Cistanche Tubulosa Phenylethanoid-Glykoside induzieren Apoptose in Eca-109-Zellen über den Mitochondrien-abhängigen Signalweg
Mar 06, 2022
Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com
CHANGSHUANG FU, JINYU LI, ADILA AIPIRE, LIJIE XIA, YI YANG, QIUYAN CHEN, JIE LV, XINHUI WANG und JINYAO LI
Abstrakt
Cistanche tubulosahat verschiedene biologische Funktionen. In der vorliegenden Studie wurde die Antitumorwirkung von wasserlöslichen Phenylethanoidglykosiden von C. tubulosa (CTPG-W) auf Speiseröhrenkrebs untersucht. Eca-109-Zellen wurden mit CTPG-W behandelt und die Zelllebensfähigkeit wurde durch MTT-Assay gemessen. Die Apoptose, der Zellzyklus, das mitochondriale Membranpotential (Δψm) und reaktive Sauerstoffspezies wurden durch Durchflusszytometrie analysiert. Die Proteinspiegel in apoptotischen Signalwegen wurden durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Es wurde festgestellt, dass CTPG-W die Lebensfähigkeit von Eca-109-Zellen durch Induktion von Apoptose und Zellzyklusarrest signifikant verringerte. Nach der CTPG-W-Behandlung war das Δψm von Eca-109 deutlich verringert, was mit den hochregulierten Spiegeln von B-Zell-Lymphom-2 (Bcl-2)-assoziiertem X und herunterregulierten Spiegeln assoziiert ist von Bcl-2. Folglich waren die Konzentrationen von Cytochrom c und c-Jun NH2--terminaler Kinase erhöht, was die Konzentrationen von gespaltener Poly(ADP-Ribose)-Polymerase und gespaltener Caspase-3, {{18} } und -9, aber nicht caspase-8. Dementsprechend zeigten die Niveaus reaktiver Sauerstoffspezies in Eca-109-Zellen bemerkenswerte Veränderungen. Diese Ergebnisse zeigten, dass CTPG-W die Apoptose von Eca-109-Zellen über einen von Mitochondrien abhängigen Weg induzierte.
Einführung
Speiseröhrenkrebs ist eine der häufigsten Krebsarten mit der elfthöchsten Morbiditätsrate und der sechsthöchsten Sterblichkeitsrate weltweit und verursachte im Jahr 2015 ~439.000 Todesfälle (1). Die Inzidenz von Speiseröhrenkrebs variiert deutlich zwischen den verschiedenen Regionen, wobei Ostasien und das östliche und südliche Afrika die höchsten Inzidenzraten und Westafrika die niedrigsten Raten im Jahr 2012 aufweisen (1,2). In China beliefen sich die geschätzten Fälle und Todesfälle von Speiseröhrenkrebs im Jahr 2015 auf 477 000 bzw. 375 000 (3). Obwohl die Morbiditätsrate von Speiseröhrenkrebs in Ländern mit mittlerem und hohem soziodemografischem Index zwischen 2005 und 2015 zurückgegangen ist, bleibt die Sterblichkeitsrate aufgrund der schlechten Prognose hoch (1,4). Die Kombination aus chirurgischer Resektion und Chemotherapie oder Strahlentherapie wurde zur Behandlung von Speiseröhrenkrebs eingesetzt, es wurde jedoch berichtet, dass zwischen 2003 und 2014 die Überlebensrate von 5- Jahren unverändert blieb<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">
