Cistanche Tubulosa schützt dopaminerge Neuronen durch Regulierung der Apoptose und des von Gliazellen abgeleiteten neurotrophen Faktors: in vivo und in vitro-Ⅰ

EINFÜHRUNG

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine häufige neurodegenerative Erkrankung, die bei älteren Menschen auftritt und als pathologische Manifestation einen degenerationsbedingten Verlust dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra (SN) zur Folge hat. Die Schwere der Erkrankung korreliert mit dem neuronalen Zellverlust von Dopamin (DA) im SN, was mit der Ansicht übereinstimmt, dass die Erkrankung neurodegenerativer Natur istDer Prozess schreitet über viele Jahre voran, bevor Symptome auftreten (Sawle und Myers, 1993). Der fortschreitende Charakter der Krankheit bietet interessante Möglichkeiten für eine therapeutische Intervention durch Blockierung des zugrunde liegenden neurodegenerativen Prozesses. Die Suche nach therapieinduzierten wirksamen und spezifischen Wirkungen neurotropher Faktoren auf das Überleben von DA-Neuronen ist daher von erheblichem Interesse.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUM SCHUTZ DOPAMINERGER NEURONEN PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Neurotrophe Faktoren sind essentielle Proteine, darunter der Nervenwachstumsfaktor (NGF), der aus dem Gehirn stammende neurotrophe Faktor (BDNF) und der aus Gliazellen stammende neurotrophe Faktor (GDNF), die das Nervenwachstum, die neurologische Entwicklung, die axonale Führung und die neuronale Funktion fördern. Unter allen neurotrophen Faktoren, die dopaminerge Neuronen schützen und deren Reparatur fördern, hat GDNF die stärkste Wirkung (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). Es wurde gezeigt, dass GDNF in vitro starke neurotrophe Wirkungen auf DA-Neuronen besitzt (Lin et al., 1993) und in vivo neuroprotektive Wirkungen ausübt. Es wurde gezeigt, dass GDNF nigrale DA-Neuronen nach einer chirurgischen oder toxininduzierten Axotomie bei Ratten vor dem durch Läsionen verursachten Zelltod rettet (Beck et al., 1995; Kearns und Gash, 1995; Sauer et al., 1995) und teilweise auch danach systemische Verabreichung vonN-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP)bei Mäusen (Tomac et al., 1995). Die erhöhte Inzidenz neuronaler Apoptose und verringerte Schutzwirkungen neurotropher Faktoren, die möglicherweise durch verschiedene pathologische Faktoren ausgelöst werden, liegen der Degeneration dopaminerger Neuronen zugrunde (Holden et al., 2006).

C. tubulosa ist ein pflanzliches Arzneimittel, das aus mehreren Pflanzen der Gattung Cistanche stammt. Es handelt sich um eine wichtige Therapieoption beim Nierenmangelsyndrom, das in der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) eng mit Androgenhormonen zusammenhängt. Bisher haben viele klinische und Grundlagenforschungen zu C. tubulosa die Aktivitäten neurodegenerativer Erkrankungen gezeigt. Die Identifizierung von nierentonisierenden TCM-Verschreibungen in der Parkinson-Behandlung könnte somit eine alternative klinische Behandlung für Parkinson darstellen.Echinacosid (ECH)ist ein wichtiger bioaktiver Bestandteil des Heilkrauts C. tubulosa. Studien haben die therapeutische Wirkung der Glykoside von Cistanche und ECH gezeigt,Verbascosid(VER) und Icariin (ICA) bei Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD), PD und anderen Patienten mit vaskulärer Demenz (Urano und Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Wu et al. (2014) schlugen vor, dass C. tubulosa-Extrakte, die ausreichend ECH und Acteosid enthielten, die durch A -42 verursachte kognitive Dysfunktion verbesserten, indem sie die Amyloidablagerung blockierten und die cholinerge und hippocampale dopaminerge neuronale Funktion umkehrten. Tao et al. (2015) hat das herausgefundenPhenylethanoidglykosideaus C. tubulosa (Ph Gs-Ct) verhinderte Hirnödeme in großer Höhe, indem es die Protein- und mRNA-Expression von AQP4 im Gehirngewebe von Rattenmodellen verringerte.

