzw.="" þdgf-gruppen):="" anhaltende="" freisetzung="" von="" a-ketoglutarat="" (aus="" þdgf-transplantaten;="" p="">< 0,001)="" .="" (e,g)="" fehlende="" gewebe-succinat-erholung="" nach="" der="" reperfusion="" in="" &bgr;dgf-transplantaten="" (p=""><>

Der ATP-Katabolismus nach Reperfusion in þDGF-Transplantaten trat trotz umfassender Aktivierung katabolischer Wege auf: Glykolyse, b-Oxidation von mittelkettigen Fettsäuren (in allen Transplantattypen einheitlich aktiviert), Glutaminolyse (ebenfalls vorübergehend aktiviert bei Reperfusion in lebenden Spender- und –DGF-Transplantaten ) und aktivierte Autophagie. Tatsächlich wurden die Freisetzung von Isovaleryl- und Butyrylcarnitin nach der Reperfusion, Desaminierungsprodukte der verzweigtkettigen Aminosäuren Isoleucin und Leucin,11 als diskriminierende Biomarker für zukünftiges DGF identifiziert.

Die andauernde Freisetzung von Acetylcarnitin und Pyruvat aus þDGF-Transplantaten zeigt, dass die durch die aktivierten katabolischen Stoffwechselwege erzeugten Flüsse die oxidative Kapazität überstiegen. Die Freisetzung von Ketoglutarat nach der Reperfusion, die Nettoaufnahme des Citrats und Isocitrats seines Vorläufers aus dem Kreislauf und die mangelhafte Wiederherstellung von Succinat im Gewebe implizieren, dass die beeinträchtigte oxidative Phosphorylierung einen Defekt auf der Ebene des Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplexes beinhaltet. Insbesondere der beobachtete metabolische Fußabdruck und der Zeitrahmen der Stoffwechselstörungen weisen nicht auf eine Rolle der umgekehrten Lenkbarkeit des Krebszyklus27,28 bei anhaltender metabolischer Dysregulation hin, was einen weiteren Beweis dafür liefert, dass der beobachtete Mechanismus für IRI bei Nagetieren28 nicht vollständig auf den Menschen übertragbar ist Kontext.29.

Eine beeinträchtigte Oxoglutarat-Dehydrogenase-Aktivität kann durch eine Ischämie-bedingte Schädigung des Komplexes30 verursacht werden, kann aber auch eine Beeinträchtigung beinhalten oder durch eine solche übertrieben werdenPostreperfusionEine beeinträchtigte Oxoglutarat-Dehydrogenase-Aktivität kann durch eine Ischämie-bedingte Schädigung des Komplexes30 verursacht werden, kann aber auch eine beeinträchtigte Verfügbarkeit seiner Cofaktoren Acetyl-Coenzym A, FADþ und NADþ nach der Reperfusion beinhalten oder dadurch verstärkt werden. 31 Bei þDGF-Transplantaten könnten solche Mängel aufgrund einer Auswaschung von Acetyl-Coenzym A nach der Reperfusion und eines beeinträchtigten zellulären Redoxstatus (reduktiver Stress mit beeinträchtigter NADþ-Verfügbarkeit) auftreten, eine Vorstellung, die durch das niedrige Laktat-zu-Pyruvat-Verhältnis in þDGF-Transplantaten gestützt wird. 32.

Dieser metabolische Ansatz erlaubt keine Bewertung der Beteiligung der Atmungskette. Wir haben jedoch früher Ischämie-Reperfusionsbedingte Defekte in beiden Atmungskomplexen I und II identifiziert.7,29 Auf der Grundlage der Daten in dieser Studie und früherer mitochondrialer Arbeiten ergibt sich das Bild einer klinischen renalen IRI als Folge einer primären (oder Hervorrufen) von Beleidigung(en) des mitochondrialen Krebszyklus-Redox-Shuttles, der vor oder innerhalb der ersten Minuten der Reperfusion auftritt. Das Versäumnis, die ATP-Spiegel wiederherzustellen, führt zu einer anhaltenden und umfassenden Aktivierung katabolischer Stoffwechselwege, die die Energiekrise durch fortschreitende Erschöpfung des zellulären NADþ- und FADþ-Pools (reduktiver Stress) aufrechterhalten . Im Gegensatz zu Adenosin34 ist Inosin im Plasma stabil; es wurde als alternative ATP-Quelle in obligaten glykolytischen Zellen (dh Zellen ohne Mitochondrien) wie Erythrozyten35 und in hypoxischen Nierenzellen36 identifiziert und ist nach Reperfusion erschöpft. Leider konnte die Inosin-Supplementierung die zelluläre ATP-Verarmung nach einer erzwungenen Stoffwechselabschaltung nicht retten, was wenig Raum für metabolische Rettungsstrategien ließ, die darauf abzielten, IRI zu löschen, was die Abhängigkeit von präventiven Strategien zur Begrenzung von IRI betont.

