Teil 1 Vorbeugende Wirkungen von Phenylethanolglykosiden aus Cistanche Tubulosa auf die durch Rinderserumalbumin induzierte hepatische Fibrose bei Ratten

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakt

Hintergrund:Cistanche tubulosa ist eine traditionelle chinesische Kräutermedizin, die zur Regulierung der Immunität weit verbreitet ist.Phenylethanolglykoside aus Cistanche(CPhGs) aus dieser Pflanze sind die hauptsächlich wirksamen Materialien. Das Ziel dieser Studie war es, die präventiven und therapeutischen Wirkungen von CPhGs auf die BSA-induzierte hepatische Fibrose bei Ratten und verwandte molekulare Mechanismen, an denen hepatische Sternzellen beteiligt sind, zu bewerten. Biejiarangan (BJRG), ein weiteres traditionelles chinesisches Kräuterarzneimittel, wurde als positive Kontrolle verwendet. Methoden: In In-vivo-Experimenten wurden 75 SD-Ratten zufällig in 6 Gruppen eingeteilt: normal (mit destilliertem Wasser behandelt), Modell (BSA-behandelt), positives Medikament (BSA-behandelt plus BJRG 60{{29} } mg/kg/Tag) und BSA-behandelte plus CPhGs (125, 250 und 500 mg/kg/Tag) Gruppen. Leber- und Milzindizes, Serumspiegel von Aspartat-Aminotransferase (AST), Alanin-Aminotransferase (ALT), Hexadecensäure (HA), Laminin (LN), Prokollagen Typ III (PCIII), Kollagen Typ IV (IV-C), Hydroxyprolin ( Hyp) und Transforming Growth Factor 1 (TGF- 1) wurden in Rattenlebern gemessen. Histopathologische Grade für Leberfibrose wurden für jede Gruppe unter Verwendung von H&E- und Masson-Trichrom-Färbung bewertet. Die Expression von TGF- 1, Kollagen I (Col-I) und Kollagen III (Col-III) wurde durch ein immunhistochemisches Färbeverfahren bestimmt. Diese Wirkungen wurden weiter in vitro bewertet, indem die Expressionsniveaus von NF-κB p65 und Col-I durch quantitative Echtzeit-PCR-Analysen bestimmt wurden. Die Col-I-Proteinexpression wurde auch durch Western-Blotting untersucht. Ergebnisse: Alle Dosisgruppen (125, 25 0 und 500 mg/kg/Tag) von CPhGs reduzierten signifikant den Leber- und Milzindex, senkten ALT, AST, HA, LN, PCIII, IV-C Serumspiegel, TGF- 1-Gehalt (P < 0,01,="" p="">< 0,01="" und="" p="">< 0,01)="" und="" hyp-gehalt.="" cphgs="" linderten="" auch="" deutlich="" das="" anschwellen="" von="" leberzellen="" und="" verhinderten="" wirksam="" hepatozytennekrose="" und="" entzündliche="" zellinfiltration.="" immunhistochemische="" ergebnisse="" zeigten,="" dass="" cphgs="" die="" expression="" von="" tgf-="" 1="" (p="">< 0,01,="" p="">< 0,01="" und="" p="">< 0,01),="" col-i="" und="" col-iii="" signifikant="" reduzierten.="" die="" in-vitro-wirkungen="" von="" cphgs="" (100,="" 75,="" 50="" und="" 25="" ug/ml)="" auf="" hsc-t6="" zeigten,="" dass="" cphgs="" die="" mrna-expression="" von="" nf-κb="" p65="" und="" col-i="" signifikant="" reduzierten="" und="" cphgs="" auch="" die="" col-i-proteinexpression="" herunterregulierten.="" schlussfolgerungen:="" cphgs="" haben="" eine="" signifikante="" wirkung="" gegen="" hepatische="" fibrose="" und="" können="" als="" hepatoprotektive="" mittel="" zur="" behandlung="" von="" hepatischer="" fibrose="" verwendet="">

Schlüsselwörter: Leberfibrose, Cistanche tubulosa, Phenylethanolglykosid, Chemokin BSA, Prävention und Therapie.

