Cistanche Deserticola verbessert die Nervenzellenverletzung von Hippocampus bei Parkinson -Ratten durch Regulierung von Keap1/Nrf2/Ho -1 Antioxidantwegsweg

Abstrakt:

 

Ziel, die Wirkung von zu untersuchenCistanche Deserticola bei Nervenzellenverletzungen bei Parkinson -Krankheit (PD)Ratten und sein verwandter Mechanismus. Methoden Sprague-Dawley (SD) männliche Ratten wurden zufällig in drei Gruppen unterteilt (1 0 Ratten in jeder Gruppe): Kontrollgruppe, Modellgruppe und Cistanche Group. Die Ratten in der Modellgruppe und der Behandlungsgruppe wurden intrakranial mit 6- Hydroxydopamin (6- ohda) injiziert. Die Ratten in der Cistanche-Gruppe erhielten 0,216 g/ ml Cistanche-Lösung, Ratten in der Blindgruppe und der Modellgruppe erhielten eine normale Salzbewässerung, die Menge der Bewässerung betrug 1 ml/ (100 g · d) für zwei Wochen. Die Morphologie und Ultrastruktur der Nervenzellen bei Hippocampus wurden durch Hämatoxyxylin-Eosen-Elektrosen-Elektrozokopus beobachtet. Die Morphologie der Nishi -Körper in der Region Hemimani wurde durch die Färbung von Nishi beobachtet. Die Mengen von Malondialdehyd (MDA) und Superoxiddismutase (SOD) wurden durch Thiobarbitursäure -Methode und Nitroblue -Tetrazolium -Methode nachgewiesen. Die Veränderungen von kelchähnlichem ECH-verwandtem Protein 1 (Keap 1), Kernfaktor E 2- verwandten Faktor 2 (Nrf 2) und Häm-Cyclooxygenase 1 (ho -1) wurden durch Western Blot analysiert. Ergebnisse Nach der Behandlung von Cistanche Deserticola -Medikamenten wurde die Hippocampusgewebestruktur von PD -Ratten verbessert, die Morphologie von Neuronen wurde entlastet. Der Gehalt an Antioxidationsmittel -Enzym -SOD wurde in Hippocampus nach dem Hippocampus nach dem Hippocampus nach und nach versenkt, und der Ausdruck von KEAP wurde im Halt des Oxidationsstresses graduell verringert, und der Ausdruck von KEAP wurde in den KEAP -Gehalt an das Mess von Himpocaklemen versenkt. Die Expression von KEAP wurde in den KEAP -Protom -Messer. Die Ausdrücke des KEAP -Protins wurde. Die Proteinexpression von Nrf 2 und Ho -1 erhöhte sich. Schlussfolgerungen Cistanche Deserticola können die Beschädigung von Hippocampus -Neuronen verbessern und das Spiegel der oxidativen Stressreaktion in Hippocampus von PD -Ratten verringern. DerWirkung von Cistanche DeserticolaimBehandlung von PDRatten sind eng mit der Regulation von Keap -1 /nrf 2 /ho -1 Signalisierungsweg verwandt.

 

 

 

Hochwertige Koristaner zur Behandlung von PD

 

Schlüsselwörter: Cistanche Deserticola;Parkinson -Krankheit; Oxidativer Stress; Hippocampus; Neuronen; Keap1; Nrf2; Ho -1

 

Laut Statistiken aus der Datenstudie der globalen Krankheiten sind neurologische Erkrankungen zur weltweit führenden Ursache für Behinderungen geworden. In diesem Bereich ist die Parkinson-Krankheit (PD) zu einer der am schnellsten wachsenden Erkrankungen geworden, wobei der erhebliche altersstandardisierte Prävalenzanstieg, die Erhöhung der Behinderungsfälle und die steigende Sterblichkeitsrate steigern. eins.
Von 1990 bis 2020 stieg die Zahl der PD -Patienten weltweit um 118%und erreichte 6,2 Millionen und die Inzidenz steigt von Jahr zu Jahr immer noch [1-2]. PD -Patienten treten normalerweise mit motorischen Symptomen wie Tremor, Muskelsteifheit, Bradykinesie und Gleichgewicht in der späten Stufe auf. Nichtmotorische Symptome wie kognitiven Rückgang können jedoch im frühen Stadium der Krankheit auftreten. Im Laufe der Krankheit wird sich kognitive Beeinträchtigungen zunehmend verschlechtern und schwerwiegender werden.