Die traditionelle chinesische Kräutermedizin (CHM) wurde zur Behandlung verschiedener Krebsarten eingesetzt, darunter nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (6), Darmkrebs (7) und hepatozelluläres Karzinom (8). Kürzlich wurde in klinischen Studien berichtet, dass die Kombination von CHM mit Chemo- oder Strahlentherapie nicht nur eine Reihe von Vorteilen für die Lebensqualität und die Linderung von durch Chemo- oder Strahlentherapie induzierten Nebenwirkungen zeigte (9,10), sondern auch die Überlebensrate der Patienten verbesserte mit nicht-kleinzelligem Lungen-, Leber-, Magen-, Darm-, Nasen-Rachen- oder Gebärmutterhalskrebs (9). Es gibt jedoch widersprüchliche Beweise für die Wirksamkeit der CHM-Behandlung bei Speiseröhrenkrebs (10,11). Zahlreiche Studien haben festgestellt, dass eine Reihe von pflanzlichen Arzneimitteln oder Inhaltsstoffen das Wachstum von Speiseröhrenkrebszellen in vitro und in vivo hemmen können, darunter Andrographis paniculata (12,13), Daikenchuto (14), Icariin (15), Rosa Roxburghii Tratt und Fagopyrum Cymosum (16), Jaridonin (17), Marsdenia tenacissima (18), OP16 (ein neuartiges Ent-Kauren-Diterpenoid) (19), Qigesan (20) und Tonglian-Abkochung (21). Cistanche ist eine Art von CHM und übt verschiedene biologische Funktionen aus, darunter Antioxidation, Antientzündung und Neuroprotektion (22,23). Unsere vorherige Studie hat das gezeigtCistanche tubulosa Phenylethanoidglykoside(CTPG) konnte das Wachstum von Melanom-B16-F10-Zellen in vitro und in vivo unterdrücken (24). Allerdings schränkt die schlechte Wasserlöslichkeit des bisher verwendeten CTPG die Arzneimittelentwicklung ein (24). Daher wurde wasserlösliches CTPG (CTPG-W) verwendet und die Antitumorwirkung auf Speiseröhrenkrebszellen (Eca-109) untersucht. Es wurde festgestellt, dass CTPG-W dosisabhängig die Lebensfähigkeit von Eca-109-Zellen durch die Induktion von Apoptose über einen mitochondrienabhängigen Weg hemmen kann.
Materialien und Methoden Tiere.
Weibliche C57BL/6-Mäuse (6-8 Wochen, ~25 g) wurden vom Beijing Laboratory Animal Research Center (Peking, China) gekauft und im temperaturgeregelten (25 ˚C), Lichtzyklus (12/ 12) Tiereinrichtung der Universität Xinjiang (Urumqi, China). Alle Tiere erhielten erregerfreies Wasser und Futter.
Zelllinie und Kultur. Die humane Ösophaguskarzinom-Zelllinie (Eca-109) wurde vom Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, China) konserviert und in RPMI{{1} kultiviert } Medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), ergänzt mit 10 Prozent hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, China), 1 Prozent L -Glutamin (100 mM), 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2.
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). CTPG-W (Kat.-Nr. SGJG20170410) wurde von Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, China) erworben. Die Hauptverbindungen von CTPG wurden gemäß unserer früheren Studie (24) durch HPLC qualifiziert und quantifiziert. Kurz gesagt, HPLC wurde auf einer ZORBAX SB-C18-Säule (250 x 4,6 mm; 5 µm) bei 30 °C durchgeführt und mit 0,2 % Ameisensäurelösung und einem Gradienten von Methanol, beginnend bei 23 %, eluiert, wobei jede Minute 1 ml zugegeben wurde für 45 min bis zum Erreichen von 31 Prozent. Insgesamt wurden 10 ul Probe injiziert und bei 330 nm nachgewiesen. Der Echinacosid-Standard wurde von Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen, und der Acteosid-Standard wurde von Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) bezogen. Die Standards wurden verwendet, um die Komponenten von CTPG-W zu analysieren.