Nierencistanche tonisieren

Es gibt Einschränkungen für diese Studie. Aufgrund einer Vielzahl von Vergleichen ist das Potenzial für aussagekräftige Zufallsbefunde im Rahmen von Mehrfachvergleichen hoch. Obwohl unsere Schlussfolgerungen durch solide biologische Beziehungen gestützt werden, können die Ergebnisse durch Probleme im Zusammenhang mit mehreren Vergleichen verfälscht werden.

Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass die Studie auf klinischen Proben basiert; als solches war das für die direkte Beurteilung des ATP- und Redox-Status erforderliche Klemmen-Einfrieren nicht möglich. Da sich das beobachtete Metabolom deutlich von dem in Tiermodellen berichteten unterscheidet und ein Systemversagen widerspiegelt, waren wir nicht in der Lage, detailliertere Bewertungen in Tiermodellen oder Ex-vivo-Systemen wie dem Respirometriesystem durchzuführen. Die Ergebnisse dieser Studie sind für dieNiere; daher können Schlussfolgerungen für andere Organe anders sein. Das relativ hohe Spenderalter in dieser Studie spiegelt die Spenderpopulation in den Niederlanden wider. Wichtig ist, dass die 10--Jahres-Transplantationsergebnisse in den Niederlanden mindestens genauso hoch sind wie in Ländern mit jüngeren Spendern, wie z. B. den Vereinigten Staaten.37 Erwartungsgemäß handelte es sich bei der Mehrheit der þDGF-Fälle um DCD-Transplantate. Uns ist ähnliches aufgefallenStoffwechselprofilefür DBD- und DCD-Transplantate; Die Aussagekraft dieser explorativen Studie ist jedoch offensichtlich zu gering, um subtile Unterschiede zwischen diesen beiden Spendertypen zu erkennen.

Abbildung 7|Sowohl die vorbeugende als auch die Notfall-Inosinbehandlung können die Adenosintriphosphat (ATP)-Spiegel nicht wiederherstellen. Die PK-1-Nierenzelllinie wurde stabil mit dem PercevalHR-Fluoreszenz-Biosensor für das Verhältnis von ATP zu Adenosindiphosphat (ADP) transfiziert.

Chemisch induzierte metabolische Paralyse wurde durch Zugabe von Rotenon/Actinomycin/2-Deoxyglucose induziert und das ATP-zu-ADP-Verhältnis (relative Fluoreszenz) wurde überwacht. Braun, Kontrolle; schwarz, Kontrolle der metabolischen Lähmung; grüne, präventive Inosinbehandlung (10 mMol/l); rot, Inosin-Rescue bei t ¼ 15 Minuten nach Induktion einer metabolischen Paralyse.

Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass einer klinischen renalen IRI ein fast augenblicklicher Stoffwechselkollaps und eine begleitende hochenergetische Phosphatkrise vorausgehen. Dieses tiefe und anhaltende Stoffwechseldefizit und seine unmittelbare Natur (und das daraus folgende minimale Fenster therapeutischer Möglichkeiten) werden jeden pharmazeutischen Eingriff stören, der auf der Verfügbarkeit von ATP beruht. Dies könnte die schlechte Übertragbarkeit präklinischer Befunde auf das klinische Umfeld erklären.2–4 Das beobachtete Metabolom von klinischem DGF steht in scharfem Kontrast zu berichteten Stoffwechselreaktionen bei Ratten,28 Mäusen38 und Schweinen39,40, die alle auf eine Wiederherstellung der oxidativen Phosphorylierung im Inneren hinweisen Minuten Reperfusion. Dies kann mit grundlegenden Unterschieden in der mitochondrialen oder metabolischen Physiologie zwischen Nagetieren und größeren Säugetieren zusammenhängen (z. B. kommt es nicht zu einer Ischämie-induzierten Succinatakkumulation in menschlichen Spendernieren).29 In diesem Zusammenhang ist es wichtig darauf hinzuweisen, dass alle transplantierten Nieren exponiert sind zuIschämie-Reperfusionund dass nur eine Untergruppe von Transplantaten IRI (DGF) entwickelt. Die Gruppenzuordnung (þDGF oder –DGF) in dieser Studie wurde retrospektiv durchgeführt und unterscheidet daher zwischen Ischämie-Reperfusion und IRI. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Ischämie-Reperfusion in experimentellen Modellen28,38–40 nicht ausreicht, um IRI auszulösen.