NATÜRLICHER CISTANCHE TUBULOSA EXTRAKT SNACKS VERBESSERN DAS GEDÄCHTNIS PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Frühere Studien haben gezeigt, dass chinesische Kräuterverbindungen, darunter die drei Inhaltsstoffe C. tubulosa, Epimedium und Rhizoma polygonati, Schäden an dopaminergen Neuronen linderten und den Dopaminspiegel erhöhten, indem sie die Expression neurotropher Faktoren regulierten (Wu et al., 2013). Daher ist noch nicht bekannt, ob die durch C. tubulosa induzierten neuroprotektiven Wirkungen von langer Dauer sind und inwieweit die Rettung nigraler DA-Neuronen durch die Verabreichung von GDNF eine signifikante Erhaltung motorischer Verhaltensweisen ermöglichen kann, die für die Symptomatologie von PD-Tieren relevant sind. In dieser Studie wurde ein TCM-Nierentonisierungsrezept, C. tubulosa-Nanopulver, verwendet, das in China ein nationales Patent (Patentnummer: 2011103028541) erhalten hat und zuvor eine gewisse therapeutische Wirkung bei Parkinson gezeigt hat. Die vorliegende Studie sollte daher die neuroprotektiven und regenerativen Wirkungen der Behandlung mit C. tubulosa untersuchen und die Apoptose auf die MES23.5-Zellen und verhaltensspezifischen Ratten sowie die Regulierung von GDNF, gemessen durch eine Reihe von Zieltests, untersuchen .

MATERIALEN UND METHODEN

Materialien, Reagenzien und Ausrüstung

C. tubulosa wurde von der Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Peking, China, gekauft. ECH, VER und ICA kamen von den National Institutes for Food and Drug Control, China. Die dopaminerge neuronale Zelllinie MES23.5 war ein Geschenk von Professor Biao Chen, Labor für Neurobiologie, Capital Medical University, Peking, China. Fünfzig männliche C57BL/6-Mäuse (mit einem Gewicht von jeweils 20–25 g) wurden von Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Lizenznummer: SCXK2012-0002), Shanghai, China, gekauft.

MPP+, MTT und Glutamin wurden von Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA) bezogen; DMEM/F12-Medium und fötales Rinderserum wurden von Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) bezogen; und MPTP, DA-Standard und Homovanillinsäure (HVA)-Standard wurden von Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA) bezogen. -Aktin-, Bax-, Bcl2-, GDNF-, GDNF-Familienrezeptor-Alpha (GFR 1)- und Ret-Antikörper wurden von Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA) erworben; Das 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Färbereagenzkit wurde von Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, China) erworben; Das SDS-PAGE-Gelprobenvorbereitungskit, das ultraempfindliche ECL-Nachweiskit (Enhanced Chemilumineszenz) und der Bicinchoninsäure-Assay (BCA) wurden vom Beyotime Institute of Biotechnology (Peking, China) erworben.

In dieser Studie wurden die folgenden Instrumente verwendet: ELX800-Mikroplattenlesegerät (Bio Tek Winooski, VT, USA); CO2-Inkubator (Heraeus, Hanau, Deutschland); Gel DOC 2000 Gel-Bildanalysesystem, Elektrophoresezelle und Elektrophoresetank (Bio-Rad, Hercules, CA, USA); DU-650-Proteinanalysator (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA); 5417R Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland); SXQM-Doppelplanetenkugelmühle (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, China); MM400 Schwingmühle (Retsch GmbH, Haan, Deutschland); Agilent 1200 Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); PowerPac Basic-Elektrophorese, PowerPac Basic-Transmembrantransfersystem, Universal Hood II-Chemilumineszenz-Imager, S1000 Thermal Cycler RNA-Reverse-Transkriptionssystem (Bio-Rad); Motic Med 6.0 Gewebe- und Zellbildanalysesystem (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, China).