MTT-Assay. Die Zellproliferation wurde mit einem MTT-Assay gemessen. Eca{{0}}-Zellen wurden in 96-Well-Platten in einer Dichte von 5 x 103 Zellen in 100 µl RPMI{{5 }} Medium/Well und kultiviert bei 37˚C für 24 h, dann behandelt mit verschiedenen Konzentrationen (0, 200, 400, 600 und 800 µg/ml) von CTPG-W oder 0,4 Prozent Dimethylsulfoxid (DMSO) für 24, 48 und 72 Std. DMSO wurde als Lösungsmittelkontrolle verwendet (800 &mgr;g/ml CTPG-W, enthaltend 0,4 % DMSO). Als Positivkontrolle wurde Cisplatin (20 µg/ml) verwendet. Anschließend wurde der Überstand nach 5-minütiger Zentrifugation bei 225 xg bei Raumtemperatur verworfen, und 100 µl MTT-Lösung (0,5 mg/ml in RPMI-1640-Medium ohne FBS) wurden in jede Vertiefung gegeben und bei 37 °C inkubiert für 3 Std. Die gebildeten Formazan-Kristalle wurden in 200 &mgr;l DMSO gelöst. Die Werte der optischen Dichte (OD) wurden bei einer Wellenlänge von 490 nm mit einem 96--Well-Mikroplattenlesegerät (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) gemessen. Die relative Zelllebensfähigkeit wurde nach folgender Formel berechnet: Zelllebensfähigkeit (Prozent)=(OD behandelt/OD unbehandelt) x 100 Prozent. Die Morphologie von Eca-109-Zellen wurde mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop (Vergrößerung x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tokyo, Japan) beobachtet.
Für die Proliferation von Splenozyten wurden C57BL/6-Mäuse durch zervikale Dislokation eingeschläfert und Milzen wurden isoliert. Die Einzelzellsuspension wurde hergestellt und Splenozyten wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen/Well in 100 µl RPMI-1640-Medium ausgesät und dann mit unterschiedlichen Konzentrationen behandelt (0, 200, 400, 600 und 800 µg/ml) CTPG-W für 24, 48 und 72 h bei 37 °C mit 5 % CO2. Die Proliferation von Splenocyten wurde durch einen MTT-Assay gemäß dem zuvor erwähnten Protokoll gemessen. Stimulationsindex=ODbehandelt/ODunbehandelt.
Messung der Apoptose und des Zellzyklus. Eca{{0}}-Zellen wurden in 60-mm-Schalen bei einer Dichte von 2,5 x 105 Zellen/Schale für 24 h kultiviert und mit unterschiedlichen Konzentrationen behandelt ({{31} }, 200, 400, 600 und 800 µg/ml) CTPG-W oder 0,4 % DMSO für 24 h bei 37 °C mit 5 % CO2. Die Zellen wurden gesammelt und mit einem Annexin V‑Fluoresceinisothiocyanat (FITC)/Propidiumiodid (PI) Apoptose-Nachweiskit (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) gemäß den Protokollen des Herstellers gefärbt. Die Proben wurden durch Durchflusszytometrie (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) gesammelt und mit FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA) analysiert. Um die Wirkung von CTPG-W auf den Zellzyklus zu analysieren, wurden 2,5 x 105 Eca-109-Zellen in 60-mm-Kulturschalen ausgesät und mit CTPG-W (0, 100, 200 und 400 µg/ml) oder 0,4 behandelt Prozent DMSO für 24 h bei 37˚C mit 5 Prozent CO2. Alle Zellen wurden geerntet und zweimal mit eiskaltem PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) gewaschen, dann in 70 % eiskaltem Ethanol bei 4 °C für 30 Minuten fixiert. Nach zweimaligem Waschen mit eiskaltem PBS wurden die Zellen in 300 &mgr;l PI/RNase-Färbepuffer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) für 10 min bei Raumtemperatur resuspendiert. Die Zellzyklusverteilung wurde mit der Software ModFit LT 3.0 durch Durchflusszytometrie (BD FACSCalibur) analysiert.