Trotz des erlittenen schweren Schadens erholten sich schließlich alle þDGF-Transplantate, was ein bemerkenswertes Erholungspotential impliziert, vorausgesetzt, dass Überbrückungsinterventionen (z. B. Dialyse) verfügbar sind. Obwohl ähnliche Metabolome für DGF in Transplantaten, die von nach Hirntod oder Herztod verstorbenen Spendern stammen, einen einheitlichen Mechanismus implizieren, gibt es bemerkenswerterweise einen gegensätzlichen Einfluss von DGF auf das langfristige Überleben des Transplantats für die beiden Spendertypen.41 Tatsächlich, obwohl DGF das Überleben von Transplantaten von Spendern, die nach dem Hirntod verstorben sind, eindeutig beeinflusst, bei solchen Transplantaten von Herzspendern nicht. Dieser Kontrast scheint ein überlegenes Erholungspotential von Transplantaten von Herztodspendern widerzuspiegeln.41

METHODEN

Die medizinische Ethikkommission des Leiden University Medical Center genehmigte das Studienprotokoll. Von jedem Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Diese monozentrische Studie umfasste 53 Patienten, die sich unterzogenNiereTransplantation: 37 wurden von verstorbenen Spendern und 16 von lebenden Spendern transplantiert. Auf der Grundlage des klinischen Ergebnisses (DGF) wurden Empfänger von verstorbenen Spendertransplantaten einer þDGF-Gruppe (n ¼ 16) oder –DGF-Gruppe (n ¼ 10) zugeordnet. DGF wurde durch die Notwendigkeit einer Dialyse in der ersten Woche nach der Transplantation definiert.6

Die Studie basiert auf einer Integration von Metabolomikdaten, die aus sequenziellen arteriovenösen (AV) Blutentnahmen während der ersten halben Stunde der Reperfusion und aus gepaarten Gewebebiopsien, die unmittelbar vor und 40 Minuten danach entnommen wurden, gewonnen wurden

Reperfusion.

Bei 36 Patienten wurde eine sequenzielle AV-Blutentnahme über dem Transplantat durchgeführt (Ergänzungstabelle S1A). Blutproben aus der Nierenvene wurden 30 s sowie 3, 5, 10, 20 und 30 Minuten und arterielle Proben 0, 10 und 30 Minuten nach der Reperfusion entnommen.42 Prä- und postreperfusionsgepaarte Nieren Biopsien wurden unmittelbar vor und 40 Minuten nach der Reperfusion von 6 lebenden und 12 verstorbenen Spendertransplantaten erhalten (Ergänzungstabelle S1B; bei 1 Patient wurden sowohl Biopsien als auch AV-Proben entnommen).

Gezielte Metabolomik-Analysen wurden unter Verwendung von Standardarbeitsanweisungen unter Verwendung etablierter Massenspektrometrie-basierter Plattformen oder Kernspinresonanz (Gewebebiopsien) mit magischem Winkel durchgeführt.43 Die von den Plattformen abgedeckten Metaboliten sind in der Ergänzungstabelle S1 zusammengefasst.

Das Potenzial von Inosin zur Behebung des Stoffwechseldefizits während eines Stoffwechselkollaps wurde in der proximalen Tubulus-Zelllinie (LLC PK1) getestet, die stabil mit dem fluoreszierenden ATP-Adenosindiphosphat-Biosensor PercevalHR transfiziert war.44.

Im Hinblick auf die Statistik wurden Heatmaps auf der Grundlage von Z-Scores für jeden erstelltMetabolit. Veränderungen innerhalb der Gruppe im Gehalt an Gewebemetaboliten wurden mit dem Mann-Whitney-Test und Unterschiede zwischen den Gruppen mit dem Wilcoxon-Test getestet. AV-Unterschiede wurden unter Verwendung eines linearen gemischten Modells geschätzt. Eine Korrektur für multiples Testen wurde nicht durchgeführt, da alle Beobachtungen Teil theoretischer Netzwerke waren. Einzelheiten zu Patienten und Methoden finden Sie in den ergänzenden Methoden.

Cistanche-Extrakt

OFFENLEGUNG

Alle Autoren erklärten keine konkurrierenden Interessen.

DANKSAGUNGEN

Die Magnetic Resonance Core Facility wird von der Medizinischen Fakultät der NTNU Trondheim, Norwegen, finanziert. Diese Studie wurde teilweise von der Dutch Kidney Foundation finanziert (Metabolic Salvage Strategies to Improve Transplant Outcome, project17O/11).

ERGÄNZUNGSMATERIAL

Ergänzende Datei (PDF)

Ergänzende Patienten und Methoden.

Tabelle S1. Patienten- und Transplantationscharakteristika der Verfahren, bei denen gepaarte Gewebebiopsien entnommen wurden (A) und bei denen AV-Probenentnahmen durchgeführt wurden (B).

Tabelle S2. Plattformen und ihre Metaboliten werden für AV-Proben verwendet.

Abbildung S1. Vollständige Metabolomdaten.

Abbildung S2. Wiederherstellung der b-Oxidation (mittelkettige Fettsäuren) nach Reperfusion.

Abbildung S3. Selektives und anhaltendes Post-Reperfusions-Washout von Uracil und Phospholipid (Plasmalogen)-assoziierten Aminosäuren aus Transplantaten mit zukünftigem DGF.

Datenergänzung 1. AV-Rohdaten für die Plattformen Acetylcarnitin, organische Säuren und Aminosäuren.

Datenergänzung 2. AV-Rohdaten für die Purin- und Pyrimidin-Plattform.

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