Genklonierung, funktionelle Identifizierung, Struktur- und Expressionsanalyse der Saccharose-Synthase aus Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 Expressionsanalyse von CtSus in verschiedenen Teilen von Cistanche tubulosa und im Zellkultursystem unter Trockenstress

4.1 Expressionsanalyse von CtSus in verschiedenen Teilen von Cistanche tubulosa

In-vitro-Experimente zur Ganzzelltransformation und Experimente mit enzymatischen katalytischen Reaktionen bestätigten, dass das vom CtSus-Gen kodierte Protein die Fähigkeit besitzt, die Synthese von UDP-Glucose zu katalysieren. Um den Zusammenhang zwischen diesem Gen und der Biosynthese von Glykosidverbindungen in Cistanche tubulosa weiter zu untersuchen, wurde das Expressionsniveau dieses Gens in verschiedenen Teilen von untersuchtCistanche tubulosawurde analysiert.

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Echinacosidist die repräsentativste Glykosidverbindung in Cistanche tubulosa und ihr Gehalt kann mehr als 30 % des Trockengewichts von Cistanche tubulosa-Pflanzen erreichen [23]. Die Forschungsgruppe hat zuvor den Gehalt an Echinacosid in verschiedenen Teilen von Cistanche tubulosa-Pflanzen gemessen, und die spezifische Leistung war: der Gehalt anechinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>Luftteil; Unter ihnen war der Gehalt an Echinacosid im Haustorium am höchsten. Eine quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR wurde unter Verwendung von cDNA aus verschiedenen Teilen von Cistanche tubulosa als Matrizen durchgeführt und die Ergebnisse wurden von 2 analysiert–ΔΔCT-Methode und Differentialanalyse wurden durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 4A dargestellt. Das Expressionsniveau des CtSus-Gens im Haustorium war mit dem 1,5-fachen des oberirdischen Teils am höchsten, und das Expressionsniveau im unterirdischen Teil war deutlich höher als im oberirdischen Teil, was mit dem Akkumulationsmuster von Phenylethanolglycosiden übereinstimmt vertreten durch Echinacosid in verschiedenen Teilen vonCistanche tubulosa.

Abbildung 4 Relative Expressionsniveaus von CtSus in verschiedenen Teilen von C. tubulosa und in mit PEG6000 behandelten Suspensionszellen. A: Relatives Expressionsniveau von CtSus in verschiedenen Teilen von C. tubulosa; B: Relatives Expressionsniveau von CtSus in mit PEG6000 behandelten C. tubulosa-Suspensionszellen zu verschiedenen Zeitpunkten n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

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4.2 Expressionsanalyse von CtSus in Suspensionszellen von Cistanche deserticola unter Trockenstressbedingungen

Das haben vorläufige Untersuchungen zum Projekt gezeigtDurch PEG6000 induzierter Trockenstressdürfendeutlich erhöhenDieAnreicherung von Phenylethanolglykosidenin Cistanche-Suspensionszellen. Von 3 bis 9 Tagen nach der Induktion stieg der Echinaceaside-Gehalt deutlich an. Vom 12. bis 15. Tag ist dieWachstumsrate von EchinaceasideDer Inhalt verlangsamte sich und erreichte am 15. Tag den Maximalwert. Mit zunehmender Kulturdauer stieg der Echinaceaside-Gehalt dann deutlich an. Der Fructosidgehalt nahm allmählich ab [24]. Auf der Grundlage dieser Forschung verwendete dieser Artikel die cDNA von unbehandelten Cistanche-deserticola-Suspensionszellen und PEG6000--induzierten Cistanche-deserticola-Suspensionszellen als Vorlagen für die Durchführung einer quantitativen Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Detektion zur Untersuchung des CtSus-Gens in der Cistanche-deserticola-Suspension Zellen unter Trockenstressbedingungen. Veränderungen der Ausdrucksebenen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 4B dargestellt. In durch PEG6000 induzierten Suspensionszellen von Cistanche deserticola stieg die Expression von CtSus am 6. Tag nach der Induktion deutlich an, erreichte am 9. Tag den höchsten Wert und fiel dann auf das gleiche Niveau wie bei der Kontrolle zurück. Gruppen mit gleichem Niveau. Die obigen Ergebnisse zeigen, dass Trockenstress die Expression des CtSus-Gens in der Suspensionszelllinie Cistanche deserticola signifikant erhöhen kann, was mit dem Akkumulationsmuster von Echinaceaside unter Trockenstress übereinstimmt. Der Höhepunkt der Expression des CtSus-Gens tritt jedoch früher auf als der Höhepunkt des Echinaceaside-Gehalts, da der durch CtSus-Katalyse synthetisierte aktive Glykosyldonor ein wichtiger Vorläufer ist, der für die mehrstufige Glykosylierungsreaktion im anschließenden Biosyntheseweg von Echinaceaside erforderlich ist. Daher wird spekuliert, dass Organismen nach Trockenstress bevorzugt Gene mobilisieren, die mit dem Primärstoffwechsel in Zusammenhang stehen, um die Anhäufung aktiver Spender und anschließend die Anhäufung wichtiger Sekundärmetaboliten zu erreichen.