Analyse des mitochondrialen Membranpotentials (Δψm) und reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Um die Δψm zu analysieren, wurden Eca{0}}-Zellen mit CTPG-W (0, 400, 600 und 800 µg/ml) oder 0,4 % DMSO für 24 behandelt h bei 37 °C mit 5 Prozent CO2 und gefärbt mit dem mitochondrialen Membranpotential-Assay-Kit mit JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China) gemäß dem Protokoll des Herstellers für 20 min bei 37 °C . Nach zweimaligem Waschen mit JC-1-Waschpuffer (Beyotime Institute of Biotechnology) wurden die Proben mit 300 µl JC-1-Waschpuffer resuspendiert und durch Durchflusszytometrie (BD FACSCalibur) analysiert. Die Fluoreszenz des Farbstoffs JC-1 in Eca-109-Zellen wurde auch mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop (Vergrößerung x200; Nikon Eclipse Ti-E) beobachtet. Zur Analyse von ROS wurden Eca-109-Zellen mit CTPG-W (0, 400, 600 und 800 µg/ml) für 2, 4, 6, 12 und 24 h behandelt und mit reaktiven Sauerstoffspezies gefärbt Assay-Kit (Beyotime Institute of Biotechnology) gemäß dem Protokoll des Herstellers für 20 min bei 37 °C. Nach dreimaligem Waschen mit eiskaltem PBS wurden Proben mittels Durchflusszytometrie (BD FACSCalibur) gesammelt und mit der Software FlowJo 7.6 analysiert.
2,2‑Diphenyl‑1‑picrylhydrazyl (DPPH) Radikalfängeraktivität. Die Radikalfängeraktivität von CTPG-W wurde mit einem DPPH-Radikalassay gemäß dem veröffentlichten Protokoll mit einer geringfügigen Modifikation bestimmt, da Methanol durch Ethanol ersetzt wurde, um DPPH aufzulösen (25, 26). Für Steady-State-Messungen wurden 150 µl DPPH (100 mmol/l) in Ethanol mit verschiedenen Konzentrationen von CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 und 600 µg/ml) in 50 µl PBS gegeben und 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Extinktion bei 517 nm wurde in Anwesenheit und Abwesenheit von CTPG-W nachgewiesen. Als Positivkontrolle wurden insgesamt 50 µl Vitamin C verwendet. Die Radikalfängeraktivität von DPPH wurde nach folgender Formel berechnet: Scavenging (Prozent)=[1-(A Probe-Ablank)/A0] x100, wobei Ablank die Extinktion der Kontrolle (ohne DPPH) ist, Eine Probe ist die Extinktion der Probe und A0 ist die Extinktion von PBS mit DPPH.
Western-Blot-Analyse. Eca{{0}}-Zellen wurden mit CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) oder 0,4 % DMSO für 24 h bei 37 °C mit 5 % CO2 behandelt. Nach dem folgenden zweimaligen Waschen mit PBS wurden die Zellen in Radioimmunpräzipitationsassay-Lysepuffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Peking, China) für 20 min auf Eis lysiert. Nach Zentrifugation bei 10,000 xg für 10 min bei 4°C wurden die Überstände gesammelt und die Proteinkonzentrationen wurden mit einem Bicinchoninsäure-Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.) gemäß den Protokollen des Herstellers nachgewiesen. Die Western-Blot-Analyse wurde gemäß unserer vorherigen Beschreibung (24) durchgeführt. Die Antikörper gegen Caspase-7 (Kat.-Nr. D120077), Caspase-8 (Kat.-Nr. D155240), Caspase-9 (Kat.-Nr. D220078), B-Zell-Lymphom{ {24}} (Bcl-2)-assoziiertes X (Bax) (Kat.-Nr. D220073) und Bcl-2 (Kat.-Nr. D260117) und Anti-Maus-IgG-Meerrettichperoxidase (HRP ) (Kat. Nr. D111050) und Anti-Kaninchen-IgG-HRP (Kat. Nr. D110058) wurden von BBI Life Sciences (Shanghai, China) erworben. Die Antikörper gegen Caspase-3 (Kat. Nr. E-AB-10050) und aktive Caspase-3 (Kat. Nr. E-AB-22115) wurden von Elabscience ( Wuhan, China). Andere Antikörper gegen Caspase-7 (Kat.-Nr. 9492), Poly(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP) (Kat.-Nr. 9542), Cytochrom c (Kat.-Nr. AC909), c-Jun NH{ {48}}terminale Kinase (JNK) (Kat. Nr. 9252S) und -Actin (Kat. Nr. 58169) wurden von Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) bezogen. Alle primären und sekundären Antikörper wurden 1:1 verdünnt, 000. Die primären Antikörper wurden bei 4 °C über Nacht inkubiert und die sekundären Antikörper wurden bei 37 °C für 1 Stunde inkubiert.
