Cistanche Tubulosa schützt dopaminerge Neuronen durch Regulierung der Apoptose und des von Gliazellen abgeleiteten neurotrophen Faktors: in vivo und in vitro

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine neurodegenerative Erkrankung mit dem pathologischen Kennzeichen eines reduzierten nigrostriatalen Dopamins. In der klinischen Praxis der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) hat das Nanopulver von Cistanche tubulosa therapeutische Wirkungen auf PD. Um den therapeutischen Mechanismus zu identifizieren, testete diese Studie die Schutzwirkung verschiedener Dosen von MPP plus -induzierter Toxizität in MES23.5-Zellen unter Verwendung des MTT-Assays und in 1-Methyl-4-phenyl-1 ,2,3,6-Tetrahydropyridin (MPTP)-induzierte PD-Mäuse (Vehikel). Immunhistochemie wurde verwendet, um die Zytomorphologie und die Tyrosinhydroxylase (TH)-Expression zu beurteilen. Verhaltenstests in Fahrzeugen, Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-Tests in Dopamin, Immunhistochemie und Western-Blot-Analyse wurden verwendet, um die Expression von TH, dem von Gliazelllinien abgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF) und seinen Rezeptoren nachzuweisen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass das Nanopulver von Cistanche tubulosa die Lebensfähigkeit von mit MPP plus behandelten Zellen verbesserte, die TH-Expression erhöhte und die Anzahl apoptotischer Zellen verringerte. Es erhöhte auch die Bcl2-Proteinexpression und unterdrückte die Bax-Proteinexpression in MPP plus -behandelten Zellen in dosisabhängiger Weise.

Zusätzlich,Zistanchetubulosa-Nanopulver verbesserte die Verhaltensdefizite bei Vehikelmäusen, reduzierte die Dauer des stationären Schwimmens, verbesserte die Fähigkeit zu spontaner Aktivität und erhöhte die Expression von GDNF, dem Rezeptor alpha (GFR 1) der GDNF-Familie, und Ret in Zellen der Substantia nigra ( SN).

Darüber hinaus stieg die Proteinexpression von GDNF, GFR 1 und Ret nach der Behandlung mit unterschiedlichen Dosen anZistanchetubulosa-Nanopulver, mit einem signifikanten Unterschied zwischen der Hochdosis- und der Vehikelgruppe. Die Proteinexpression von Bcl2 und Bax war in vivo und in vitro ähnlich, was darauf hindeutetZistanchetubulosa Nanopulver hat antiapoptotische Wirkungen in Neuronen.

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Einführung

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine häufige neurodegenerative Erkrankung, die bei älteren Menschen mit den pathologischen Manifestationen des Verlusts von dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra (SN) aufgrund von Degeneration auftritt. Die Schwere der Krankheit korreliert mit dem Verlust von Dopamin (DA)-Neuronenzellen im SN, was mit der Ansicht übereinstimmt, dass der neurodegenerative Prozess über viele Jahre fortschreitet, bevor irgendwelche Symptome auftreten (Sawle und Myers, 1993). Die fortschreitende Natur der Krankheit legt interessante Möglichkeiten für einen therapeutischen Eingriff nahe, indem der zugrunde liegende neurodegenerative Prozess blockiert wird. Die Suche nach therapieinduzierten potenten und spezifischen Wirkungen von neurotrophen Faktoren auf das Überleben von DA-Neuronen ist daher von erheblichem Interesse.

Neurotrophe Faktoren sind essentielle Proteine, darunter der Nervenwachstumsfaktor (NGF), der aus dem Gehirn stammende neurotrophe Faktor (BDNF) und der aus Gliazellen stammende neurotrophe Faktor (GDNF), die das Nervenwachstum, die neurologische Entwicklung, die axonale Führung und die neuronale Funktion fördern. Unter allen neurotrophen Faktoren, die dopaminerge Neuronen schützen und deren Reparatur fördern, hat GDNF die stärkste Wirkung (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). Es wurde gezeigt, dass GDNF in vitro starke neurotrophe Wirkungen auf DA-Neuronen besitzt (Lin et al., 1993) und in vivo neuroprotektive Wirkungen ausübt. Es wurde gezeigt, dass GDNF nigrale DA-Neuronen vor dem läsionsinduzierten Zelltod nach chirurgischer oder Toxin-induzierter Axotomie bei Ratten (Beck et al., 1995; Kearns und Gash, 1995; Sauer et al., 1995) und teilweise auch danach rettet systemische Verabreichung von N-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) bei Mäusen (Tomac et al., 1995). Die erhöhte Inzidenz neuronaler Apoptose und verringerte Schutzwirkungen neurotropher Faktoren, die möglicherweise durch verschiedene pathologische Faktoren ausgelöst werden, liegen der Degeneration von dopaminergen Neuronen zugrunde (Holden et al., 2006).

Zistanchetubulosa ist ein pflanzliches Arzneimittel, das aus mehreren Pflanzen der Gattung Cistanche stammt. Es ist eine wichtige therapeutische Option für das Niereninsuffizienzsyndrom, das in der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) eng mit Androgenhormonen verwandt ist. Bis heute viel klinische und Grundlagenforschung aufZistanchetubulosa haben die Aktivität von neurodegenerativen Erkrankungen gezeigt. Die Identifizierung von nierentonisierenden Verschreibungen der TCM in der PD-Behandlung kann daher eine alternative klinische Behandlung für PD bieten. Echinacosid (ECH) ist ein wichtiger bioaktiver Bestandteil der HeilpflanzeZistancheTubulus. Studien haben die therapeutischen Wirkungen von Glykosiden von Cistanche und ECH, Verbascosid (VER) und Icariin (ICA) auf Alzheimer-Krankheit (AD), PD und andere Patienten mit vaskulärer Demenz gezeigt (Urano und Tohda, 2010; Wang et al., 2013 ; Wu et al., 2014). Wu et al. (2014) schlug vor, dass cistanche. tubulosa-Extrakte, die genügend ECH und Acteosid enthielten, verbesserten die kognitive Dysfunktion, die durch A -42 verursacht wurde, indem sie die Amyloidablagerung blockierten und die cholinerge und hippocampale dopaminerge neuronale Funktion umkehrten. Taoet al. (2015) fanden heraus, dass Phenylethanoidglykoside aus Cistanche tubulosa (Ph Gs-Ct) Hirnödeme in großer Höhe verhinderten, indem sie die Protein- und mRNA-Expression von AQP4 im Gehirngewebe von Rattenmodellen verringerten.

Frühere Studien haben gezeigt, dass chinesische Kräuterverbindungen, einschließlich der drei Inhaltsstoffe vonZistanchetubulosa, epimedium und rhizoma polygonal, verringerten Schäden an dopaminergen Neuronen und erhöhten den Dopaminspiegel, indem sie die Expression neurotropher Faktoren regulierten (Wu et al., 2013).