Hintergrund

Leberfibrose ist eine Wundheilungsreaktion auf eine schwere Leberschädigung, die bei der Pathogenese einer durch verschiedene Faktoren induzierten chronischen Hepatitis auftritt. Diese Faktoren sind virale Infektionen, Alkoholmissbrauch, Cholestase sowie Stoffwechsel- und Autoimmunerkrankungen [1–3]. Eine fortschreitende Akkumulation der extrazellulären Matrix (ECM) und ein verminderter Umbau stören die normale Architektur der Leber, was zu einer Leberfibrose führt [4]. Leberfibrose ist kritisch bei chronischen Lebererkrankungen und entwickelt sich oft zu irreversibler Zirrhose und Karzinogenese. Gegenwärtig gibt es keine Methoden oder wirksame Arzneimittel zur Behandlung von Leberfibrose. Daher ist es dringend erforderlich, ein Medikament gegen hepatische Fibrose zu finden, das das Fortschreiten einer Leberschädigung zu Fibrose und Krebs abschwächt.Cistanche tubulosaW (aus der Familie der Orobanchaceae) ist eine parasitäre Pflanze, die in der südlichen Region von Xinjiang in China weit verbreitet ist [5]. Die Menschen verwenden es normalerweise, um die Nieren zu stärken, das Blut zu nähren, den Darm zu entspannen und die Alterung zu verzögern. Es ist offiziell im Chinesischen Arzneibuch aufgeführt [6]. C. tubulosa enthält eine Vielzahl aktiver Komponenten. Diese beinhaltenPhenylethanolglykoside aus Cistanche(CPhGs), Iridoide und Polysaccharide. Als eine von vielen aktiven Komponenten inC. tubulosa, haben CPhGs sowohl in In-vivo- als auch in In-vitro-Studien überzeugende antioxidative, Anti-Müdigkeits-, neuroprotektive und entzündungshemmende Wirkungen gezeigt [7]. In den letzten Jahren wurde berichtet, dass CPhGs (Phenylethanolglykoside aus Cistanche) haben hepatoprotektive Wirkungen. Mögliche Mechanismen, die diesen Wirkungen zugrunde liegen, sind das Abfangen freier Radikale, der Schutz der Lebermembranen, die Immunregulierung, die Hemmung der Apoptose, die Hemmung der Expression von HBsAg und HBeAg und die Hemmung der HBV-DNA-Replikation und andere [8–11]. Allerdings befassen sich nur wenige Studien in der Literatur mit der antihepatischen Fibrosewirkung von Grafiken. Daher zielte diese Studie darauf ab, die anti-hepatische Fibrose-Wirkung von GPhCs zu untersuchen, indem ein Modell von Rinderserumalbumin (BSA)-induzierter hepatischer Fibrose bei Ratten verwendet wurde. Verwandte molekulare Mechanismen wurden in HSC-T6-Zellen untersucht.

Methoden

Chemikalien und Reagenzien

Ein Hydroxyprolin-Kit (alkalische Hydrolyse) (Charge: 20140616) wurde vom Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (China) erworben. Ratten-TGF- 1-Sandwich-ELISA-Kits (Charge: 238240615) wurden von Lianke Biotech Co., Ltd. (China) bezogen. Kaninchen-Anti-Kollagen-I-Antikörper (Charge: 140619), Kaninchen-Anti-Collagen-III-Antikörper (Charge: 980788 W) und Kaninchen-Anti-TGF- 1-Antikörper (Charge: 140619) wurden von Beijing Biosynthesis Biotechnology Co. bereitgestellt, LTD (China). Eingeschlossen mit normalem Schafserum (Arbeitsflüssigkeit) (Charge: WP141214), PV-6000 (Charge: WK141225) und DAB-Kit (Charge: K136621D) wurden von Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (China) erworben. . Der Nachweis von primären Antikörpern wurde unter Verwendung von 2. Antikörperlösung (Alk-Phos. Konjugiert, Anti-Kaninchen) und 2. Antikörperlösung (Alk-Phos. Konjugiert, Anti-Maus) (Charge: 272387), bezogen von Invitrogen Company (USA), durchgeführt ). Rinderserumalbumin (BSA) (Charge: SLBG8239V) wurde von Sigma (USA) gekauft. Vor der Verwendung wurde BSA mit 18 g/l in normaler Kochsalzlösung hergestellt, die Bakterien durch Filtration entfernt und BSA bei 4 Grad gelagert. Freunds unvollständiges Adjuvans, enthaltend 1 g Lipid aus Schafshaar (Charge: AF0220LA14, Shanghai Yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (China), wurde mit 2 g flüssigem Paraffin (Charge: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.(China), sterilisiert in einem Dampfautoklaven und bei 4 Grad gelagert.Das positive Arzneimittel BJRG wurde als Biejiarangan-Tabletten von Inner Mongolia FuruiMedical Science Co., Ltd. (China) erhalten.BJRG-Arzneimittelvorräte wurden durch Auflösenhergestellt BJRG-Tabletten in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 600 mg/kg.