Vorbereitung vonC. tubulosaNanopulver

C. tubulosa wurde gewogen, dann gereinigt und dehydriert. Nach herkömmlicher Pulverisierung wurde das feine Pulver von C. tubulosa durch ein 200--Maschensieb gegeben und gefriergetrocknet. Zur Herstellung des C. tubulosa-Nanopulvers wurden eine temperaturgesteuerte Vakuum- und Hochenergie-Kugelmühle verwendet. Zunächst wurde rohes C. tubulosa-Nanopulver in einen Vakuum-Kugelmühlentank gegeben, der mit Carbid-Mahlkugeln beladen war. Das Verhältnis zwischen den Mahlkugeln und dem C. tubulosa-Nanopulver lag zwischen 15:1 und 5:1. Um ein feines Pulver zu erhalten, wurden die Geschwindigkeit und die Dauer der Hochenergie-Kugelmühle auf 300 U/min bzw. 20 Minuten eingestellt. Für die Verarbeitung nanoskaliger Materialien wurde das feine Pulver abgewogen und in der Schwingmühle mit einer Frequenz von 25/s und Oszillation von 20s für drei Wiederholungen verarbeitet. Zum Auflösen und Herstellen einer 25-mg/ml-Stammlösung wurde PBS verwendet, gefolgt von 30-minütiger Ultraschallbehandlung, Autoklavierung und schließlich Lagerung bei –20◦C.

Qualitätskontrolle der aktiven Komponenten vonC. tubulosadurch HPLC

ECH und VER enthielten eine Gradientenelution mit Octadecylsilan-gebundenem Silica als Füllstoff, Methanol als mobile Phase A und 0,1 % Ameisensäurelösung als mobile Phase B. Die Detektionswellenlänge betrug 330 nm. Der ICA enthielt eine Gradientenelution mit Octadecylsilan-gebundenem Silica als Füllstoff und Acetonitril-Wasser (30:70) als mobile Phase. Die Detektionswellenlänge betrug 270 nm. Für den Test wurden jeweils 10 µL Probe, Kontrolle und Negativkontrolle abgemessen.

Zellkultur und MTT-Assay zur Messung der Lebensfähigkeit von MPP+-Behandelte Zellen

MES23.5-Zellen wurden mit 5 % fötalem Kälberserum, 1 % Glutamin, 2 % 50× Sato-Lösung und DMEM/F12-Medium mit 2 % Penicillin/Streptomycin beimpft. Sie wurden bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 und gesättigter Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die Zellen wurden isoliert und mit 0,25 % Trypsin passagiert und die Zellsuspension in der logarithmischen Wachstumsphase geerntet. Isolierte Zellen mit einer Dichte von 1 × 105 wurden in mit Polylysin beschichtete 96-Well-Platten ausgesät, gefolgt von der Zugabe unterschiedlicher Endkonzentrationen (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 und 800 µmol/L). ) von MPP+-Medien. Als Negativkontrollen in den In-vitro-Experimenten dienten MES23.5-Zellen, die 24 und 48 Stunden mit normalem Kulturmedium inkubiert wurden. Die Zellen aus den verschiedenen Behandlungsgruppen wurden 4 Stunden lang mit MTT-Reagenz inkubiert. Anschließend wurde die Lösung in den Vertiefungen verworfen und 150 µL DMSO hinzugefügt und 10 Minuten lang oszilliert. Die Absorption jeder Probe bei einer Wellenlänge von 570 nm wurde mit einem automatischen Mikroplattenlesegerät gemessen. Der Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit (%)=mittlere Absorption der Versuchsgruppe/mittlere Absorption der negativen Kontrollgruppe × 100 %.

Relevante Konzentrationen von MPP+-Medium wurden für die 24-stündige Behandlung in MES23.5-Zellen unter Verwendung des gleichen Ansatzes wie für die In-vitro-Kultur hinzugefügt. Nach der Behandlung wurde die Lösung in der Vertiefung verworfen. Medien mit unterschiedlichen Konzentrationen (10, 50, 100, 200, 250, 500 und 1000 µg/ml) C. tubulosa-Nanopulver wurden den MES23.5-Zellen in verschiedenen Vertiefungen zugesetzt und 24 und 48 Stunden lang inkubiert. Als Negativkontrollen dienten die MES23.5-Zellen, die 24 und 48 Stunden mit normalem Kulturmedium inkubiert wurden. Als Vehikel dienten die mit MPP+-Medium inkubierten MES23.5-Zellen. Die Messungen wurden für jede Probe dreifach durchgeführt. Zur Berechnung der Zelllebensfähigkeit wurde die Absorption der entsprechenden Behandlungs- und Kontrollgruppen gemessen.