Die Zielproteine wurden unter Verwendung eines verbesserten Chemilumineszenz-Assay-Kits (Beyotime Institute of Biotechnology) gemäß dem Protokoll des Herstellers nachgewiesen.
Statistische Analyse. Die statistische Signifikanz wurde durch einfache Varianzanalyse mit Tukey's Post-Hoc-Test berechnet und die Ergebnisse wurden unter Verwendung der Software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) in den Behandlungs- und Kontrollgruppen analysiert. Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche tubulosa Phenylethanoidglykoside(CTPG)
Ergebnisse
CTPG-W unterdrückt das Wachstum von Eca-109-Zellen. Die Komponenten von CTPG-W wurden durch HPLC qualifiziert und quantifiziert (Abb. 1), die mit den Standards von Echinacosid und Acteosid verglichen wurden. Gemäß den Peakretentionszeiten und den Peakflächen enthielt CTPG-W 39,16 Prozent Echinacosid und 2,44 Prozent Acteosid. Zuerst wurde die Wirkung von CTPG-W auf die Lebensfähigkeit von Eca-109-Zellen mit einem MTT-Assay bestimmt. CTPG-W wurde in DMSO mit 200 mg/ml gelöst und mit RPMI-1640-Medium, das 10 % hitzeinaktiviertes FBS enthielt, auf die angegebenen Konzentrationen verdünnt. Eca-109-Zellen wurden mit CTPG-W behandelt und die Zelllebensfähigkeit wurde mit einem MTT-Assay zu den angegebenen Zeitpunkten analysiert. Die CTPG-W-Behandlung reduzierte die Lebensfähigkeit von Eca-109-Zellen signifikant dosis- und zeitabhängig (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">
CTPG-W induziert Apoptose in Eca-109-Zellen. Um zu untersuchen, ob CTPG-W das Wachstum von Eca-109-Zellen durch Induktion von Apoptose oder Nekrose unterdrückt, wurden Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von CTPG-W behandelt. Nach 24 h wurden die Apoptose und Nekrose von Eca-109-Zellen mit Annexin V/PI-Färbung nachgewiesen. Wie in Fig. 3A dargestellt, wurden Annexin-V-/PI-Plus-Zellen als nekrotische Zellen und Annexin-V-Plus/PI-Plus- und Annexin-V-Plus-/PI-Zellen als apoptotische Zellen gesperrt. CTPG-W induzierte dosisabhängig primär die Apoptose von Eca-109-Zellen, obwohl auch die nekrotischen Eca-109-Zellen unter der Behandlung mit 600 und 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">
CTPG-W induziert in Eca-109-Zellen einen Zellzyklusarrest in der S-Phase. Eine Störung des Krebszellzyklus unterdrückt das Zellwachstum und fördert die Apoptose (27). Die Verteilung des Zellzyklus in Eca-109-Zellen wurde mit PI-Färbung nach CTPG-W-Behandlung für 24 h nachgewiesen. Es wurde beobachtet, dass Zellen in der S-Phase zunahmen und Zellen in den G0/G1-Phasen eine insgesamt signifikante Abnahme nach der CTPG-W-Behandlung anzeigten (P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">
CTPG‑W verringert Δψm und induziert die Freisetzung von Cytochrom c. Apoptose kann durch einen mitochondrienabhängigen Weg induziert werden (28, 29). Die pro- und anti-apoptotischen Mitglieder der BCL-2-Proteinfamilie spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der mitochondrialen Membranintegrität (30, 31). Nach 24-stündiger CTPG-W-Behandlung wurde Δψm mittels JC-1-Färbung bestimmt. JC-1-Aggregat (rote Fluoreszenz nachgewiesen in FL-2) zerfällt in Monomer (grüne Fluoreszenz nachgewiesen in FL-1), wenn Δψm reduziert wird (32). Wie in Abb. 5A dargestellt, stiegen die Häufigkeiten von FL-1-plus FL-2-/plus-Zellen dosisabhängig signifikant an, was darauf hinweist, dass Δψm von Eca-109-Zellen abnahm. Die Fluoreszenzänderungen in Eca-109-Zellen wurden auch mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop beobachtet (Abb. 5B). Mit zunehmender Konzentration von CTPG‑W nahm die rote Fluoreszenz ab und die grüne Fluoreszenz zu, was mit den Daten aus der Durchflusszytometrie übereinstimmt. Es wurde auch beobachtet, dass der Gehalt an Cytochrom c im Cytosol deutlich erhöht war (Fig. 5C), was auf eine Verringerung von Δψm zurückzuführen ist. Dies verstärkt die aus der erhöhten Anzahl von FL-1-plus FL-2-/plus-Zellen gezogene Schlussfolgerung, dass Δψm als Ergebnis der CTPG-W-Behandlung abnahm. Es wurde berichtet, dass JNK die Aktivierung der BCL-2-Proteinfamilie regulieren kann, die die Freisetzung von Cytochrom c (33-35) verursacht. Es wurde auch festgestellt, dass der JNK-Spiegel nach der CTPG-W-Behandlung merklich hochreguliert war (Fig. 5C). Die Ergebnisse zeigten, dass CTPG-W die Apoptose von Eca-109-Zellen über einen von Mitochondrien abhängigen Weg induzieren kann.
Die Wirkung von CTPG-W auf die intrazelluläre ROS-Erzeugung. ROS könnte Δψm reduzieren, um Apoptose zu induzieren (36). Um zu untersuchen, ob CTPG-W die ROS-Produktion steigern kann, wurden Eca-109-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von CTPG-W behandelt. Die Zellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten gesammelt und mit DCFH-DA gefärbt. Die Produktion von intrazellulärem ROS in Eca-109-Zellen wurde durch Durchflusszytometrie bestimmt. Wie in Fig. 6A dargestellt, erhöhten 800 µg/ml CTPG-W die ROS-Produktion ab 2-6 h signifikant und nahmen ab 12-24 h ab. Zusätzlich erhöhten 400 µg/ml CTPG-W die ROS-Produktion ab 12-24 h signifikant. Darüber hinaus veränderten 200 ug/ml CTPG-W die ROS-Produktion nicht merklich. Die dynamischen Veränderungen der ROS-Produktion können mit der Apoptose von Eca-109-Zellen in Verbindung gebracht werden. Es wurde auch festgestellt, dass CTPG-W freie Radikale abfangende Aktivität hatte ( 6B ), was mit der verringerten ROS-Produktion in Eca-109-Zellen, die mit 800 &mgr;g/ml CTPG-W nach 12 h behandelt wurden, assoziiert sein kann.
CTPG‑W reguliert die Aktivität von Caspase‑3, Caspase‑7, Caspase‑9 und PARP hoch. Die Freisetzung von Cytochrom c aufgrund der Δψm-Reduktion könnte die Caspase-Proteasen aktivieren, um Apoptose zu induzieren (29, 30, 37). Nach einer 24-stündigen CTPG-W-Behandlung wurde die Aktivierung von Caspase -3, 7, 8, 9 und PARP durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Verglichen mit der Kontrolle wurden die Spiegel von gespaltener Caspase-9, gespaltener Caspase-7, gespaltener Caspase-3 und gespaltener PARP, aber nicht die Spiegel von gespaltener Caspase{{ 20}}, wurden durch CTPG-Behandlung dosisabhängig hochreguliert (Fig. 7). Diese Ergebnisse zeigten, dass CTPG-W Δψm reduzierte und die Freisetzung von Cytochrom c förderte, um Caspasen zu aktivieren, die die Apoptose von Eca-109-Zellen induzieren.
Cistanche tubulosa-Extrakt
Diskussion
Traditionelles CHM könnte die Apoptose von Speiseröhrenkrebszellen über verschiedene Wege induzieren, einschließlich des extrinsischen Todesrezeptors, der intrinsischen mitochondrialen und endoplasmatischen Retikulum-Stresswege (29). Unsere frühere Studie hat gezeigt, dass CTPG als Hauptbestandteil von C. tubulosa das Wachstum von Melanom-B16-F10-Zellen durch die Induktion von Apoptose über einen mitochondrienabhängigen Weg hemmt (24). In der vorliegenden Studie wurde die Antitumorwirkung von CTPG-W auf Eca-109-Zellen untersucht und festgestellt, dass CTPG-W das Wachstum von Eca-109-Zellen unterdrückt, Apoptose induzierte und den Zellzyklus anhielt, reduzierte Δψm, erhöhte die Freisetzung von Cytochrom c und aktivierte Caspasen. CTPG und CTPG-W könnten Apoptose und Zellzyklusarrest in Krebszellen induzieren. Die genauen Mechanismen unterscheiden sich jedoch aufgrund der unterschiedlichen Komponenten von CTPG (26,64 Prozent Echinacosid, 10,19 Prozent Acteosid und 1,71 Prozent Isoacteosid) und CTPG-W (39,16 Prozent Echinacosid und 2,44 Prozent Acteosid). CTPG stoppte B16-F10-Zellen in den G0/G1-Phasen, aber CTPG-W stoppte Eca-109-Zellen in der S-Phase (24). Die ROS-Produktion wurde durch CTPG dosisabhängig erhöht, zeigte jedoch eine zeitabhängige Veränderung durch eine hohe Dosis von CTPG-W, die zu Beginn der CTPG-W-Behandlung (2-6 h) und signifikant anstieg nahm nach 12 h im Vergleich zur Kontrolle signifikant ab. Ein möglicher Grund ist, dass der Hauptbestandteil von CTPG-W Echinacosid ist. Eine Reihe von Studien berichteten, dass Echinacosid die ROS-Produktion und die ROS-induzierte Apoptose hemmen könnte, um seine neuroprotektiven und Anti-Aging-Wirkungen auszuüben (38-40). In ähnlicher Weise wurde in der vorliegenden Studie die Aktivität zum Abfangen freier Radikale beobachtet. Daher wurde spekuliert, dass einige Komponenten, einschließlich Verbascosid, Iso-Verbascosid und Salidrosid in einer hohen Dosis von CTPG-W, die ROS-Erzeugung sofort induzieren könnten, um die Apoptose von Eca-109-Zellen zu verursachen (41,42), und dann ROS wurde von Echinacosid abgefangen. Ein weiterer möglicher Grund für die Unterschiede in der ROS-Produktion durch CTPG und CTPG-W ist, dass in dieser und einer früheren Studie unterschiedliche Zelllinien verwendet wurden (24). Dong et al. (43) berichteten, dass Echinacosid die Apoptose menschlicher SW480-Darmkrebszellen durch die Erzeugung von oxidativen DNA-Schäden ohne erhöhte ROS-Spiegel induzieren könnte.
Die CTPG-W-Behandlung verringerte Δψm und verursachte die Freisetzung von Cytochrom c, das die Spaltung von Caspase-9 fördert (28). Konsequenterweise wurden die Spiegel der gespaltenen Caspase -9 durch die CTPG-W-Behandlung hochreguliert. Anschließend kann die aktive Caspase-9 Caspase-3 aktivieren, um Apoptose zu induzieren (44). Die Spiegel der gespaltenen Caspase -3 wurden auch durch die CTPG-W-Behandlung hochreguliert. Caspase-8 wurde jedoch nicht durch CTPG-W aktiviert, was darauf hindeutet, dass der extrinsische Todesrezeptorweg nicht an der durch CTPG-W induzierten Apoptose beteiligt war. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass CTPG-W die Apoptose von Eca-109-Zellen durch die Aktivierung eines mitochondrienabhängigen Signalwegs induziert.
PARP spielt eine wichtige Rolle bei der genomischen Stabilität und kann durch die aktiven Caspasen, insbesondere Caspase -3 und -7 (45), gespalten werden. Es wurde festgestellt, dass die CTPG-W-Behandlung Caspase -3 und -7 aktivierte, die PARP spalten können, um die DNA-Reparatur zu hemmen und Apoptose zu verursachen.
CTPG-W unterdrückt auch dosis- und zeitabhängig das Wachstum menschlicher hepatozellulärer Karzinom-BEL-7404-Zellen (unveröffentlichte Daten). Obwohl CTPG-W das Wachstum von Eca-109- und BEL-7404-Zellen hemmt, fördert es die Proliferation von Splenozyten, was auf den Gehalt an Polysacchariden (~50 Prozent) in CTPG-W (46 ). In ähnlicher Weise haben eine Reihe von Studien berichtet, dass Polysaccharide die Proliferation von Splenozyten (46-49) fördern können. Im Mausmodell wurde festgestellt, dass CTPG‑W den Milzindex im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöhte, aber das Körpergewicht und die anderen Organindizes einschließlich Herz, Leber, Niere und Lunge nicht beeinflusste (unveröffentlichte Daten). was darauf hindeutet, dass CTPG-W keine zytotoxische Wirkung auf normale Zellen hat.
Insgesamt zeigten die Daten, dass CTPG-W das Wachstum von Eca-109-Zellen durch Induktion von Apoptose über einen von Mitochondrien abhängigen Weg hemmt.
cistanche Vorteile: Anti-Apoptose
Danksagungen
Die Autoren danken Dr. Jianhua Yang (Baylor College of Medicine) für die Überarbeitung des Manuskripts.
Finanzierung
Diese Studie wurde vom 13th Five-Year Plan for Key Discipline Biology Bidding Project (Grant-Nr. 17SDKD0202), Xinjiang Normal University and Key Laboratory of Special Environment Biodiversity Application and Regulation in Xinjiang (Grant-Nr. XJTSWZ-2017-04) unterstützt. an JL und der Chinese National Natural Science Foundation Grant (Grant-Nr. 31760260) an XW.
Verfügbarkeit von Daten und Materialien
Daten und Materialien, die während der vorliegenden Studie verwendet und analysiert wurden, sind auf angemessene Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.
Autorenbeiträge
CF, AA, YY und QC führten die Experimente durch. LX, JLv und XW analysierten die Daten und die aufbereiteten Zahlen. JinyuL und JinyaoL haben das Projekt entworfen und das Manuskript geschrieben.
Ethik-Zustimmung und Zustimmung zur Teilnahme
Alle Tierversuche wurden vom Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen des Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering genehmigt (Genehmigung, Nr. BRGE-AE001; Universität Xinjiang).
Zustimmung des Patienten zur Veröffentlichung
Unzutreffend.
Konkurrierende Interessen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.
Verweise
Wu CR, Lin HC und Su MH: Umkehrung durch WasserExtrakte aus Cistanche tubulosaaus Verhaltensdefiziten im Alzheimer-ähnlichen Rattenmodell: Relevanz für Amyloidablagerung und zentrale Neurotransmitterfunktion. BMC-Ergänzung Altern Med 14: 202, 2014.
Li J, Aspire A, Gao L, Huo S, Luo J und Zhang F:Phenylethanoidglykoside aus Cistanche tubulosahemmt das Wachstum von B16-F10-Zellen sowohl in vitro als auch in vivo durch Induktion von Apoptose über einen mitochondrienabhängigen Signalweg. J Krebs 7: 1877-1887, 2016.
Brand-Williams W, Culver ME und Berset C: Verwendung einer Methode freier Radikale zur Bewertung der antioxidativen Aktivität. LWT-Food Sci Technol 28: 25-30, 1995.