Pflanzenmaterialien

C. tubulosa(Orobanchaceae-Familie) wurde aus der Minfeng-Region von Xinjiang in China gekauft. Das Material wurde von dem Forscher Jun Zhao, Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of Materia Medica of Xinjiang, authentifiziert. Belegexemplare wurden im Institut für Materia Medica in Xinjiang hinterlegt.

Erstellung von CPhGs(Phenylethanolglykoside aus Cistanche)

Getrocknete und geschnittene Rhizome vonC. tubulosa(6,0 kg) wurden nacheinander dreimal mit 70-prozentigem Ethanol unter Rückfluss extrahiert, und das Lösungsmittel wurde entfernt, um den Ethanolextrakt zu ergeben. Ethanolextrakte wurden unter Verwendung von AB-8-Harz gereinigt, um die Phenylethanolglykoside (CPhGs) zu erhalten. Stammlösungen von CPhGs, die für verschiedene Dosisgruppen in Tierversuchen verwendet wurden (500 mg/kg, 250 mg/kg bzw. 125 mg/kg), wurden in 0,5 Prozent (5 g/l) Carboxymethylcellulose (Natriumsalz) gelöst.

Quantifizierung von CPhGs(Phenylethanolglykoside aus Cistanche)

Die Gehalte von zwei Komponenten (Echinacosid und Acteosid) in den CPhGs wurden durch HPLC unter Verwendung einer zuvor beschriebenen Methode bestimmt (Zhang et al. 2004) [12]. HPLC wurde unter Verwendung eines Shimadzu LC-10A HPLC, ausgestattet mit einem UV-Detektor, durchgeführt. Die HPLC-Säule war eine Phenomenex Gemini ODS-Säule (250 × 4,6 mm, 5 &mgr;m). Die isokratische mobile Phase bestand aus Methanol-Acetonitril -1 Prozent Essigsäure (15:10:75, v/v/v). Die Elution dauerte 40 min und die Fließgeschwindigkeit wurde bei 0,6 ml/min gehalten. Die Säulentemperatur wurde konstant bei 30 Grad gehalten. Die UV-Detektion erfolgte bei 334 nm.

Tiere und HSC-T6-Zelllinie

[Grad SPF] Gesunde erwachsene männliche Sprague-Dawley (SD)-Ratten (180–220 g) wurden vom Xinjiang Medical University Animal Center, Lizenz-Nr.: SCXK (neu) 2011–0004, gekauft. Ratten wurden mit spezifisch pathogenfreiem (SPF) Futter gefüttert. Alle Verfahren im Zusammenhang mit den Tierversuchen wurden von der Tierethikkommission des First Affiliated Hospital der Xinjiang Medical University genehmigt. Die Ratten wurden in Käfigen unter kontrollierten Umgebungsbedingungen (25 Grad und ein 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus) gehalten und hatten freien Zugang zu Standardfutter für Rattenpellets und Leitungswasser. Die Ratten wurden vor der Behandlung akklimatisiert. Eine immortalisierte hepatische Sternzelllinie der Ratte, HSC-T6, wurde von Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. erhalten. (Wuhan, China). HSC-T6-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (High Glucose) (DMEM, Peking, China), ergänzt mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (Gibco, Südamerika), 100 IE/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin (Peking , China) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad mit 5 Prozent CO2.

BSA-induzierte Leberschädigung und Behandlungen

Fünfundsiebzig SD-Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in sechs Gruppen eingeteilt: Normal (mit destilliertem Wasser behandelt), Modell (BSA-behandelt), positives Medikament (BSA-behandelt plus BJRG 600 mg/kg/Tag) und BSA-behandelt plus CPhGs(Phenylethanolglykoside aus Cistanche)(125, 250, 5{{20}}0 mg/kg/Tag) Gruppen. BSA-behandelte plus CPhGs (125, 250, 500 mg/kg/Tag) Gruppen hatten 13 Ratten in jeder Gruppe und die andere Gruppe hatte 12 Ratten in jeder Gruppe. Das BSA-induzierte Leberschädigungsmodell wird in primäre Sensibilisierung gefolgt von einem immunologischen Angriff unterteilt [13]. Mit Ausnahme der normalen Gruppe wurden den anderen Gruppen mehrere subkutane Injektionen mit 0,5 ml (9 mg/ml) BSA Freund's unvollständigem Adjuvans am Tag 1, Tag 15, Tag 22, Tag 29 und Tag 36 zur primären Sensibilisierung verabreicht. Sieben Tage nach der fünften Injektion wurde Blut durch den retinalen Venenplexus der Ratte entnommen und auf Serumalbumin-Antikörper getestet. BSA-Antikörper im Rattenserum wurden durch ein Doppel-Agar-Diffusionsverfahren nachgewiesen. Die Angriffsinjektion wurde durchgeführt, indem 0,4 ml BSA in normaler Kochsalzlösung durch die Schwanzvene in BSA-Antikörper-positive Ratten zweimal pro Woche zehnmal verabreicht wurden. Die Konzentrationen und Injektionszeiten waren 5.00, 5.50, 6.00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 und 10.00 g/L an Tag 46, Tag 50, Tag 53, Tag 57, Tag 60, Tag 64, Tag 67, Tag 71, Tag 74 bzw. Tag 78. In der Normalgruppe wurde anstelle von BSA normale Kochsalzlösung für immunologische primäre (Sensibilisierung) und sekundäre (Attacke) Injektionen verwendet, und andere Bedingungen waren die gleichen wie in der Modellgruppe. Der normalen Gruppe wurde destilliertes Wasser mit einer Dosis von 10 ml/kg/Tag oral verabreicht. Der Modellgruppe wurden 10 ml/kg/Tag einer 0,5-prozentigen CMC-Na-Lösung oral verabreicht. Der positiven Arzneimittelgruppe wurden 600 mg/kg/Tag BJRG oral verabreicht. Die mit BSA behandelten plus CPhGs (125,

250 und 500 mg/kg/Tag) wurden oral 125, 250 und 500 mg/kg/Tag CPhGs verabreicht(Phenylethanolglykoside aus Cistanche), beziehungsweise. Die Ratten setzten die tägliche Dosierung zwei Wochen lang nach der letzten Injektion fort. Nach dem Versuchszeitraum wurden die Ratten 12 h vor 10-prozentigem Chloralhydrat fasten gelassen und dann sofort eingeschläfert. Von jeder Ratte wurden Serumproben gesammelt und sofort verwendet. Lebern wurden für zwei Zwecke geerntet: (1) Konservierung in flüssigem Stickstoff für Hyp-Kits und (2) Fixierung in 10 % Formaldehyd für histologische und immunhistochemische Untersuchungen. Die Gesamtdauer der Tierversuche betrug 93 Tage.

Leber- und Milz-Indizes

Leber und Milz wurden durch Laparotomie präpariert und mit 4 Grad normaler Salzlösung gewaschen. Nach Aufnahme von überschüssigem Wasser mit Filterpapier wurden Leber und Milz gewogen, um die entsprechenden Indizes zu berechnen: Relatives Organgewicht=Organmasse (g)/individuelle Körpermasse (g) × 100 Prozent [14].

Zellexperimente

HSC-T6-Zellen wurden in eine 96--Well-Platte plattiert. Anfänglich wurden die Zellen mit DMEM kultiviert, das 1 0 Prozent FBS für 48 h enthielt. Das Medium wurde dann durch DMEM ohne FBS ersetzt, um die Zellen für 12 h auszuhungern. Die Zellen wurden dann mit DMEM kultiviert, das 5,0 ng/ml TGF- 1 (ohne FBS) für 24 h enthielt. Schließlich unterschiedliche Konzentrationen von CPhGs(Phenylethanolglykoside aus Cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml und 25 ug/ml), Acteosid (6 ug/ml, 3 ug/ml und 1,5 ug/ml) und Echinacosid (500 ug/ml, 250 ug/ml und 125 ug/ml) wurden in der Platte in vierfacher Ausführung durchgeführt und für 48 h inkubiert.