Somit ist noch nicht bekannt, ob dieZistanchetubulosa-induzierte neuroprotektive Wirkungen langanhaltend sind und inwieweit die Rettung von nigralen DA-Neuronen durch Verabreichung von GDNF eine signifikante Erhaltung motorischer Verhaltensweisen, die für die Symptomatologie von PD-Tieren relevant sind, leisten kann. Diese Studie verwendete ein nierentonifizierendes TCM-Rezept,Zistanchetubulosa-Nanopulver, das in China ein nationales Patent (Patentnummer: 2011103028541) erhalten hat und zuvor eine gewisse therapeutische Wirkung bei Parkinson gezeigt hat. Die vorliegende Studie wurde daher entwickelt, um die neuroprotektiven und regenerativen Wirkungen von zu untersuchenZistanchetubulosa-Behandlung und zur Untersuchung der Apoptose auf den MES23.5-Zellen und verhaltensdefinitiven Ratten und der Regulierung von GDNF, gemessen durch eine Reihe von Zieltests.

Materialen und Methoden

Materialien, Reagenzien und Ausrüstung

Zistanchetubulosa wurde von Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Peking, China, bezogen. ECH, VER und ICA stammen von den National Institutes for Food and Drug Control, China. Die dopaminerge neuronale Zelllinie MES23.5 war ein Geschenk von Professor Biao Chen, Labor für Neurobiologie, Capital Medical University, Peking, China. Fünfzig männliche C57BL/6-Mäuse (mit einem Gewicht von jeweils 20–25 g) wurden von Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Lizenznummer: SCXK2012-0002), Shanghai, China, erworben.

MPP plus , MTT und Glutamin wurden von Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA) bezogen; DMEM/F12-Medium und fötales Rinderserum wurden von Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) bezogen; und MPTP, DA-Standard und Homovanillinsäure (HVA)-Standard wurden von Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA) erworben. -Aktin, Bax, Bcl2, GDNF, Rezeptor-alpha der GDNF-Familie (GFR 1) und Ret-Antikörper wurden von Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA) erworben; 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Färbereagenzkit wurde von Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, China) bezogen; und ein SDS-PAGE-Gelprobenvorbereitungskit, ein ultrasensitives verstärktes Chemilumineszenz(ECL)-Nachweiskit und ein Bicinchoninsäure(BCA)-Assay wurden vom Beyotime Institute of Biotechnology (Peking, China) erworben.

Diese Studie verwendete die folgenden Instrumente: ELX800-Mikroplattenlesegerät (Bio Tek Winooski, VT, USA); CO2-Inkubator (Heraeus, Hanau, Deutschland); Gel DOC 2000 Gelabbildungsanalysesystem, Elektrophoresezelle und Elektrophoresetank (Bio-Rad, Hercules, CA, USA); DU-650-Proteinanalysator (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA); 5417R Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland); SXQM Doppelplaneten-Kugelmühle (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, China); Mischmühle MM400 (Retsch GmbH, Haan, Deutschland); Agilent 1200 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); PowerPac Basic-Elektrophorese, PowerPac Basic-Transmembrantransfersystem, Universal Hood II Chemilumineszenz-Imager, S1000 Thermal Cycler RNA-Reverse-Transkriptionssystem (Bio-Rad); Motic Med 6.0 Gewebe- und Zellbildanalysesystem (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, China).

Vorbereitung vonZistanchetubulosa Nanopulver

Zistanchetubulosa wurde gewogen, dann gereinigt und entwässert. Nach herkömmlicher PulverisierungZistanchefeines Tubulosa-Pulver wurde durch ein 200--Maschensieb gegeben und gefriergetrocknet. Zur Herstellung wurden ein temperaturgeregeltes Vakuum und eine Hochenergie-Kugelmühle verwendetZistancheTubulosa-Nanopulver. Zuerst rohZistanchetubulosa-Nanopulver wurde in einen Vakuum-Kugelmühlentank gegeben, der mit Carbid-Mahlkugeln beladen war. Das Verhältnis zwischen Mahlkugeln und Cistanche tubulosa-Nanopulver lag im Bereich von 15:1 bis 5:1. Um ein feines Pulver zu erhalten, wurden die Geschwindigkeit und Dauer der Hochenergie-Kugelmühle auf 300 U/min bzw. 20 min eingestellt. Das feine Pulver wurde für die Verarbeitung von nanoskaligen Materialien gewogen und in der Mischmühle mit einer Frequenz von 25/s und Oszillation der 20er für drei Wiederholungen verarbeitet. PBS wurde verwendet, um eine 25-mg/ml-Stammlösung aufzulösen und herzustellen, gefolgt von 30-minütiger Ultraschallbehandlung, Autoklavieren und schließlich Lagerung bei –20 Grad.

Qualitätskontrolle der aktiven Komponenten vonZistanchetubulosa durch HPLC

ECH und VER enthielten Gradientenelution mit Octadecylsilan-gebundenem Silica als Füllstoff, Methanol als mobile Phase A und 0,1-prozentige Ameisensäurelösung als mobile Phase B. Die Detektionswellenlänge betrug 330 nm. Die ICA enthielt Gradientenelution mit Octadecylsilan-gebundenem Silica als Füllstoff und Acetonitril-Wasser (30:70) als mobile Phase. Die Detektionswellenlänge betrug 270 nm. Probe, Kontrolle und Negativkontrolle wurden für den Test mit jeweils 10 μl abgemessen.

Zellkultur- und MTT-Assay zur Messung der Lebensfähigkeit von mit MPP plus behandelten Zellen

MES23.5-Zellen wurden mit 5 % fötalem Kälberserum, 1 % Glutamin, 2 % 50-facher Satos-Lösung und DMEM/F12-Medium mit 2 % Penicillin/Streptomycin inokuliert. Sie wurden bei 37 Grad in einem 5-prozentigen CO2-Inkubator mit gesättigter Feuchtigkeit inkubiert. Die Zellen wurden isoliert und mit 0,25 Prozent Trypsin passagiert und die Zellsuspension in der logarithmischen Wachstumsphase geerntet. Isolierte Zellen mit einer Dichte von 1 × 105 wurden in Polylysin-beschichtete 96-Well-Platten ausgesät, gefolgt von der Zugabe verschiedener Endkonzentrationen (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 und 800 μmol/ L) von MPP plus Medien. MES23.5-Zellen, die mit normalem Kulturmedium für 24 h und 48 h inkubiert wurden, wurden als Negativkontrollen in den in-vitro-Experimenten verwendet. Die Zellen aus den verschiedenen Behandlungsgruppen wurden für 4 h mit MTT-Reagenz inkubiert. Die Lösung in den Vertiefungen wurde anschließend verworfen und 150 μL DMSO wurden zugegeben und für 10 min oszilliert. Die Extinktion jeder Probe bei einer Wellenlänge von 570 nm wurde unter Verwendung eines automatischen Mikroplatten-Lesegeräts gemessen. Der Prozentsatz der Lebensfähigkeit der Zellen (Prozent)=mittlere Extinktion der Versuchsgruppe/mittlere Extinktion der Negativkontrollgruppe × 100 Prozent.