Hochwertige Koristaner zur Behandlung von PD

Die Lebensqualität der Patienten beeinflussen [3]. Der Hippocampus ist eine wichtige Organisation im Gehirn für räumliches Lernen und Empfangen externer Informationen. Es ist die Hauptstruktur, um menschliche kognitive Funktionen zu verwirklichen. Die Hippocampus -Dysfunktion ist eng mit dem Einsetzen der kognitiven Dysfunktion bei PD -Patienten verbunden. Oxidativer Stress ist an der Entwicklung von Nervenzellen im Hippocampusgewebe beteiligt. Schaden [4-5]. Wenn Hippocampus -Neuronen bei Patienten mit PD geschützt sind, kann dies die Wahrnehmung des Patienten verbessern und das Fortschreiten der Krankheit verzögern.
In den letzten Jahren hat sich eine Vielzahl von chinesischen Kräutermedikamenten als wirksam bei der Behandlung von Krankheiten im Zusammenhang mit neurologischen Menschen als wirksam erwiesen [6]. Cistanche Deserticola ist eine traditionelle chinesische Medizin, die Niere Yang und das Auffüllen von Essenz und Blut nähren kann. Es wurde zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen wie ischämischem Schlaganfall und Neuromyelitis eingesetzt [7]. Frühere Studien der Forschungsgruppe haben gezeigt, dass Cistanche Deserticola das Verhalten von PD -Modellratten verbessern und die Apoptose von Dopamin -Nervenzellen im Bereich der Substantia nigra des Mittelhirns [8-9] verringern kann. Es ist jedoch unklar, ob Cistanche Deserticola Hippocampus -Gewebeschäden bei PD -Modellratten verbessern kann. In dieser Studie wurde ein PD -Rattenmodell festgestellt, um den Effekt von Cistanche Deserticola auf Hippocampus -Gewebeschäden zu beobachten und seinen Mechanismus zu untersuchen, um neue Ideen für die PD -Behandlung zu liefern. NISSL -Färbungsreagenz (Nanjing Senbeijia Biological Company); Isofluran (Shanghai Yaji Biological Company).

 

1 Materialien und Methoden

1.1 Materialien

1.1.1 Experimentelle Tiere

Es wurden 30 6- ein wöchentlich ales SD-Ratten mit einem Gewicht von 210-230 g verwendet. Das experimentelle Animal Center der traditionellen chinesischen Medizin der Fujianischen Universität für traditionelle chinesische Medizin bot experimentelle Tiere und allgemeine medizinische experimentelle tierische Umwelteinrichtungen. Das Experiment wurde vom Tierethikausschuss dieser Einrichtung genehmigt, und die Ethikregistrierungsnummer lautet 1N2023019.

1.1.2 Experimentelle Reagenzien
Cistanche Deserticola Granules (Fujian Dritter Volkskrankenhaus); 6- hydroxydopamin (6- ohda) Reagenz (Peking Biolabor Technology Co., Ltd.); Hämatoxylin-Eosin (HE) -Färbungsreagenz (Taizhou Yunke Biotechnology Co., Ltd.); Tiergewebeproteinlysat (Peking Solebao Biological Company); Proteinphosphatase -Inhibitoren (Wuhan Pujian Biological Company); Protease -Inhibitoren (Hunan Yunbang Biotechnology Company); Kelch-ähnliches Ech-assoziiertes Protein -1 (Keap1) Monoklonaler Antikörper (Wuhan Sanying Biotechnology Company); Glyceraldehyd 3- Phosphat -Dehydrogenase (GAPDH) Monoklonaler Antikörper (Wuhan Huamei biologisch); Kernfaktor E2 verwandter Faktor 2 (Nrf2), Häm -Oxygenase 1 (Hämoxygenas -1, ho -1) monoklonaler Antikörper (Wuhan Pujian Biotechnology Co., Ltd.); Superoxiddismutase (SOD) und Malondialdehyd (MDA) Detektionskits (Shanghai Biotech Co., Ltd.); NISSL -Färbungsreagenz (Nanjing Senbeijia Biotechnology Co., Ltd.); Isofluran (Shanghai Yaji Biotechnology Co., Ltd.).

 

1.1.3 Instrumente

JEA3001 ELEKTRONISCHER BALIG (SHANGHAI PUCHUN MESSING Instrument Co., Ltd.); BSA224S Elektronischer Gleichgewicht (Sartorius, Deutschland); Stab S2T Tieftemperatur Shaker (Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., Ltd.); RM2235 Vollautomatischer Paraffin -Slicer (Leica, Deutschland); Pectramax i3x Multifunktionaler Mikroplattenleser (Molecular Devices, USA); BX63
Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Japan); DLAB Handheld Centrifuge D1008/D1008E (Peking Dalong Xingchuang Experimental Instrument Co., Ltd.); Kryocube F740HI Ultra-Low-Temperatur-Kühlschrank (Epend, Deutschland); Minipro Epbasic Basic Electrlophorese Instrument Netzteil (Shanghai Yisheng Biotechnology Co., Ltd.); Konstante Temperaturtrocknungsofen (Hangzhou Notting Scientific Equipment Co., Ltd.); Ascent Max Ductless Fume Hood (Shanghai Yishike Enterprise Development Co., Ltd.).

 

1.2 Methoden

1.2.1 Modellaufbau und Tiergruppierung

Rats were placed in an environment with a temperature of 24-25℃, a humidity of 55%-60%, and a 12/12 h light/dark cycle, with free access to food and water. SD rats were randomly divided into 3 groups (10 rats in each group): blank group, model group, and Cistanche deserticola group. According to the PD animal model establishment method [5], SD rats in the model group and Cistanche deserticola group were anesthetized by 2% isoflurane inhalation and fixed on a brain stereotaxic instrument. The skin was incised along the midline of the skull, and the skull membrane was bluntly separated. The coordinates of the right striatum were determined by referring to the rat brain stereotaxic atlas. 8μL of 6-OHDA was injected intracranially at the above target at a concentration of 2μg/μL, and the blank group rats were injected with an equal volume of saline. Successful modeling criteria: One week after modeling, apomorphine (0.5 mg/kg) was intraperitoneally injected to induce rat rotation. The rats rotated from the healthy side to the affected side, and the number of rotations within 30 min was >21 0 Kreise, was als erfolgreiche Modellierung angesehen wurde. Danach wurden die Ratten in der Cistanche Deserticola -Gruppe täglich mit 0,216 g/ml Cistanche Deserticola -Lösung gegründet, und die leere Gruppe und die Modellgruppe waren mit normaler Kochsalzlösung aufgebaut. Das Gavage -Volumen der drei Gruppen von Ratten betrug zwei Wochen lang 1 ml/(100 g · d) [9]. Nach Abschluss der Behandlung jeder Rattengruppe wurden die Ratten durch 2% ige Isofluran -Inhalationsanästhesie eingeschläfert und Hirngewebe wurden für nachfolgende experimentelle Studien gesammelt.

 

1.2.2 Beobachtung pathologischer Veränderungen im Hippocampusgewebe durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung

 

Die Hippocampusgewebe von Ratten in jeder Gruppe wurden gesammelt, in Formaldehydlösung gelegt, mit Gradientenethanol dehydratisiert, in einem Trocknungsofen gebacken, gelöstes Wachs gebacken, getrocknet, entzwirbend, mit HE gefärbt, mit Xylol versiegelt, versiegelt und unter einem Mikroskop beobachtet.

 

1.2.3 Transmissionselektronenmikroskopiebeobachtung der Ultrastruktur von Hippocampusnervzellen

Das Hippocampusgewebe wurde in 3% Glutaraldehyd -Fixativ, dehydratisiert mit Gradientenethanol, eingebettet (Epoxyharz), und ultradünne Schnitte wurden hergestellt. Bleicitrat und Uranylacetatfärbung wurden verwendet, um die ultrastrukturellen Veränderungen von Nervenzellen der Hippocampus zu beobachten (unter Transmissionselektronenmikroskopie).

 

1.2.4 NISSL -Färbung, um die Veränderungen von NISSL -Körpern im Hippocampusgewebe zu beobachten

Die oben genannten Hippocampus-Gewebe-Paraffinschnitte wurden in wasserfreiem Ethanol, 95% bzw. 70% Gradientenethanol hydratisiert. Nach 3 -fach mit destilliertem Wasser mit destilliertem Wasser mit NISSL -Färbungslösung 5 Minuten färben, dann mit dehydratisiertem Gradientenalkohol und destilliertem Wasser waschen und mit Xylol klären. Die Schnitte wurden mit neutralem Kleber versiegelt und nach der Verfestigung unter einem optischen Mikroskop beobachtet und aufgezeichnet.

 

1.2.5 Chemisches kolorimetrisches Verfahren zum Nachweis des Gehalts von MDA und SOD im Hippocampusgewebe

Nachdem das Hippocampusgewebe verschiedener Versuchsgruppen homogenisiert worden war, wurden sie 20 Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert und der Überstand jeder Versuchsgruppe gesammelt. Gemäß den Anweisungen des Kits wurden die MDA- und SOD -Assay -Kits verwendet, um den Gehalt an MDA und SOD in jeder Gruppe von experimentellen Proben zu erkennen.

 

1.2.6 Protein -Immunblotting, um die spezifische Expression von KEAP1, NRF 2 und HO -1 -Proteinen im Hippocampusgewebe nachzuweisen

Das Hippocampusgewebe jeder Gruppe wurde mit Lysepuffer hinzugefügt und 15 min bei 12 000 r · min -1 zentrifugiert. Der Überstand wurde für den Standby -Gebrauch gesammelt. Die Proteinkonzentration wurde durch BCA -Methode bestimmt. Nach den Ergebnissen der Proteinquantifizierung wurde das entsprechende Volumen des Gesamtproteins zugegeben und mit Proteingelelektrophorese beladen. Die Proben wurden 10 min bei 95 Grad denaturiert, in die Membran übertragen, geschnitten und 1 h in der Blockierungslösung blockiert. Die verdünnten primären Antikörper Keap1, Nrf 2, ho -1 und GAPDH (1: 500) wurden zugegeben, über Nacht bei 4 Grad reagiert, mit 1 × TBST gewaschen, mit sekundären Antikörpern (1: 4000) inkubiert und erneut mit 1 × TBST für Farbbildungen gewaschen.

 

1.3 Statistische Analyse

Die Zähldaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die Daten, die der Normalverteilung und Homogenität der Varianz entsprachen, wurden einem t -Test unterzogen, die Daten, die der Normalverteilung und ungleicher Varianz entsprachen, wurden einem korrigierten t -Test unterzogen. Die Daten, die nicht der Normalverteilung entsprachen, wurden einem nichtparametrischen Test unterzogen. Einweg-ANOVA wurde verwendet, um die Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen zu vergleichen, und dann wurde die LSD-Methode verwendet, um die beiden Gruppen zu vergleichen. P <0. 05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

 

2 Ergebnisse

2.1 Wirkung von Cistanche Deserticola auf die morphologische Struktur der Hippocampus -CA1 -Region in PD -Modellratten, die die Färbungsergebnisse ergebnisten, zeigte, dass die Neuronen in der CA1 -Region des Hippocampus der leeren Gruppenratten ordentlich und eng mit regelmäßiger Morphologie und einheitlicher Verteilung angeordnet wurden, und keine offensichtlichen neuronalen Zellschäden; Die neuronalen Zellen in der Modellgruppe wurden unordentlicher angeordnet, die Zellkerne wurden geschrumpft, die Kernfärbung wurde vertieft und die neuronale Zellschädigung war offensichtlich; Die neuronalen Zellen in der Cistanche Deserticola -Gruppe wurden regelmäßiger angeordnet als die in der Modellgruppe, die Anzahl der Kernkondensation war relativ verringert und die neuronale Zellschädigung wurde gelindert. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt.

 

 

Abbildung 1 Effekt von Cistanche Deserticola auf die pathologische Struktur in der CA1 -Region von Hippocampus in Parkinson -Ratte (He, × 400) Hinweis: A: Kontrollgruppe; B: Modellgruppe; C: Cistanche Group. Schwarze Pfeile zeigen beschädigte Nervenzellen an.

 

2.2 Effekt von Cistanche Deserticola auf die Ultrastruktur von Hippocampus -Neuronen bei PD -Modellratten

In der leeren Gruppe kann bei der Beobachtung der Hippocampus -Neuronen beobachtet werden, dass die Zellstruktur eine klare Morphologie beibehält, der Kern eine regelmäßige runde oder ovale Form darstellt, die Kernmembran glatt und intakt bleibt und das Chromatin im Kern sogar verteilt ist, und es gibt keine Kantenaggregation von Kernchromatin. Im Gegensatz dazu zeigten die Hippocampus -Neuronen der Modellgruppe offensichtliche Veränderungen: Die Gesamtelektronendichte der Zellen nahm zu, der Kern kondensiert, das Chromatin im Kern aggregierte und an den Boden der Kernmembran gebunden, die Kernmembran und Vakuolen wurden im Zytoplasma beobachtet. After intervention with Cistanche deserticola, compared with the model group, the hippocampal neurons of the Cistanche deserticola group showed a certain recovery trend: the size of the neuronal cell body was restored, the cell membrane remained intact, the edge aggregation of nuclear chromatin was alleviated to a certain extent, the thickening of the nuclear membrane was also alleviated, and the number of vacuoles in the cytoplasm verringerte sich, was darauf hinweist, dass Cistanche Deserticola einen gewissen Schutz- oder Reparatureffekt auf Nervenzellen hat. Siehe Abbildung 2.

 

Abbildung 2 Effekt von Cistanche Deserticola auf die neuronale Ultrastruktur im Hippocampus von Parkinson -Ratten (× 7000) Hinweis: A: Kontrollgruppe; B: Modellgruppe; C: Cistanche Group.

 

2.3 Effekt von Cistanche Deserticola auf NISSL -Körper in Hippocampus -Neuronen von PD -Modellratten

Die NISSL -Färbungsergebnisse zeigten, dass die Neuronen in der Leergruppe eng mit regelmäßiger Morphologie, reichlich NISSL -Körpern und dunkler Färbung angeordnet waren. Die Neuronen in der Modellgruppe wurden lose angeordnet, geschwollen und die meisten NISSL -Körper wurden gelöst und leicht gefärbt; Die Neuronen in der Cistanche Deserticola -Gruppe waren mit regelmäßiger Morphologie eng angeordnet, und die Anzahl und Färbung von NISSL -Körpern wurde im Vergleich zur Modellgruppe verbessert. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3 dargestellt.

 

Abbildung 3 Effekt von Cistanche Deserticola auf Nissls Körper von Hippocampus -Nervenzellen in der Parkinson -Ratte (Nissl, × 200) Hinweis: A: Kontrollgruppe; B: Modellgruppe; C: Cistanche Group.

 

2.4 Auswirkungen von Cistanche Deserticola auf SOD- und MDA -Gehalt in Hippocampus von Parkinson -Ratten

 

Im Vergleich zur leeren Gruppe nahm der SOD -Gehalt im Hippocampus der Modellgruppe ab, während der MDA -Gehalt zunahm; Im Vergleich zur Modellgruppe nahm der SOD -Gehalt im Hippocampus der Cistanche Deserticola -Gruppe zu, während der MDA -Gehalt abnahm. Siehe Tabelle 1.

 

Tab. 1 Auswirkungen von Cistanche Deserticola auf SOD- und MDA -Gehalt im Hippocampus von Parkinson -Krankheitsratten

Gruppe	SOD (pg/ml)	MDA (pg/ml)
Kontrolle	12.36±2.75	2.85±0.83
Modell	2.75±0.83*	9.95±0.37*
Rhynchophylla	7.22±1.32#	5.16±1.75#

Hinweis: Im Vergleich zur Kontrollgruppe *p<0.05; compared with model group, #P<0.05.

 

2.5 Effekt der Cistanche Deserticola auf die Expression von Keap1, Nrf2 und Ho -1 Proteinen im Hippocampus von Parkinson -Krankheit Ratten

Die Ergebnisse von Western -Blot -Experimenten zeigten, dass die Expression von Nrf2 und HO -1 -Proteinen im Hippocampus von Ratten in der Modellgruppe abnahm, während die Expression von Keap1 -Protein zunahm; Im Vergleich zur Modellgruppe nahm die Expression von Nrf2 und Ho -1 -Proteinen im Hippocampus von Ratten in der Cistanche Deserticola -Gruppe zu, während die Expression von Keap1 -Protein abnahm. Siehe Abbildung 4 und Tabelle 2.

Abbildung 4 Effekt von Cistanche Deserticola auf die Expression von Keap1, Nrf2 und Ho -1 im Hippocampus von Parkinson -Krankheitsratten

Hinweis: A: Kontrollgruppe; B: Modellgruppe; C: Cistanche Group

 

 

Tab. 2 Effekt der Cistanche Deserticola auf die Expression von Keap1, Nrf2, Ho -1 im Hippocampus von Parkinson -Krankheitsratten

 

Gruppe	KEAPL	Nrf2	Ho -1
Leere Gruppe	0.16±0.05	0.38±0.07	0.33±0.05
Modellgruppe	0.85±0.23*	0.12±0.09*	0.11±0.02*
Positive Gruppe	0.22±0.03#	0.86±0.06#	0.79±0.05#

 

Hinweis: Im Vergleich zur Kontrollgruppe *p <{{0}}. 05; Im Vergleich zur Modellgruppe #P <0,05.