Echtzeit-PCR-Analyse

Das mRNA-Expressionsniveau von NF-κB, p65 und Kollagen I wurde durch Echtzeit-PCR bestimmt. Um mRNA-Expressionen in HSC-T6-Zellen zu bestimmen, wurden die Zellen (4 × 105 Zellen) in Platten mit sechs Vertiefungen mit 3 ml DMEM mit 10 Prozent FBS ausgesät und über Nacht bei 37 Grad und 5 Prozent CO2 inkubiert, danach die Zellkulturmedien wurden auf serumfreies DMEM umgestellt. Als nächstes CPhGs(Phenylethanolglykoside aus Cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml und 25 ug/ml), Acteosid (6 ug/ml, 3 ug/ml und 1,5 ug/ml) und Echinacosid (500 ug/ml). , 250 ug/ml und 125 ug/ml) wurden in die Vertiefungen gegeben. Nach 48-stündiger Inkubation mit CPhGs oder monomeren Zusammensetzungen wurde Gesamt-RNA unter Verwendung von TRIzol-Reagens (Invitrogen, USA) extrahiert und 15 s lang kräftig mit Chloroform geschüttelt. Nach 3 min Stehen bei Raumtemperatur wurde das Lysat bei 12,000 × g 15 min bei 4 Grad zentrifugiert. RNA in der wässrigen Phase wurde mit Isopropanol ausgefällt, und die obere wässrige Phase wurde in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt. RNA wurde durch Zugabe von 0,75 Prozent Ethanol ausgefällt, wonach das Mikrozentrifugenröhrchen entfernt und bei 12 000 × g bei 4 Grad für nicht mehr als 5 Minuten zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde entfernt und die RNA 5–10 min bei Raumtemperatur getrocknet. Spezifische Primersätze (Sangon, Shanghai, China), die zur Amplifikation von Ratten-Aktin [GenBank: NM_031144.3], Collagen I [GenBank: NM_ 053304.1] und NF verwendet wurden -κB p65 [GenBank: NM_199267.2]-Gene wurden unter Verwendung von Batch-Primer 3 entworfen. Die Vorwärts- (fw) und Rückwärts- (rv) Primer waren wie folgt: Collagen I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (w: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -Aktin (w: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G, rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Die Ergebnisse wurden auf die mRNA des Housekeeping-Gens Aktin als interne Kontrolle normalisiert und sind als relative mRNA-Spiegel dargestellt. Die Reaktionen wurden mit 8 μl iQ SYBR Green Supermix, 1 μl 10 pM Primerpaar, 8,5 μl destilliertem Wasser und 2,5 μl cDNA durchgeführt. Jede Polymerase-Kettenreaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 95 Grad für 3 Minuten, dann 40 Zyklen von 10 s bei 95 Grad, 30 s bei 55 Grad und 10 s bei 55 Grad – 95 Grad für die Verlängerung, gefolgt von einer einzelnen Fluoreszenzmessung . Die Endergebnisse wurden mit den relativen Werten (2-ΔΔCt) beschrieben. Berechnung und Analyse wurden mit dem iQ5 Real-Time PCR Detection System durchgeführt.

Western-Blot-Analyse

Kollagen I (Abcam, Cambridge, UK, Art. Nr.: ab34710) Proteinexpressionsniveaus wurden durch Western Blotting bestimmt [mit -Actin (Charge: 60008-1-lg; Proteintech, China) als Haushaltskontrolle. Ganzzellextrakte wurden unter Verwendung von Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA) (Thermo Scientific, USA) Puffer mit 1 Prozent Halt-Protease-Inhibitor-Cocktail (Thermo Scientific, USA) und 1 Prozent Halt-Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (Thermo Scientific, USA) hergestellt. Die Proteinkonzentration wurde nach der Bradford-Methode gemessen und quantifiziert [18]. Protein (10–50 ug) wurde auf einem 10-prozentigen SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und auf PVDF-Membranen (Millipore, USA) übertragen. Die Membranen wurden für 1 h bei Raumtemperatur mit 5 % BSA blockiert, und die primären Antikörper (Anti-Colla gen I-Antikörper, 1:200-Verdünnung oder Maus-mAb von -Actin, 1:5000-Verdünnung) wurden über Nacht bei 4 Grad inkubiert. Das entsprechende Alk-Phos. konjugierte sekundäre Antikörper wurden bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurden die Membranen dreimal mit 1 × Tris-HCl-Kochsalzlösung mit 0,1 Prozent Tween 20 gewaschen, und die Signale wurden gescannt und mit dem GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad) visualisiert. An den interessierenden Proteinen wurde eine densitometrische Analyse durchgeführt und durch die GEL DOC Image Studio-Software (Bio-Rad) auf -Actin normalisiert. -Aktin wurde als interne Kontrolle verwendet.