Relevante Konzentrationen von MPP plus Medium wurden für die 24-stündige Behandlung in MES23.5-Zellen unter Verwendung des gleichen Ansatzes wie für die In-vitro-Kultur hinzugefügt. Nach der Behandlung wurde die Lösung in der Vertiefung verworfen. Medien mit unterschiedlichen Konzentrationen (10, 50, 100, 200, 250, 500 und 1000 ug/ml) vonZistanchetubulosa-Nanopulver wurde zu den MES23.5-Zellen in verschiedenen Vertiefungen gegeben und für 24 h und 48 h inkubiert. Als Negativkontrollen dienten die MES23.5-Zellen, die für 24 h und 48 h mit normalem Kulturmedium inkubiert wurden. Als Vehikel dienten die MES23.5-Zellen, die mit MPP plus Medium inkubiert wurden. Die Messungen wurden für jede Probe dreifach durchgeführt. Die Extinktion der entsprechenden Behandlungs- und Kontrollgruppen wurde gemessen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu berechnen.

TH-Expression gemessen durch Immuncytochemie

WennZistanchetubulosa-Nanopulver in 100, 200 und 250 ug/ml war, stieg die Zellüberlebensrate signifikant an (Abbildung 2G). Daher testeten wir in nachfolgenden Experimenten die drei Konzentrationen: Gruppen mit niedriger Dosis, mittlerer Dosis und hoher Dosis. Drei Replikationen wurden für jede der getestetZistanchetubulosa-Gruppen. Sterilisierte, mit Polylysin beschichtete Deckgläser wurden in 6-Well-Platten gegeben. Als nächstes wurden 5 × 104 Zellen in jede Vertiefung ausgesät und für 24 h inkubiert. Herkömmliches frisches Medium wurde in der normalen Kontrollgruppe ersetzt und eine Endkonzentration von 100 &mgr;mol/l MPP plus Medium wurde in den verbleibenden Behandlungsgruppen ersetzt, um für 24 h zu inkubieren. Herkömmliche frische Medien wurden dann in den normalen Kontroll- und Vehikelgruppen und Endkonzentrationen von 100, 200 und 250 ug/ml ersetztZistanchetubulosa-Nanopulver wurden mit den Zellen für 24 h in der niedrigen, mittleren und hohen Dosis inkubiertZistanchetubulosa Behandlungsgruppen. Die MES23.5-Zellen in den verschiedenen Gruppen wurden dreimal in PBS gewaschen, um den Überstand zu entfernen, und weiter in 4 Prozent Paraformaldehyd für 15 Minuten fixiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit einem Peroxidaseblocker bei 37 Grad für 30 min inkubiert und dann erneut mit PBS gewaschen. Eine 0,2-prozentige Triton X-100-Lösung wurde zur Zellpermeabilisierung für 10 min verwendet, gefolgt von Waschen mit PBS.

Zu jeder Probe wurde normales Ziegenserum gegeben und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das normale Ziegenserum wurde dann entfernt und ein 1:400 in PBS verdünnter primärer Antikörper wurde zu jeder Probe gegeben und über Nacht bei 4 Grad inkubiert. Die Zellen in der negativen Kontrollgruppe wurden mit PBS bei 4 Grad über Nacht inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit Biotin-markierten sekundären Antikörpern in der Feuchtigkeitskammer bei 37 Grad für 20 min inkubiert. Jede Probe wurde dann in PBS gewaschen und mit Meerrettichperoxidase-Streptavidin-Konjugaten (Arbeitslösung C) bei 37 Grad für 20 Minuten markiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit DAB-Reagenz im Dunkeln für ca. 1–10 min gefärbt und die Entwicklung einer braunen Farbe lichtmikroskopisch verfolgt.

Jede Probe wurde dann zweimal in destilliertem Wasser für 1–2 min gewaschen und die Kerne wurden mit Hämatoxylinlösung für 0,5–1 min gegengefärbt. Nach gründlichem Spülen jeder Probe in Wasser wurden die Zellen in 1 % Salzsäurealkohol zur Differenzierung und 1 % wässriges Ammoniak eingetaucht, gefolgt von gründlichem Waschen der Zellen in Wasser. Die Zellen aus jeder Probe wurden dann in 70 % Ethanol für 2 min, 80 % Ethanol für 2 min, 90 % Ethanol für 2 min zweimal, 95 % Ethanol für 2 min zweimal und 100 % Ethanol für 2 min zweimal dehydriert. Die Zellen wurden dann zweimal für 2 min in Xylollösung eingetaucht und auf einem Objektträger aus Glas mit neutralen Harzen befestigt. Unter Lichtmikroskopie wurde jede Probe einer Bilderfassung und zufälligen Auswahl von 5–10 effektiven Gesichtsfeldern unterzogen, um die Expression ausgewählter Proteine ​​in dopaminergen Neuronen zu bestimmen, die durch die Intensität der braunen Partikel angezeigt wird, und um den Proteingehalt durch seinen durchschnittlichen Grauwert halb zu quantifizieren .

Apoptoserate von MES23.5-Zellen, gemessen durch Durchflusszytometrie

Anhaftende Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen. Zur Zellisolierung wurde eine geeignete Menge EDTA-freier Trypsinlösung bei Raumtemperatur zugegeben und die Lösung vorsichtig pipettiert, um ein Ablösen anhaftender Zellen zu ermöglichen. Dann wurde ein Zellkulturmedium zugegeben, um die Trypsinisierung zu stoppen. Die Mischung wurde in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt und dann 5 min lang bei 1500 U/min zentrifugiert, um die isolierten Zellen zu sammeln. Nach dem Verwerfen des Überstands wurde das Zellpellet vorsichtig unter Verwendung von PBS resuspendiert und die Zellen wurden gezählt. Ungefähr 1 × 10 5 bis 5 × 10 5 resuspendierte Zellen wurden für 5 min bei 1500 U/min zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Fünf Mikroliter Annexin V-FITC-Bindungslösung wurden zu dem Zellpellet gegeben, um die Zellen sanft zu resuspendieren. Weitere 5 &mgr;l Annexin V-FITC wurden hinzugefügt und gründlich gemischt. Fünf Mikroliter Propidiumiodidlösung wurden für die Zellfärbung durch 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur kurz vor der Durchflusszytometrie verwendet.

Western-Blot-Analyse für in vitro

Die Zellen wurden in eine normale Gruppe, MPP plus Behandlungsgruppe, niedrige Dosis eingeteiltZistanchetubulosa-Behandlungsgruppe, moderate DosisZistanchetubulosa Behandlungsgruppe und hochdosiertZistanchetubulosa-Behandlungsgruppe. Die Expression von Bcl2 und Bax wurde jeweils gemessen. Insgesamt 1 × 105 Zellen pro Well in der 6-Well-Platte wurden für die Modellierung und Behandlung in jeder Gruppe vor der Zellernte verwendet. Ein gemischtes Lysat, enthaltend RIPA-Puffer, Protease-Inhibitor und Phosphatase-Inhibitor, wurde hinzugefügt, um die Zellen für 30 min auf Eis zu lysieren. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand für die Proteinanalyse verwendet. Das Gesamtprotein wurde unter Verwendung eines BCA-Assays quantifiziert und durch 10 % SDS-PAGE aufgetrennt. Die aufgetrennten Proteine ​​wurden auf eine Membran übertragen und mit einem 5-prozentigen Magermilch-Blockierungspuffer bei Raumtemperatur für 2 h inkubiert. Die Membran wurde dann in primärem Antikörper (Bcl-2 0,34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, 1:200-Verdünnung) bei 4 Grad über Nacht inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde die Membran in einem sekundären Antikörper (0,5 mg/ml, 1:5000-Verdünnung) bei 4 Grad für 1 h und dann für 2 min in ECL-Entwickler zur konventionellen Entwicklung inkubiert. Für die halbquantitative Analyse der Proteinexpression wurde die Software Quantity One verwendet.

Experimentelle Tiermodellierung und Arzneimittelverabreichung

Fünfzig spezifisch pathogenfreie 8- Wochen alte männliche Mäuse wurden zufällig in fünf Gruppen eingeteilt: eine normale Gruppe, eine MPTP-Behandlungsgruppe (Vehicle), eine niedrige DosisZistanchetubulosa-Behandlungsgruppe, moderate DosisZistanchetubulosa Behandlungsgruppe und hochdosiertZistanchetubulosa-Behandlungsgruppe. Die Tiere wurden bei 20–22 Grad mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Den Mäusen in der normalen Gruppe wurde an sieben aufeinanderfolgenden Tagen ein gleiches Volumen normaler Kochsalzlösung intraperitoneal injiziert. Den Mäusen in den anderen Behandlungsgruppen wurde MPTP (30 mg/kg/d) an sieben aufeinanderfolgenden Tagen intraperitoneal injiziert, um Vehikel herzustellen.

Während der PD-Modellierung wurden die Mäuse mit niedriger Dosis, mittlerer Dosis und hoher Dosis behandeltZistanchetubulosa-Behandlungsgruppen wurden äquivalente klinische Volumina von 4 g/kg/d, 8 g/kg/d und 16 g/kg/d intragastral verabreichtZistanchetubulosa Nanopulver an 14 aufeinanderfolgenden Tagen. Den Mäusen in der Kontroll- und Vehikelgruppe wurden an 14 aufeinanderfolgenden Tagen äquivalente Volumina normaler Kochsalzlösung intragastral verabreicht. Alle experimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission der Fujian University of TCM genehmigt und wurden gemäß den international anerkannten Grundsätzen für die Verwendung und Pflege von Labortieren durchgeführt. In dieser Studie wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren.

Verhaltenstests

Schwimmtest (Zhu et al., 2014)

Die Koordination der Körperbewegung bei Mäusen wurde durch den Schwimmtest gemessen. Die Mäuse wurden einzeln in einen Wassertank (25 cm Höhe und 10 cm Durchmesser) gesetzt, der 10 cm Wasser enthielt, und in einer ruhigen Umgebung getestet, um ihre stationäre Dauer über 5 Minuten aufzuzeichnen.

Offener Feldtest (Kawai et al., 1998)

Die Bewegungsaktivität wurde unter Verwendung des Open-Field-Tests gemessen. Die Mäuse wurden in einer ruhigen und schwach beleuchteten Umgebung getestet und einzeln in einen 30 cm × 30 cm × 15 cm großen transparenten Acrylbehälter mit einem 6 cm × 6 cm großen Trenngitter am Boden gesetzt. Den Mäusen wurde 10 Minuten Zeit gegeben, um sich an die Umgebung anzupassen, und dann wurden die Gehgeschwindigkeit der Gitternummer und die Aufzuchtfrequenz der einzelnen Mäuse fünf Mal hintereinander gemessen, um Mittelwerte zu erhalten.

Entnahme von Hirngewebe

Vor der Gewebeentnahme wurden die Mäuse ad libitum mit freiem Zugang zu Wasser gefüttert und erhielten 14 aufeinanderfolgende Tage lang eine medikamentöse Intervention. Vier Mäuse in jeder Gruppe wurden ausgewählt und schnell enthauptet. Die SN (Bregma: –2,75 mm –2,92 mm) von jedem Tier wurde isoliert und auf Eis gelegt. Gehirngewebe wurden mit 0,9-prozentiger eiskalter Natriumchloridlösung gespült, um jegliches Blut zu entfernen, und auf Filterpapier getrocknet, bevor sie bei –80 Grad gelagert wurden. Vier Mäuse aus jeder Gruppe wurden intraperitoneal anästhesiert und ihre Brust geöffnet. Eine Infusionsnadel wurde dann in die linke Herzkammer jedes Tieres eingeführt. Um Blut aus dem Kreislaufsystem zu entfernen, wurde das rechte Herzohr durchtrennt und dem Tier wurde 4 Grad normale Kochsalzlösung infundiert, bis die Leber blass wurde, um eine nachfolgende Durchblutung sicherzustellen. Sobald der Abfluss des rechten Atriums klar wurde, wurde jedes Tier mit 4 % Paraformaldehyd-Fixiermittel perfundiert. Nach der Perfusion wurde dann das Hirngewebe jedes Tieres sorgfältig präpariert und 24 h in 4-prozentigem Paraformaldehyd nachfixiert. Fixierte Gehirngewebe wurden dann unter fließendem Wasser gespült, in einer abgestuften Reihe von Ethanollösungen dehydriert und in Xylollösung geklärt. Es folgte eine Paraffinimmersion und Einbettung.

Änderungen der DA-Menge, gemessen durch HPLC

Das Nanopulver SN aus jeder Gruppe wurde in ein Eisbad gegeben, das 0,9 % Natriumchloridlösung (Verhältnis 1:9) enthielt. Das Gehirngewebe wurde unter Verwendung eines Ultraschall-Zellzerstörers homogenisiert und bei 1200 U/min für 20 min bei 4 Grad zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten. Für die HPLC wurde eine Hypersil AA-ODS-Säule (2,1 mm × 200 mm, 5 μm) bei 30 Grad Säulentemperatur verwendet. Fluoreszenzdetektion wurde bei 280 nm λex und 340 nm λem durchgeführt. Das Injektionsvolumen betrug 10 μl.

Expression von TH, GDNF, GFR 1 und Ret, nachgewiesen durch Immunhistochemie

Paraffinschnitte (5 μm dick) von individuellem Gehirngewebe wurden von jedem Tier isoliert und in ein 40 Grad warmes Wasserbad gegeben, um sie zu glätten und an Glasobjektträgern zu haften. Alle Gewebeschnitte wurden in einem 60-Grad-Ofen für 3–6 h inkubiert, gefolgt von Xylol-Entparaffinierung, Gradienten-Ethanol-Dehydratisierung und Antigen-Wiedergewinnung durch Inkubieren in einem Zitronensäurepuffer und Erhitzen in einer Mikrowelle für 20 Minuten. Die Gewebeschnitte wurden dann in einer 3-prozentigen H2O2-Lösung bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS wurden die Objektträger mit Normalserum in einer geschlossenen Kammer bei Raumtemperatur für 20 min inkubiert. Die immunhistochemische Färbung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Ein Motic Med 6.0 Bildanalysator wurde verwendet, um den Wert der integrierten optischen Dichte in den positiv gefärbten Zellen zu berechnen.

Western-Blot-Analyse im Gehirngewebe von Mäusen

Diese Studie bewertete die Proteinexpression von Tyrosinhydroxylase (TH), GDNF, GFR 1, Ret, Bcl2 und Bax. Das Gehirnlysat jeder Gruppe wurde für 3{{10}} Minuten auf Eis homogenisiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei niedriger Temperatur, 20,000 U/min, bei 4 Grad für 5 Minuten min, um den Überstand zu sammeln. Die Proteinproben wurden unter konstantem Druck unter Verwendung eines 10-prozentigen SDS-PAGE-Gels wie oben beschrieben getrennt. Die primäre Antikörperkonzentration: TH 0,15 mg/ml, GDNF 0,5 mg/ml, GFR 1 0,8 mg/ml, Ret 0,63 mg/ml, Bcl-2 0,34 mg/ml und Bax 0,11 mg/ml. Das Verfahren war das gleiche wie oben.

Statistische Analyse

Diese Studie verwendete die Statistiksoftware SPSS 20.0 für die Datenverarbeitung und -analyse. Parameterwerte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (x¯

±S). ANOVA wurde für die Einzelfaktor-Datenanalyse verwendet. LSD oder Games-Howell-Test wurde verwendet, um die Gruppen zu vergleichen. P < 0.05 (oder P < 0,01) wurde als statistisch signifikanter Unterschied betrachtet.

Ergebnisse

Die aktiven Komponenten vonZistanchetubulosa Nanopulver

Im Bereich von 200–400 nm Scannen, ECH inZistanchetubulosa und VER bei 330 nm hatten den maximalen Absorptionspeak, der innerhalb von 20 min auftrat. ICA hatte maximale Absorptionsspitzen bei 270 nm und erschien nach 20 min (Abbildung 1A). Die Ergebnisse zeigten, dass die negativen Proben den Nachweis nicht beeinträchtigten (Abbildung 1B). Die Proben und die Kontrolle hatten die gleichen chromatographischen Peaks und die negative Probe hatte keine. Dies zeigte, dass die anderen Inhaltsstoffe in der Probe die zu messende Komponente nicht störten. Darüber hinaus können die drei Komponenten und die angrenzenden Peaks die Trennungsgrundlinie erreichen und der Trennungsgrad war größer als 1,5.

Zistanchetubulosa Nanopulver Reduzierte MPP plus -induzierte Zytotoxizität in MES23.5-Zellen

Die Lebensfähigkeit von MES23.5-Zellen wurde mit steigenden Konzentrationen von MPP plus signifikant reduziert. 2F zeigt die signifikante Zytotoxizität verschiedener Konzentrationen von MPP plus .

Zistanchetubulosa-Nanopulver reduzierte die durch MPP plus induzierte Zytotoxizität und verbesserte die Lebensfähigkeit von MES23.5-Zellen. Abbildung 2G zeigt dasZistanchetubulosa-Nanopulver-Dosierungen von 10–250 ug/ml übten dosisabhängige Schutzwirkungen auf die mit MPP plus behandelten MES23.5-Zellen aus.

Zytomorphologische Wirkung vonZistanchetubulosa Nanopulver

Normale MES23.5-Zellen hatten eine gute Zelladhäsion und waren spindelförmig mit klaren Zellgrenzen und Synapsen. MPP plus -geschädigte MES23.5-Zellen zeigten eine schlechte Zelladhäsion und -schrumpfung, und viele waren in den Medien mit kontrahierten Synapsen suspendiert. Diese Zellen waren aggregiert, geschrumpft und rund mit Vakuolen im Inneren, und die Kerne waren zerfallen oder kollabiert.Zistanchetubulosa-Nanopulver in verschiedenen Dosierungen verbesserte die Zytomorphologie von MES23.5-Zellen in unterschiedlichem Maße, indem es die Zelladhäsion und synaptische Clearance der Vehikelgruppe verbesserte. MES23.5-Zellen in der HochdosisZistanchetubulosa-Behandlungsgruppe zeigte eine Morphologie, die der normalen Kontrollgruppe ähnlich war (Abbildungen 2A–E).

Wirkung vonZistanchetubulosa Nanopowder auf TH-Expression und Apoptose in den Zellen

Abbildung 3 zeigt eine signifikante Verringerung der TH-Proteinexpression in der Vehikelgruppe. Die TH-Proteinexpression stieg in Gruppen, die mit unterschiedlichen Dosierungen behandelt wurden, unterschiedlich anZistancheTubulus. Der LSD-Test zeigte jedoch, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen den drei behandelten Gruppen gab.

Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse der Apoptose-Beurteilung mittels Durchflusszytometrie. Die Apoptoserate war in der Vehikelgruppe signifikant höher als in den anderen Gruppen. Mit unterschiedlichen Dosierungen behandelte ZellenZistanchetubulosa-Nanopulver zeigte im Vergleich zur Vehikelgruppe eine unterschiedlich starke Abnahme der Apoptoserate. Zellen in der mittleren und hohen DosisZistanchetubulosa-Behandlungsgruppe hatte im Vergleich zur anderen die signifikanteste Verbesserung der ApoptoserateZistanchetubulosa Behandlungsgruppen. Der LSD-Test zeigte, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden behandelten Gruppen gab, aber einen signifikanten Unterschied zwischen der Gruppe mit niedriger Dosis zu ihnen.

Wirkung vonZistanchetubulosa-Nanopulver auf die Bcl2/Bax-Proteinexpression in den Zellen

Abbildung 5 zeigt, dass die Expression des Bcl2-Proteins in den Zellen der Vehikelgruppe im Vergleich zur normalen Kontrollgruppe signifikant geringer war. Im Gegensatz dazu war die Expression von Bax-Protein in Zellen der Vehikelgruppe signifikant höher als in der normalen Kontrollgruppe.Zistanchetubulosa-Behandlungsgruppen zeigten eine erhöhte Bcl2-Proteinexpression und eine verringerte Bax-Proteinexpression in MPP plus -behandelten MES23.5-Zellen. Zwischen den drei behandelten Gruppen gab es signifikante Unterschiede im LSD-Test. Diese Wirkungen waren dosisabhängig.

Verhaltenstests

Die Ergebnisse des Schwimmtests deuteten darauf hin, dass die Mäuse in der Vehikelgruppe relativ lange Standzeiten hatten, die mit der Zeit zunahmen. Am Tag 14 hatten die Mäuse in der Vehikelgruppe eine signifikant längere stationäre Dauer als die Mäuse in der normalen Kontrollgruppe. Die stationäre Dauer der Mäuse in der niedrigen DosisZistanchetubulosa-Behandlungsgruppe unterschied sich nicht signifikant von der der Mäuse in der Vehikelgruppe. Allerdings ist die stationäre Dauer der Mäuse in der HochdosisZistanchetubulosa-Behandlungsgruppe war signifikant geringer als die der Mäuse in der Vehikelgruppe.

Die Ergebnisse des Open-Field-Tests legen nahe, dass nach MPTP-induzierter Schädigung bei den Mäusen die Mäuse in der Vehikelgruppe eine signifikante Abnahme ihrer Fähigkeit zur spontanen Aktivität zeigten, wie durch die Aufzuchthäufigkeit gezeigt wird. Nach einer 14-tägigen Verabreichung vonZistanchetubulosa-Nanopulver zeigten die Mäuse in den Behandlungsgruppen mit mittlerer und hoher Dosis signifikant höhere Aufzuchtfrequenzen im Vergleich zu den Mäusen in der Vehikelgruppe (Abbildungen 6A, B).

Wirkung vonZistanchetubulosa Nanopulver auf DA-Gehalt in Mäusen

Änderungen im DA-Gehalt des SN wurden durch HPLC bestimmt. Es zeigte sich, dass der DA-Gehalt im Gehirn der Vehikelgruppe signifikant reduziert war. Der DA-Gehalt im Gehirn von PD-Mäusen in der niedrigen DosisZistanchetubulosa-Behandlungsgruppe unterschied sich nicht signifikant von den Mäusen in der Vehikelgruppe. Jedoch,Zistanchetubulosa-Behandlung erhöhte die DA-Spiegel im Gehirn von PD-Mäusen dosisabhängig. Die Gehirne von PD-Mäusen, die mit Hochdosis behandelt wurdenZistanchetubulosa hatte einen signifikant höheren DA-Gehalt als die Gehirne von Mäusen in der Vehikelgruppe (Abbildung 6C).

Wirkung vonZistanchetubulosa Nanopulver auf die TH-Expression in Mäusen

Die Anzahl der TH-positiven Zellen und das Ausmaß der TH-Proteinexpression im SN von MPTP-induzierten PD-Mäusen waren niedriger als bei Mäusen in der Kontrollgruppe. Nach demZistanchetubulosa-Behandlung stieg die Anzahl der TH-positiven Zellen und das Niveau der TH-Proteinexpression im SN von MPTP-induzierten PD-Mäusen mit einem signifikanten Unterschied zwischen der HochdosisZistanchetubulosa-Behandlungsgruppe und der Vehikelgruppe durch LSD-Test; und es gab signifikante Unterschiede zwischen den drei behandelten Gruppen (Abbildung 7).

Wirkung vonZistanchetubulosa Nanopulver zur Proteinexpression von GDNF und seinen Rezeptoren, GFR 1 und Ret in Mäusen

Die Proteinexpression von GDNF und seinen Rezeptoren, GFR 1 und Ret, in den positiv gefärbten Zellen wurde unter Verwendung von Immunhistochemie bewertet. Western-Blot-Analyse wurde verwendet, um die Proteinexpressionsniveaus im SN der verschiedenen Gruppen von Mäusen zu bewerten. Die Ergebnisse für die verschiedenen Gruppen waren bei Verwendung der beiden Nachweismethoden ähnlich. Die Expression von GDNF und seinen Rezeptorproteinen, GFR 1 und Ret, in positiv gefärbten Zellen im SN der Mäuse in der Vehikelgruppe war signifikant niedriger als bei den Mäusen in der normalen Kontrollgruppe. Unterschiedliche Dosierungen vonZistanchetubulosa-Behandlung erhöhte die Anzahl von GDNF-, GFR-1-- und Ret-positiven Zellen (Abbildungen 8A–S).

Die Proteinexpression von GDNF, GFR 1 und Ret im SN der Mäuse der Vehikelgruppe war signifikant niedriger als bei den Mäusen der Kontrollgruppe. Steigende Behandlungskonzentrationen vonZistanchetubulosa-Nanopulver verbesserte die Expression dieser Proteine ​​signifikant. Die Proteinexpression von GDNF, GFR 1 und Ret im SN der Mäuse in der HochdosisZistanchetubulosa-Behandlungsgruppe war signifikant höher als bei den Mäusen in der Vehikelgruppe (P < 0,01; Fig. 8T, U).

Wirkung vonZistanchetubulosa Nanopulver zur Proteinexpression von Bcl2/Bax in Mäusen

Die Bcl2-Proteinexpression war im SN von Mäusen in der Vehikelgruppe (P < 0.01) im Vergleich zu den Mäusen in der normalen Kontrollgruppe signifikant verringert und die Bax-Proteinexpression war signifikant erhöht. Hohe DosisZistanchetubulosa-Behandlung erhöhte die Bcl2-Proteinexpression signifikant und reduzierte die Bax-Proteinexpression in den Gehirnen der Vehikelmäuse signifikant (P < 0,01; Fig. 9). Der LSD-Test zeigte, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen mit mittlerer und hoher Dosis, aber einen signifikanten Unterschied zwischen der Gruppe mit niedriger Dosis gab.

Diskussion

PD und Apoptose

PD ist eine neurodegenerative Erkrankung. Laut Zhang et al. (2005) liegt die Prävalenz bei der chinesischen Bevölkerung über 55 bei 10,7 Prozent und bei den über 65-Jährigen bei 1,67 Prozent. Die Zahl der Parkinson-Patienten hat mit der Beschleunigung des globalen Alterns jährlich zugenommen, was die Familien der Patienten finanziell stark belastet und die Gesellschaft insgesamt.

Im Gehirn sind dopaminerge Neuronen hauptsächlich an der Synthese und Sekretion von DA beteiligt. Sie sind im Zentralnervensystem weit verbreitet und befinden sich hauptsächlich im SN (80 Prozent). TH ist das geschwindigkeitsbegrenzende Schlüsselenzym für die DA-Synthese.

Somit reduziert die Hemmung der TH-Aktivität die DA-Synthese (Huot und Parent, 2007). Die wichtigsten pathologischen und biochemischen Veränderungen der Parkinson-Krankheit sind die Apoptose von dopaminergen Neuronen im SN, eine signifikante Reduktion der nigrostriatalen DA und die Bildung von Lewy-Körperchen in dopaminergen Neuronen (Dexter und Jenner, 2013). Die Ätiologie von PD umfasst assoziierte genetische Faktoren, Umweltfaktoren und Alterung des Nervensystems (Allam et al., 2005). Die Pathogenese von PD bleibt in der modernen Medizin unklar. Seit den späten 1960er Jahren wird die Levodopa-Ersatztherapie erfolgreich zur Behandlung von PD eingesetzt und gilt als wichtiger Wendepunkt in der PD-Behandlung. Die langfristige Anwendung dieser Therapie verursacht jedoch Nebenwirkungen und die Therapie behandelt nicht die zugrunde liegenden Ursachen von PD (Del Sorbo und Albanese, 2008). Daher ist eine aktive Forschung nach neuen Medikamenten oder Behandlungsmethoden, die auf den Schutz dopaminerger Neuronen abzielen, für die Behandlung von PD von entscheidender Bedeutung.

In früheren Studien zeigte die Anwendung von terminaler Desoxynukleotidyltransferase-vermittelter dUTP-Nick-End-Markierung, dass 0,6 Prozent –4,8 Prozent der dopaminergen Neuronen im SN von PD-Patienten Apoptose zeigten (Mochizuki et al., 1996). Die Elektronenmikroskopie zeigte apoptotische Merkmale, einschließlich chromatischer Kondensation und apoptotischer Körper in dopaminergen Zellen (Anglade et al., 1997). Tompkinset al. (1997) führten eine ultrastrukturelle Analyse von Gehirngewebeautopsien von Patienten mit PD, AD und diffuser Lewy-Körper-Krankheit (DLBD) durch. Sie fanden apoptotische Körper in der dichten Schicht der SN bei PD- und DLBD-Patienten, was schlüssige Beweise für neuronale Apoptose bei PD und verwandten Krankheiten liefert. Daher ist die Reduktion oder Unterdrückung der Apoptose in dopaminergen Neuronen von grundlegender Bedeutung für die PD-Behandlung.

Frühere Studien zeigten, dass MPTP PD-ähnliche Symptome induzierte. MPTP passiert die Blut-Hirn-Schranke und wird durch Typ-B-Monoaminoxidasen in Astrozyten metabolisiert. Anschließend wird es in toxisches MPP plus umgewandelt, das sich durch die Proteinaufnahme des DA-Transporters in den Mitochondrien dopaminerger Neuronen anreichert. Es erzeugt somit überschüssige freie Sauerstoffradikale, die die Komplex-I-Aktivität der mitochondrialen Atmungskette und die ATP-Synthese hemmen. Diese Ereignisse fördern die Bildung freier Radikale und oxidative Stressreaktionen weiter und führen schließlich zur Degeneration und zum Tod von dopaminergen Neuronen.

Daher verwendete diese Studie MPP plus, um ein In-vitro-Vehikel in dopaminergen MES23.5-Neuronen und MPTP zu etablieren, um eine Vehikelmaus zur gegenseitigen Verifizierung zu induzieren. Gemäß den Ergebnissen des MTT-Assays verringerte MPP plus signifikant die Lebensfähigkeit von MES23.5-Zellen, was darauf hindeutet, dass MPP plus für dopaminerge Neuronen zytotoxisch war. Das zeigten auch die ErgebnisseZistanchetubulosa verstärkte wirksam die Expression von antiapoptotischen Proteinen und hemmte den Anstieg von MPP plus -induzierter Apoptose.

D und GDNF

GDNF ist ein neurotropher Faktor, der erstmals von Lin et al. (1993). Linet al. (1993) zeigten auch, dass GDNF spezifische Ernährungswirkungen auf dopaminerge Neuronen im Mittelhirn von Ratten hatte. GDNF, Neurturin (NTN), Wahrnehmung (PSP) und Artemin (ART) bilden die GDNF-Familie. Sie sind strukturell ähnliche und funktionell verwandte sekretorische Proteine ​​(Kotzbauer et al., 1996; Baloh et al., 1998; Milbrandt et al., 1998; Woodbury et al., 1998).

Der GDNF-Rezeptor besteht aus zwei Komponenten. Die erste Komponente, GFR, ist an der äußeren Membran von Glycosylphosphatidylinositol (GPI) fixiert und an der Oberfläche von Connexin verankert. Die zweite Komponente ist das Ret-Protein. Die Forschung hat gezeigt, dass es vier verschiedene Arten von GFR gibt: GFR 1, GFR 2, GFR 3 und GFR 4. GFR 1 ist ein hochaffiner Rezeptor von GDNF (Onochie et al., 2000; Chen et al., 2001; Lindahl et al., 2001). Das Ret-Protein ist ein funktioneller Rezeptor von GDNF. Das homodimere Molekül von GDNF bindet direkt an GFR 1, um Komplexe zu bilden, und interagiert mit Ret, was zur Dimerisierung und Aktivierung von Ret führt. Aufgrund der Autophosphorylierung von Ret aktiviert Ret mehrere gemeinsame TH-Signalwege. In Abwesenheit des Ret-Proteins verursacht GDNF die Proteinphosphorylierung von MAPK, PI-3 und PLC- zusätzlich zur mRNA-Expression und funktionellen Aktivität von C-fos durch sein Rezeptorprotein GFR 1 (He et al., 2008).

Studien haben gezeigt, dass GDNF die stärkste Schutzwirkung auf dopaminerge Neuronen hatte (Rangasamy et al., 2010; Campos et al., 2012). In Vehikeln, die MPTP und 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) verwenden, um Schäden in dopaminergen Neuronen zu induzieren, schützt GDNF dopaminerge Neuronen, indem es die Apoptose reduziert und das axonale Wachstum fördert, um die Stammzelldifferenzierung zu induzieren (Lucas et al., 2012; Littrell et al., 2013). Linet al. (1993) zeigten, dass GDNF spezifisch die Lebensfähigkeit, Differenzierung und das axonale Wachstum von dopaminergen Neuronen förderte, um die Aufnahme von DA in Neuronen zu fördern. Die Studie zeigte auch, dass GDNF nicht nur die akute Toxizität verhinderte, sondern auch die Langzeittoxizität von MPP plus oder 6-OHDA in dopaminergen Neuronen linderte und außerdem den Zelltod in gestressten oder geschädigten Zellen verhinderte (Yu et al., 2010). Darüber hinaus förderte GDNF die Proliferation und Differenzierung neuraler Stammzellen zu dopaminergen Neuronen im Mittelhirn (Lindsay, 1995), um dopaminerge Neuronen vor retrograder Degeneration zu retten (Hong-Juan et al., 2011).

Studien haben gezeigt, dass die GDNF-Expression im SN in Tiervehikeln signifikant reduziert war (Yang et al., 2010). Dies deutet darauf hin, dass dies einer der Mechanismen der Pathogenese bei PD-Ratten sein könnte. Die Injektion von 5–15 ug/d GDNF in den lateralen Ventrikel oder das Striatum eines MPTP-induzierten Vehikeltiers für drei aufeinanderfolgende Monate förderte die nigrostriatale Reparatur des dopaminergen Systems im Vehikeltier (Grondin et al., 2002). Studien zur GDNF-Behandlung von PD in Tiervehikeln haben gezeigt, dass die intrazerebrale Injektion von GDNF in verschiedene Gehirnregionen, wie den SN, den Nucleus caudatus und den lateralen Ventrikel, die mit PD-Tiermodellen verbundenen Bewegungsstörungen, einschließlich verringerter motorischer Aktivität, Muskelstarrheit und verbessert Zittern (Grondin et al., 2002).

Allerdings kann GDNF die Blut-Hirn-Schranke nicht direkt passieren. Daher bringt die lokale zerebrale Injektion von GDNF erhebliche Risiken und Schwierigkeiten bei der klinischen Anwendung mit sich. Anwendungen zur Einführung von exogenem GDNF über Mikrosphären mit kontrollierter Freisetzung, Kapseln mit verzögerter Freisetzung und virale Gene werden noch untersucht (Liang et al., 2010; Yang et al., 2010; Qiao et al., 2012). Angesichts der Einschränkungen verschiedener Techniken zur Einführung von exogenem GDNF in das Gehirn sind neuroprotektive Mittel, die die Freisetzung von endogenem GDNF fördern, für die klinische Anwendung von Bedeutung.

PD undZistanchetubulosa Nanopulver

PD ist häufiger bei Erwachsenen mittleren Alters und älteren Menschen. Die Theorie der TCM geht davon aus, dass PD hauptsächlich im Gehirn lokalisiert ist und neben der Vitalenergie- und Blutinsuffizienz hauptsächlich auf Leber- und Nierenmangel zurückzuführen ist. Nach dieser Theorie sollte sich die Parkinson-Behandlung daher auf die Stärkung der Niere und des Knochenmarks konzentrieren. Yanget al. (2010) verwendeten randomisierte, doppelblinde und placebokontrollierte klinische Studien und stellten fest, dass eine Kombinationstherapie mit Madopar und nierentonisierenden Rezepten die motorischen Dysfunktionen von Parkinson-Patienten linderte. Das Behandlungsergebnis war besser als bei einer Einzeltherapie mit Madopar. Die Behandlungswirksamkeit der TCM-Monotherapie oder der Verschreibung von Präparaten bei PD wurde in PD-Tiermodellen und klinischen Anwendungen bestätigt. TCM-Anwendungen zur Tonisierung der Nieren und zur Förderung der Durchblutung reduzierten die Dosis der Monotherapie bei Parkinson mit Madopar. Einige Studien deuten darauf hin, dass TCM die Symptome von Parkinson verbessert und dopaminerge Neuronen schützt, was eng mit der Förderung der endogenen GDNF-Expression zusammenhängen könnte (Hong-Juan et al., 2011; Qiao et al., 2012).

Die in dieser Studie verwendete nierentonisierende VerbindungZistanchetubulosa-Nanopulver, enthalten Cistanche, Epimedium und Rhizoma polygonal. Moderne Forschung legt nahe, dass die chemische Zusammensetzung von Cistanche ECH ist, das dopaminerge Neuronen im SN in den MPTP-induzierten PD-Mäusen schützt und die Reduktion von DA und dem DA-Transporter hemmt (Zhao et al., 2010). Darüber hinaus verhindert es die 6-OHDA-induzierte Reduktion von DA und schützt striatale dopaminerge Neuronen (Chen et al., 2007). Epimedium hemmt die Aktivierung von Caspase-3 und übt eine neuroprotektive Rolle aus (Liu et al., 2011). Epimedium-Flavonoide fördern effektiv die Proliferation und Differenzierung neuraler Stammzellen (Yao et al., 2010).

In dieser Studie,Zistanchetubulosa Nanopulver antagonisierte dosisabhängig den Anstieg der MPP plus -induzierten Apoptose. Es verbesserte die TH-Expression im In-vitro-Vehikel signifikant und hatte signifikante antiapoptotische Wirkungen in dopaminergen Neuronen. Die MPTP-induzierten Vehikelmäuse zeigten Verhaltensstörungen und eine signifikant reduzierte TH-Expression im Mittelhirngewebe und DA-Spiegel, die typische pathologische Merkmale von PD sind. Unterschiedliche Dosierungen vonZistanchetubulosa-Nanopulver verkürzte die stationäre Dauer, verbesserte autonome Aktivitäten, verbesserte Verhaltensstörungen, erhöhte DA-Spiegel im Gehirn und erhöhte TH-Expression in Fahrzeugen. Darauf deuteten diese Ergebnisse hinZistanchetubulosa-Nanopulver übte eine schützende Wirkung auf dopaminerge Neuronen aus und verbesserte dadurch die Verhaltensstörungen von Vehikeln. Unterschiedliche Dosierungen vonZistanchetubulosa-Nanopulver erhöhte die Expression des GDNF-Proteins und seiner Rezeptorproteine ​​im Gehirn von Trägermäusen. Die hochdosierte Cistanche tubulosa-Behandlung regulierte die Bcl2-Expression signifikant hoch und reduzierte die Bax-Expression, was darauf hindeutet, dass Cistanche tubulosa-Nanopulver die GDNF-Expression und -Sekretion im MPTP-geschädigten Mausgehirn fördern könnte. Darüber hinaus könnte es neuroprotektive Wirkungen in dopaminergen Neuronen ausüben und die neuronale Apoptose durch die neurotrophen Unterstützungsrollen von GDNF minimieren.

Das hat diese Studie gezeigtZistanchetubulosa-Nanopulver übte sowohl in vitro als auch in vivo Schutzwirkungen auf dopaminerge Neuronen aus und erhöhte die TH-Expression, um den DA-Gehalt zu verbessern. Es verbesserte auch Verhaltensstörungen bei MPTP-induzierten Vehikelmäusen, regulierte die Proteinexpression von GDNF und seinen Rezeptorproteinen im SN und hatte antiapoptotische Wirkungen bei den PD-Mäusen. Der Mechanismus, der den klinischen Wirkungen von zugrunde liegtZistanchetubulosa-Nanopulver bei Parkinson könnte eine Erhöhung des Gehalts an endogenem GDNF im Gehirn beinhalten und dadurch die Schädigung dopaminerger Neuronen verringern.

Autorenbeiträge

QX und WF sind die Co-Erstautoren der Arbeit, S-FY, Y-BC, WQ und S-YC waren an der experimentellen Arbeit beteiligt, und JC hat die Arbeit entworfen und geleitet.

Erklärung zu Interessenkonflikten

Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

Die Arbeit wurde von der Natural Science Foundation of Fujian Province Grants (Projekt 2015J01686), dem Scientific Research Fund der National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China (Projekt WKJ-FJ-38), Chen Keji unterstützt Fonds für die Entwicklung der integrativen Medizin (Projekt CKJ2014012) und das Schlüsselfach der Fujian-Universität für traditionelle chinesische Medizin (Projekt X2014010-Fach).

For more information:1950477648nn@gmail.com