NATÜRLICHER CISTANCHE TUBULOSA-EXTRAKT ANTI-MÜDIGKEIT PHGS75 % ECH 30 % WIRKUNG 12 %

TH-Expression gemessen durch Immunzytochemie

Wenn C. tubulosa-Nanopulver in 100, 200 und 250 µg/ml vorlag, erhöhte sich die Zellüberlebensrate deutlich (Abbildung 2G). Daher haben wir in nachfolgenden Experimenten die drei Konzentrationen getestet: Gruppen mit niedriger, mittlerer und hoher Dosis. Für jede der C. tubulosa-Gruppen wurden drei Replikationen getestet. Sterilisierte, mit Polylysin beschichtete Deckgläser wurden in 6-Well-Platten gelegt. Als nächstes wurden 5 × 104 Zellen in jede Vertiefung ausgesät und 24 Stunden lang inkubiert. In der normalen Kontrollgruppe wurde herkömmliches frisches Medium ersetzt und in den verbleibenden Behandlungsgruppen wurde eine Endkonzentration von 100 µmol/L MPP+-Medium zur Inkubation für 24 Stunden eingesetzt. Herkömmliche frische Medien wurden dann in den normalen Kontroll- und Vehikelgruppen ersetzt und Endkonzentrationen von 100, 200 und 250 µg/ml C. tubulosa-Nanopulver wurden mit den Zellen 24 Stunden lang in der niedrigen, mittleren und hohen Dosis inkubiert C. tubulosa-Behandlungsgruppen. Die MES23.5-Zellen in den verschiedenen Gruppen wurden dreimal in PBS gewaschen, um den Überstand zu entfernen, und dann 15 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit einem Peroxidaseblocker 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und dann erneut mit PBS gewaschen. Eine 0,2 %ige Triton X-100-Lösung wurde 10 Minuten lang zur Zellpermeabilisierung verwendet, gefolgt von einem Waschen mit PBS. Jeder Probe wurde normales Ziegenserum zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde das normale Ziegenserum entfernt und der 1:400 in PBS verdünnte Primärantikörper zu jeder Probe gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Zellen in der negativen Kontrollgruppe wurden über Nacht bei 4 °C mit PBS inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit Biotin-markierten Sekundärantikörpern 20 Minuten lang bei 37 °C in der Feuchtigkeitskammer inkubiert. Jede Probe wurde dann in PBS gewaschen und mit Meerrettichperoxidase-Streptavidin-Konjugaten (Arbeitslösung C) bei 37 °C für 20 Minuten markiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen etwa 1–10 Minuten lang im Dunkeln mit DAB-Reagenz angefärbt und die Entwicklung einer braunen Farbe wurde unter dem Lichtmikroskop überwacht. Jede Probe wurde dann zweimal 1–2 Minuten lang in destilliertem Wasser gewaschen und die Kerne wurden 0,5–1 Minuten lang mit Hämatoxylinlösung gegengefärbt. Nach gründlichem Spülen jeder Probe in Wasser wurden die Zellen zur Differenzierung in 1 %igen Salzsäurealkohol und 1 %iges wässriges Ammoniak getaucht und anschließend gründlich in Wasser gewaschen. Die Zellen jeder Probe wurden dann 2 Minuten lang in 70 % Ethanol, 2 Minuten lang in 80 % Ethanol, zweimal 2 Minuten lang 90 % Ethanol, zweimal 2 Minuten lang 95 % Ethanol und zweimal 2 Minuten lang 100 % Ethanol dehydriert. Anschließend wurden die Zellen zweimal für 2 Minuten in Xylollösung getaucht und mit neutralen Harzen auf einem Objektträger befestigt. Unter dem Lichtmikroskop wurde jede Probe einer Bildaufnahme und einer zufälligen Auswahl von 5–10 effektiven Gesichtsfeldern unterzogen, um die Expression ausgewählter Proteine ​​in dopaminergen Neuronen zu bestimmen, angezeigt durch die Intensität der braunen Partikel, und um den Proteingehalt anhand seines durchschnittlichen Grauwerts halbquantifiziert .