statistische Analyse

Der Shapiro-Wilk-Normalitätstest und der Levene-Varianzhomogenitätstest wurden angewendet, um die Normalität zu verifizieren, und You et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Seite 4 von 13Homogenität der Varianz. Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Tukey's Post-Hoc-Test, wurde verwendet, um statistische Unterschiede inhomogener, normalverteilter Daten zu identifizieren. Der nichtparametrische Kruskal-Wallis-Test wurde verwendet, um Daten zu analysieren, die nicht normalverteilt oder homogen sind. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die Signifikanz wurde auf P < 0,05="" festgelegt.="" alle="" daten="" wurden="" mit="" spss="" 16.0="" software="" (xinjiang="" medical="" university)="">

Ergebnisse

Quantitative Bestimmung von CPhGs

CPhGs in C. tubulosa enthalten zwei Phenylethylalkoholglykoside, Echinacosid und Acteosid, und ihr Gehalt in den CPhGs wurde durch HPLC-Analyse (Fig. 1) mit 42,71 ± 0,42 Prozent und 14,27 ± {{7 }}.18 Prozent .

Leber- und Milz-Indizes

Wie Tabelle 1 zeigt, waren die Leber- und Milzindizes der Modellgruppe signifikant erhöht [P < 0.01,="" p="">< 0,05].="" die="" leber-="" und="" milzindizes="" des="" positiven="" medikaments="" bjrg="" und="" cphgs="" waren="" bei="" verschiedenen="" dosisgruppen="" im="" vergleich="" zur="" modellgruppe="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0" signifikant="" reduziert.="" 004,="" pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070]." die="" leber-="" und="" milz-indizes="" waren="" niedriger="" als="" die="" der="">

Auswirkungen von CPhGs auf ALT-, AST-Aktivitäten und Leberfibrose-Marker

In der vorliegenden Studie waren die Serumspiegel der hepatischen Enzyme AST und ALT in der Modellgruppe signifikant erhöht, was eine hepatozelluläre Schädigung bei BSA-induzierten Leberfibrose-Ratten widerspiegelt. Allerdings sind die Experimente.

zeigten, dass die Behandlung mit BJRG (600 mg/kg) und CPhGs (125, 250 und 5{{10}}0 mg/kg) signifikant verringerte AST [PAST < 0.0{{60}}1,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001="" ,="" bzw.]="" und="" alt="" [palt="0,117," palt="0,139," palt="0,189," palt="0,255]" bei="" ratten="" mit="" leberfibrose="" .="" (tabelle="" 2).="" die="" spiegel="" von="" ha,="" ln,="" pc="" und="" iv-c="" bei="" modellratten="" waren="" signifikant="" erhöht="" [pha="">< 0,001,="" pln="">< 0,001,="" ppciii="0,002," piv-c="">< 0,001].="" verglichen="" mit="" der="" modellgruppe,="" die="" niveaus="" von="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023]," ln="" [pln="0.011," p="" ln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069]," pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296]" und="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001]="" bei="" ratten="" wurden="" durch="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" und="" cphgs="" in="" verschiedenen="" dosisgruppen="" (125,="" 250="" und="" 500="" mg/kg)="" (tabelle="" 3).="" der="" hyp-gehalt="" und="" der="" tgf-="" 1-kollagengehalt="" wurden="" auch="" durch="" messen="" der="" hyp-spiegel="" im="" lebergewebe="" nachgewiesen.="" wie="" in="" tabelle="" 4="" gezeigt,="" ist="" der="" mittelwert="">Der Spiegel in der Modellgruppe war signifikant höher als in der Normalgruppe, aber er war in der BJRG-Gruppe und den verschiedenen CPhG-Dosisgruppen deutlich verringert. Die hepatische Konzentration von TGF{{0}} der Modellgruppe bei Ratten war signifikant erhöht [P < 0.001].="" verglichen="" mit="" der="" modellgruppe="" waren="" die="" tgf-="" 1-spiegel="" des="" positiven="" arzneimittels="" und="" der="" verschiedenen="" cphg-dosisgruppen="" deutlich="" erniedrigt="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001].="" die="" ergebnisse="" sind="" in="" tabelle="" 4="">

Histopathologische Untersuchung

Beobachtungen normaler Lebergewebeschnitte, die mit H&E und Masson's Trichrom gefärbt wurden, zeigen deutliche Leberläppchen und Lebersinusoide. Die Struktur des Lebergewebes bei den Modellratten war gestört, und das Lebergewebe und die Lebersinusoide wurden durch eine große Menge an Bindegewebe ersetzt. Allerdings wurden in der Behandlungsgruppe eine normalere Zytoarchitektur und weniger Bindegewebe festgestellt als in der Modellgruppe.

H&E-Färbung

In der normalen Gruppe wurde eine strukturelle Integrität des Leberläppchens ohne abnormale Portalbereiche und hepatische Sinusoide beobachtet. Die Leberstränge waren ordentlich angeordnet, mit einem runden und klaren Kern. Die Kerne befinden sich im Zentrum der Zelle mit reichlich Zytoplasma. Nur der Portalbereich weist eine geringe Menge fibröses Gewebe auf (Abb. 2a). In der Modellgruppe war die lobuläre Struktur stark geschädigt. Leberzellen zeigten eine leichte wässrige Degeneration, meist eine ballonierende Degeneration und/oder eine fettige Degeneration. Die Bildung einer entzündlichen Zellinfiltration, einer ausgedehnten fibrösen Gewebehyperplasie, der Bildung einer großen Anzahl des fibrösen Septums, gespaltener Läppchen und einer signifikanten Proliferation von Leberzellen wurde ebenfalls beobachtet. Diese Beobachtungen bestätigten den Erfolg der Etablierung des Ratten-Immunschädigungs-Tiermodells für Leberfibrose (Fig. 2b). Im Vergleich zur Modellgruppe zeigte sich bei den verschiedenen CPhGs eine Reduktion der Entzündungszellinfiltration. Außerdem wurden weniger Nekrose und Verfettung der Leberzellen sowie eine Linderung der Fibrose beobachtet. CPhGs milderten signifikant die Pathologie von BSA-induzierter Leberfibrose bei Ratten, linderten das Anschwellen von Leberzellen und verhinderten effektiv Hepatozytennekrose und Infiltration von Entzündungszellen, was darauf hindeutet, dass CPhGs eine schützende Wirkung auf BSA-induzierte Leberfibrose von Ratten ausüben. (Abb. 2c–f). Masson-Trichrom-Färbung In der Normalgruppe war das Lebergewebe normal. Der hepatische Portalbereich zeigte eine geringe Anzahl blauer Kollagenfasern, und das Lebergewebe war normal strukturiert (Abb. 3a). Verglichen mit dem Lebergewebe der normalen Gruppe proliferierte fibröses Gewebe durch das zentrale Blatt und breitete sich in das Leberparenchym aus. Kollagenfasern erweitert und verbunden und

umhüllte den gesamten Läppchen und umgab die Zentralvene. Diese Effekte lieferten zusammen mit Hepatozytenfibrose, lobulärer Strukturschädigung, periportaler Fibrose und Pseudolobulusbildung (Abb. 3b) den Beweis dafür, dass das Modell etabliert war. Verglichen mit der Modellgruppe waren die Kollagenfasern in der positiven Arzneimittelkontrollgruppe vom peripheren Portalbereich leicht nach außen verlängert (Abb. 3c). Im Vergleich zur Modellgruppe waren die Kollagenfasern in den verschiedenen CPhGs-Dosisgruppen signifikant reduziert, die Faserproliferation gehemmt und die Proliferation von fibrösem Gewebe innerhalb des Leberparenchyms signifikant reduziert. Diese Ergebnisse legten nahe, dass CPhGs Ratten vor BSA-induzierter Leberfibrose schützten (Abb. 3d–f).

Immunhistochemische Färbung

Wichtig ist, dass die Expression von Kollagen Typ I und Kollagen Typ III eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung von Leberfibrose spielt, und ihre Erzeugung und Ablagerung im Lebergewebe könnte als wichtige Determinante der Wirksamkeit gegen hepatische Fibrose dienen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst

Kollagen Typ I

Die normale Gruppe exprimierte Kollagen Typ I hauptsächlich in den Blutgefäßen und im Portalbereich. Die Modellgruppe exprimierte stark vaskuläre Kollagen-Typ-I-Fibrose in Portalbereichen. Im Disse-Raum wurde eine Kollagen-Typ-I-Färbung als Streifen oder als ungleichmäßige Verteilung beobachtet. Kollagenumhüllte faserige Septen zur Bildung von Pseudolobuli. In diesen Experimenten wurden weniger fibröse Septen für BJRJ (600 mg/kg) und verschiedene Dosisgruppen von CPhGs (125, 250 und 500 mg/kg) gebildet [PCol I=0.002, PCol I {{ 6}}.001, PCol I=0.023 bzw. P Col I=0.044]. Die semiquantitativen Ergebnisse zeigten, dass die Expression ihres Kollagens Typ I im Vergleich zur Modellgruppe signifikant geringer war (Abb. 4).

Kollagen Typ III

Kollagen Typ III wurde in der normalen Gruppe schwach exprimiert, und periphere Bereiche rund um die Pfortader und Lebervenen zeigten eine kleine Menge feiner gelber anstelle von kontinuierlichen Fasern (Abb. 5a). In der Modellgruppe zeigten Kollagenfasern breite und dicke Schnüre, was auf eine starke Expression hinweist, die hauptsächlich in den Portal- und Fasergewebebereichen lokalisiert ist (Abb. 5b). Kollagenfasern von BJRJ (600 mg/kg) und verschiedenen Dosisgruppen von CPhGs (125, 250 und 500 mg/kg) waren filamentös und um die zentralen Venen- und Pfortaderbereiche herum verteilt. Im Vergleich zur Modellgruppe waren die Kollagenfasern signifikant reduziert, die Färbung war blass und dünn und die immunhistochemische Färbung war schwach positiv (Abb. 5c–f). Diese halbquantitativen Ergebnisse zeigen, dass die positiv exprimierten Zellen in den positiven und unterschiedlichen Dosisgruppen [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PCol III=0.010 und P Col III=0.037] unterschieden sich von denen in der Modellgruppe.

TGF- 1

Es gab eine geringe Expression von TGIF{{0}} in normalen Rattenleberzellen. Die Expression war auf eine kleine Anzahl interstitieller Zellen beschränkt (Fig. 6a). In der Modellgruppe war die TGF- 1-Expression im Portalbereich, in fibrösen Zwischenräumen, hepatischen Sternzellen, Entzündungszellen, der Sinuswand und im Zytoplasma weit verbreitet. Ein bestimmter Portalbereich zeigte einen stark positiven Ausdruck mit bräunlich-gelber Färbung (Abb. 6b). Es gab eine kleine Expressionsmenge im Portalbereich und in fibrösen Septen von BJRJ (600 mg/kg) und verschiedenen Dosisgruppen von CPhGs (125, 250 und 500 mg/kg). Das Ausmaß der positiven Färbung war in diesen Gruppen im Vergleich zur Modellgruppe signifikant reduziert. Die Färbung in den interstitiellen Zellen in den fibrösen Septen und im Zytoplasma von Entzündungszellen war verringert (Abb. 6c–f). Semiquantitative Ergebnisse zeigten, dass BJRJ und verschiedene Dosisgruppen von CPhGs [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0,001,="" p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0" .004]="" waren="" im="" vergleich="" zur="" modellgruppe="" signifikant.="" wie="" früher="" in="" diesem="" artikel="" erwähnt,="" ist="" tgf-="" 1="" ein="" wichtiges="" zytokin="" in="" der="" pathophysiologie="" der="">

Fibrose, die die Produktion von extrazellulärer Matrix stimuliert [19]. Wir zeigten, dass der TGF- 1-Spiegel in der Modellgruppe in einer Weise anstieg, die mit dem Schweregrad der Leberfibrose übereinstimmte. Die Expressionsspiegel von TGF- 1 in der Leber stimmten mit den Serum-TGF- 1-Spiegeln überein. Dies weist darauf hin, dass CPhGs die Leberfibrose aufgrund der TGF- 1-Expression signifikant verringern können, indem sie an der Synthese und dem Abbau von ECM teilnehmen. Die Expression von Kollagen Typ I, Kollagen Typ III und TGF- 1 kann den pathologischen Prozess der Leberfibrose nachweisen. Ihre Expressionsniveaus in den Behandlungsgruppen waren signifikant verringert und zeigten, dass CPhGs die Kollagenaseaktivität verbessern können, indem sie das dynamische Gleichgewicht der Leber-ECM-Synthese und -Abbau aufrechterhalten und so die Bildung von Leberfibrose verzögern und verhindern.