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5 Dreidimensionale Strukturstudie des CtSus-Proteins und Analyse der wichtigsten aktiven Zentren

Basierend auf der Funktion von CtSus bei der Katalyse der Produktion des Glykosyldonors UDP-Glucose wurden die strukturellen Grundlagen der katalytischen Aktivität von CtSus weiter untersucht. Zur Vorhersage der Sekundärstruktur des Proteins wurde das Online-Tool SOPMA verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Sekundärstruktur von CtSus 55,28 % -Helices, 25,47 % Zufallsknäuel, 12,80 % verlängerte Stränge und 6,46 % -Windungen enthielt (Abbildung 5A), was darauf hinweist, dass -Helices die wichtigsten sekundären Struktureinheiten im CtSus-Protein sind. gefolgt von Random Coils, die ebenfalls einen großen Anteil des Proteins ausmachen. Verlängerte Stränge und Windungen sind im gesamten Protein verteilt. Nach vorliegenden Studien liegt die Saccharose-Synthase meist in Form eines Tetramers vor, das als ihre aktive Form gilt. Daher wurde in diesem Artikel AlphaFold2 weiter verwendet, um die Struktur des CtSus-Proteins vorherzusagen und seine dreidimensionale Struktur von Proteintetrameren zu erhalten. Der Vergleich der PDB-Datenbank (Protein Data Bank) ergab, dass die Sequenzähnlichkeit zwischen der Saccharose-Synthase AtSus1 (PDBID 3S28) aus Arabidopsis thaliana und CtSus 77,93 % erreichen kann. Die vorhergesagte CtSus-Struktur wurde mit der dreidimensionalen Struktur von AtSus1 verglichen, und der RMSD-Wert (Root Mean Square Deviation) nach der Proteinüberlagerung betrug 1,11 Å, was darauf hinweist, dass die räumlichen Strukturen der beiden sehr konsistent sind (Abbildung 5B).

Die berichtete Protein-Ligand-Kristallkomplexstruktur von Arabidopsis AtSus1 mit UDP und Fructose (PDBID3S29) wurde als Vorlage [16] verwendet, um den Bindungsmodus von CtSus mit UDP und Fructose zu analysieren. Die molekularen Docking-Ergebnisse sind in Abbildung 5C dargestellt. Es ist zu beobachten, dass die Substratbindungstaschen von AtSus1 und CtSus hinsichtlich Aminosäuretyp, räumlicher Verteilung und Konfiguration sehr ähnlich sind und die Überlappung hoch ist, was beweist, dass die Sequenz der Saccharose-Synthase in Pflanzen hoch konserviert ist. Die Konformationen der beiden Liganden UDP und Fructose in der Proteinsubstrat-Bindungstasche sind in Abbildung 5D dargestellt. Die vorteilhafteste Konformation des molekularen Andockens von UDP und CtSus weist eine gute Überlappung mit der Konformation von UDP im AtSus1-UDP-Kristallkomplex auf, was die Genauigkeit der Ergebnisse des molekularen Andockens beweist. Die Wechselwirkung zwischen UDP und den wichtigsten Aminosäureresten in der Bindungstasche des Proteinsubstrats ist in Abbildung 5E dargestellt. UDP und CtSus sind hauptsächlich durch Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen miteinander verbunden. Zu den wichtigsten Aminosäureresten in der Substratbindungstasche gehören: eu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 und Glu681.

Referenzen

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