Apoptoserate von MES23.5-Zellen, gemessen durch Durchflusszytometrie

Anhaftende Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen. Zur Zellisolierung wurde bei Raumtemperatur eine entsprechende Menge EDTA-freie Trypsinlösung zugegeben und die Lösung vorsichtig pipettiert, um die Ablösung anhaftender Zellen zu ermöglichen. Anschließend wurde ein Zellkulturmedium hinzugefügt, um die Trypsinisierung zu stoppen. Die Mischung wurde in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt und dann 5 Minuten lang bei 1500 U/min zentrifugiert, um die isolierten Zellen zu sammeln. Nach dem Verwerfen des Überstands wurde das Zellpellet vorsichtig mit PBS resuspendiert und die Zellen gezählt. Ungefähr 1 × 105 bis 5 × 105 resuspendierte Zellen wurden 5 Minuten lang bei 1500 U/min zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Dem Zellpellet wurden fünf Mikroliter Annexin V-FITC-Bindungslösung zugesetzt, um die Zellen vorsichtig zu resuspendieren. Weitere 5 µL Annexin V-FITC wurden hinzugefügt und gründlich gemischt. Fünf Mikroliter Propidiumiodidlösung wurden zur Zellfärbung verwendet, indem sie kurz vor der Durchflusszytometrie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden.

Western-Blot-Analyse fürin vitro

Die Zellen wurden in eine normale Gruppe, eine MPP+-Behandlungsgruppe und eine niedrige Dosis eingeteiltC. tubulosaBehandlungsgruppe, Behandlungsgruppe mit mäßiger C. tubulosa-Behandlung und Behandlungsgruppe mit hoher C. tubulosa-Dosis. Die Expression von Bcl2 und Bax wurde jeweils gemessen. Vor der Zellernte wurden in jeder Gruppe insgesamt 1 × 105 Zellen pro Well in der 6-Well-Platte zur Modellierung und Behandlung verwendet. Ein gemischtes Lysat, das RIPA-Puffer, Proteaseinhibitor und Phosphataseinhibitor enthielt, wurde hinzugefügt, um die Zellen 3 {19}} Minuten lang auf Eis zu lysieren. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand zur Proteinanalyse verwendet. Das Gesamtprotein wurde mithilfe eines BCA-Assays quantifiziert und durch 10 % SDS-PAGE aufgetrennt. Die getrennten Proteine ​​wurden auf eine Membran übertragen und mit einem 5 %igen Magermilch-Blockierungspuffer 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membran wurde dann über Nacht bei 4 °C in primärem Antikörper (Bcl-2 0,34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, 1:200-Verdünnung) inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde die Membran 1 Stunde lang in einem sekundären Antikörper (0,5 mg/ml, 1:5000-Verdünnung) bei 4 °C und dann 2 Minuten lang in ECL-Entwickler für die konventionelle Entwicklung inkubiert. Für die semiquantitative Analyse der Proteinexpression wurde die Software Quantity One verwendet.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA GEGEN MÜDIGKEIT, SCHÜTZEN DIE LEBER PHGS75 % ECH 30 % WIRKUNG 12 %

Experimentelle Tiermodellierung und Arzneimittelverabreichung

Fünfzig spezifisch pathogenfreie 8- Wochen alte männliche Mäuse wurden zufällig in fünf Gruppen eingeteilt: eine normale Gruppe, eine MPTP-Behandlungsgruppe (Vehikel), eine niedrig dosierte C. tubulosa-Behandlungsgruppe und eine mäßig dosierte C. tubulosa-Behandlungsgruppe Gruppe und Hochdosis-C. tubulosa-Behandlungsgruppe. Die Tiere wurden bei 20–22 °C gehalten und hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Den Mäusen in der normalen Gruppe wurde sieben aufeinanderfolgende Tage lang ein gleiches Volumen normaler Kochsalzlösung intraperitoneal injiziert. Den Mäusen in den anderen Behandlungsgruppen wurde MPTP (30 mg/kg/Tag) an sieben aufeinanderfolgenden Tagen intraperitoneal injiziert, um Vehikel zu etablieren.

Während der PD-Modellierung wurden den Mäusen in den Behandlungsgruppen mit niedriger, mittlerer und hoher Dosis C. tubulosa intragastrisch äquivalente klinische Volumina von 4 g/kg/Tag, 8 g/kg/Tag und 16 g/Tag verabreicht. kg/TagC. tubulosa-Nanopulverjeweils an 14 aufeinanderfolgenden Tagen. Den Mäusen in der Kontroll- und Vehikelgruppe wurden 14 aufeinanderfolgende Tage lang äquivalente Volumina normaler Kochsalzlösung intragastrisch verabreicht. Alle experimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission der Fujian University of TCM genehmigt und gemäß den international anerkannten Grundsätzen für die Verwendung und Pflege von Labortieren durchgeführt. In dieser Studie wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren.