Cistanosid von Cistanche Herba lindert durch Hypoxie verursachte männliche Fortpflanzungsschäden durch Unterdrückung von oxidativem Stress-Ⅰ

Einführung

Derzeit sind weltweit etwa 48,5 Millionen (15 %) Paare im gebärfähigen Alter von Unfruchtbarkeit betroffen, wobei 40-50 % der Fälle auf männliche Unfruchtbarkeit zurückzuführen sind, eine Erkrankung, die stark mit Umwelt- und Lebensstilfaktoren zusammenhängt. Es gibt Hinweise darauf, dass die Anfälligkeit des Hodens von Säugetieren gegenüber niedrigem Sauerstoffdruck ein ursächlicher Faktor für einige Formen männlicher Unfruchtbarkeit ist. Wie in früheren Studien gezeigt wurde, wird die Spermatogenese durch die Exposition gegenüber hypobarer Hypoxie beeinträchtigt und reduziert.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR VERBESSERUNG DER SEXUELLEN FUNKTION PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Um den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen, haben Studien gezeigt, dass die Exposition gegenüber hypobarer Hypoxie die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) erhöht. ROS spielen eine wichtige Rolle im männlichen Fortpflanzungssystem. In geringen Mengen werden sie für die Spermienkapazität, die Akrosomreaktion und die Spermien-Oozyten-Fusion benötigt [10]. Übermäßige ROS können jedoch eine Schädigung der nuklearen/mitochondrialen DNA der Spermien und eine peroxidative Schädigung der Plasmamembran hervorrufen, die wiederum wichtige ätiologische Faktoren dafür sinderhöhtes Risiko für männliche Unfruchtbarkeit. Daher könnte die Anhäufung von durch Hypoxie verursachten ROS eine Ursache für männliche Unfruchtbarkeit sein.

Cistanches Kräuter, eine mehrjährige parasitäre Heilpflanze, ist in Trockengebieten weit verbreitet und wird aufgrund ihrer pharmakologischen Wirkung häufig verwendet. Unter all den wirksamen Inhalten vonCistanches Kräuter, PhGs wurden als die wichtigste aktive Komponente angesehen. Bisher wurden 34 PhGs isoliertCistanches-Pflanzen. Cistanosid(Cis), ein aktives PhG, isoliert ausCistanches Kräuter, hat aufgrund seiner antioxidativen Wirkung Aufmerksamkeit erregt.

Angesichts der antioxidativen Wirkung von Cis und der Rolle von ROS bei der durch Hypoxie verursachten männlichen Unfruchtbarkeit gilt Cis als potenzieller Arzneimittelkandidat für die Behandlung von CisHypoxie-induzierte männliche Unfruchtbarkeit. Es gibt jedoch nur wenige Berichte, die sich mit der antioxidativen Wirkung von aus Cistanches Herba extrahiertem Cis bei der Behandlung von durch Hypoxie verursachter männlicher Unfruchtbarkeit oder den beteiligten Signalwegen befassen. In dieser Studie wurden In-vitro- und In-vivo-Hypoxie-Versuchsmodelle konstruiert und die Wirkungskomponenten verschiedener Cis bewertet.

Materialen und Methoden

Zellkultur und Reagenz

Die Maus-Spermatogonie-Zelllinie GC-1spg (GC-1) wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) erworben und in DMEM (Invitrogen, USA) kultiviert, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % L-Glutamin (100 mM), Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 ug/ml) bei 37 Grad in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) wurde von Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (China) gekauft.

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Zelllebensfähigkeitstest

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem Cell Counting Kit{{0}} Assay (CCK-8) getestet. Kurz gesagt, GC-1-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit 1,5×103 pro Well ausgesät und 24 Stunden lang bei 37 Grad kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen (20 %, 15 %, 10 %, 5 %) Sauerstoff oder unterschiedlichen Konzentrationen (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-) behandelt. C, Cis-H) für die erforderliche Zeit. Anschließend wurde der Überstand verworfen und die Lebensfähigkeit der Zellen mithilfe eines CCK-8-Kits (Dojindo Japan) nachgewiesen. Die Absorption jeder Vertiefung wurde bei 450 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (BioRad USA) gemessen. Abschließend wurden die Zelllebensfähigkeiten nach der folgenden Formel berechnet: Zelllebensfähigkeit=(ODexperimental-Gruppe – ODblank-Gruppe)/ (ODKontrollgruppe – ODblank-Gruppe) × 100 %.

Western-Blot-Analyse

Geerntete Zellen oder Gewebe wurden in RIPA-Puffer homogenisiert, um Proteine ​​zu extrahieren (RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Schweiz). Überstände wurden gesammelt und die Proteinkonzentration mit der BCA-Methode (Beyotime) getestet. Ungefähr 40 µg der extrahierten Proteine ​​aus jeder Probe wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulose (NC)-Filtermembran (Beyotime China) elektrotransferiert. NC-Filtermembranen wurden 1,5 Stunden lang mit 5 % fettfreier Milch blockiert und mit spezifischen Antikörpern (Anti-PARP 1:1000, AntiCaspase-3 1:1000, Anti-Bcl-2 1:1000, Anti-Bax 1 inkubiert :1000, Anti-GAPDH 1:1000; alle Antikörper wurden von Cell Signaling Technology, USA, über Nacht bei 4 Grad gekauft. Anschließend wurden alle NC-Membranen mit dem entsprechenden Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörper 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und mit einem Bildgebungssystem (Tannon, China) abgebildet.

Erkennung des Zellzyklus

Zur Analyse des Zellzyklus wurde ein durchflusszytometrischer Assay (FCM) durchgeführt. Die Zellen wurden 72 Stunden lang unter verschiedenen Bedingungen behandelt und geerntet. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen, in 75 % Ethanol fixiert und mit Propidiumiodid (PI) gefärbt. Für jede Probe wurden 1 × 104 Zellen gesammelt und mittels Durchflusszytometrie (FACS Calibur, BD Biosciences) analysiert. Anschließend wurden der Anteil der G1/S/G2-Phasenzellen und der Proliferationsindex [Phase(S+G2)/Phase(G1+S+G2) × 100 %] berechnet.

Ki-67-Färbung

Die Zellen wurden in einer konfokalen Schale kultiviert und 72 Stunden lang mit Hypoxie oder verschiedenen Cis-Subtypen behandelt. Nachdem alle Zellen mit 4 % Paraformaldehyd fixiert worden waren, wurden sie mit einem Anti-Ki-67-Antikörper (1:200, Cell Signaling Technology) inkubiert. Anschließend wurden alle Zellen mit einem entsprechenden CY-3--konjugierten Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (1:200, Boster, China) und DAPI-Lösung (1,0 ug/ml, Beyotime) inkubiert. Die Fluoreszenz wurde mit einem konfokalen Fluoview FV1000-Mikroskop (Olympus, Japan) beobachtet.

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Erkennung von ROS

FCM wurde eingeführt, um intrazelluläre ROS-Spiegel mithilfe von DCFH-DA zu messen. Suspendierte Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesät und verschiedenen Behandlungen unterzogen. Nach 72-stündiger Behandlung wurden die Zellen in serumfreiem DMEM mit 10 μM DCFH-DA (Beyotime) suspendiert. Der ROS-Gehalt wurde dann durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung auf einem Beckman Coulter Flow Cytometry System mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 525 nm bestimmt [18].

Bestimmung der Lipidperoxidation (LPO)

Der Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen-Assay (TBARS) wurde zum Nachweis von LPO durchgeführt. Alle Arbeitsschritte wurden gemäß den Anweisungen (Sigma USA) durchgeführt. Die Konzentrationen wurden unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten von 1,56×105/(M·cm) berechnet, der unter Verwendung von Malondialdehyd als Standard ermittelt wurde. Die Ergebnisse werden als nmol MDA-Äquivalente/mg Protein ausgedrückt.

Bestimmung von Enzymaktivitäten

Die Enzymaktivitäten wurden mit Testkits getestet, die Glutathionreduktase (GR), Glutathionperoxidase (GPx) und Superoxiddismutase (SOD) umfassten. Alle Arbeitsschritte wurden gemäß den mitgelieferten Anweisungen durchgeführt (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China).

Tiere und Versuchsprotokoll

Reife männliche Wistar-Ratten (180-220 g, 8 Wochen alt) wurden vom Tierzentrum der Vierten Militärmedizinischen Universität, Xi'an, China, erhalten. Die Genehmigung zur Verwendung der Tiere wurde von der Ethikkommission der Universität eingeholt (Referenznummer: 20190506). Der Tierversuch wurde gemäß den universitären Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt.

Alle Ratten durften sich vor Beginn des Experiments etwa eine Woche lang anpassen. Nach der Akklimatisierung wurden die Ratten zufällig in 6 Gruppen mit jeweils 5 Tieren aufgeteilt. Die Ratten in der Kontrollgruppe wurden unter Normaldruck (PO2: 20 %; Luftdruck: 101,3 kPa) aufgezogen, während die Ratten in der Modell- und Cis-behandelten Gruppe in einer Sauerstoffkammer mit niedrigem Druck (Innendruck von 61,6 kPa) aufgezogen wurden , entspricht einer Höhe von 4000 Metern über dem Meeresspiegel; PO2: 14,55 % zur Simulation einer hypoxischen Umgebung in großer Höhe. Alle Ratten hatten freien Zugang zu Futter und Wasser in Plastikkäfigen bei 22 ± 2 Grad und Feuchtigkeitsbedingungen mit einem automatischen 12-stündigen Hell/Dunkel-Zyklus. Die Ratten in den Modell- und Cis-behandelten Gruppen blieben unter hypobaren Bedingungen, wurden jedoch alle 96 Stunden in normobare Bedingungen überführt, wobei ihnen Futter und Wasser zur Verfügung gestellt und die Käfige gereinigt wurden. Die Dauer des Übergangs von hypobar zu hypobar betrug etwa 2 Stunden. Alle Behandlungsgruppen wurden 8 Wochen lang über eine orale Sonde mit dem entsprechenden Cis (8 mg/kg/Tag) behandelt, während die Kontroll- und Modellratten mit einem gleichen Volumen Wasser behandelt wurden.

Nach 8 Wochen wurden die Ratten unter Narkose getötet. Hoden, Nebenhoden und Samenbläschen wurden abgetrennt und gewogen, und der Organindex wurde nach der folgenden Formel berechnet: (Gewicht des Organs/Tiergewicht) × 100 %. Anschließend wurden die Spermien im Nebenhoden gesammelt und auf ihre Beweglichkeit und Akrosom-Enzymaktivität getestet. In ähnlicher Weise wurden Hodengewebe für histopathologische Untersuchungen und den Nachweis von ROS, LPO und antioxidativer Enzymaktivität gesammelt.

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Auswertung der Lebendspermienrate

Der Nebenhoden wurde mit einer chirurgischen Schere eingeschnitten und die Spermiensuspension wurde in normaler Kochsalzlösung zubereitet. Um die Lebendspermienrate zu bewerten, wurden 5 μl der Spermiensuspension vorsichtig mit einem gleichen Volumen Eosin-Y-Färbung gemischt. Anschließend wurden die Spermien unter einem Lichtmikroskop gezählt. Die Lebendspermienrate wurde ermittelt, indem sowohl gefärbte (tote Spermien) als auch ungefärbte Spermien (lebende Spermien) berechnet wurden.

Bestimmung der Enzymaktivität des Spermienakrosoms

Der Spermien-Akrosomen-Enzymaktivitätstest wurde zur Bewertung der Spermien-Akrosomen-Enzyme eingesetzt [19]. Die Ergebnisse in jeder Gruppe wurden anhand der folgenden Formel berechnet: Akrosom-Enzymaktivität (μIU)=(ODExperiment-Gruppe – ODBlank-Gruppe)/(247,5×10) × 106.

Ergebnisse

Auswirkungen von Hypoxie auf GC-1-Zellen

Um die Auswirkungen von Hypoxie auf Keimzellen zu bestimmen, untersuchten wir zunächst die Veränderungen der Zelllebensfähigkeit nach Hypoxiebehandlung mit unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen (20 %, 15 %, 10 % und 5 %) für 1, 3, 5 bzw. 7 Tage. Die Ergebnisse des CCK-8-Assays zeigten, dass Zellen, die Hypoxie ausgesetzt waren, im Vergleich zur Kontrollgruppe (20 % Sauerstoffkonzentration) eine signifikante Abnahme der Lebensfähigkeit aufwiesen (P < 0,01; Abbildung 1A). Darüber hinaus war ihre Überlebensrate umgekehrt proportional zur Sauerstoffkonzentration und nahm mit der Induktionszeit weiter ab. Um eine übermäßige zytotoxische Wirkung zu vermeiden, wurden eine Sauerstoffkonzentration von 10 % und eine Induktionszeit von 3-Tagen als hypoxische Modellkriterien für nachfolgende In-vitro-Experimente ausgewählt.

Anschließend wurden FCM- und Immunfluoreszenzfärbungen durchgeführt, um die Proliferationsveränderung von GC{{0}}-Zellen unter Hypoxiebehandlung weiter zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass Hypoxie einen GC-1-Zellstillstand in der G1-Phase auslösen kann, wodurch der Zelleintritt in die S-Phase verringert und die DNA-Replikation gehemmt wird. Somit reduzierte Hypoxie den Proliferationsindex von GC-1-Zellen signifikant (P < 0,01; Abbildung 1B). Die positive Ki-67-Färbung ist ein weiterer spezifischer Biomarker für proliferierende Zellen. Daher untersuchten wir auch das Verhältnis von Ki-67-positiven Zellen mit oder ohne Hypoxiebehandlung. Im Vergleich zur Kontrollgruppe reduzierte die Hypoxiebehandlung die Ki-67--positiven Zellen deutlich, wie in Abbildung 1C dargestellt.

Als nächstes wollten wir die Art der durch Hypoxie induzierten Hemmung der Lebensfähigkeit von GC{{0}}-Zellen untersuchen. Wie in der Literatur berichtet, stieg der ROS-Spiegel an, wenn Ratten einer hypobaren hypoxischen Umgebung ausgesetzt wurden [8, 20]. Daher wurden endogene ROS-Spiegel in GC-1-Zellen mithilfe des FCM-Assays gemessen. Die Ergebnisse zeigten höhere ROS-Werte unter Hypoxie im Vergleich zur Gruppe mit normalem Sauerstoff (P ​​< 0,01; Abbildung 1D). Akkumulierte ROS verursachen eine deutliche DNA-Beeinträchtigung, die wiederum eine Aktivierung des Zellapoptose-Signalwegs verursacht und möglicherweise der wichtigste ätiologische Faktor für das steigende Risiko männlicher Unfruchtbarkeit ist (21, 22). Als nächstes haben wir den apoptotischen Aktivierungseffekt von Hypoxie auf GC-1-Zellen durch TUNEL-Färbung nachgewiesen. Wie in Abbildung 1E dargestellt, führte die Behandlung mit Hypoxie im Vergleich zur Kontrollgruppe zu einem Anstieg der TUNEL-Fluoreszenz, was auf einen Anstieg der Apoptose in der Modellgruppe hinweist.

Da ROS-induzierte Zellschäden normalerweise durch OS verursacht werden, haben wir das OS von GC-1-Zellen weiter getestet. Wie in Abbildung 1F dargestellt, waren die LPO-Werte der GC-1-Zellen in der Modellgruppe im Vergleich zu den LPO-Werten der GC-1-Zellen in der Kontrollgruppe deutlich erhöht. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine durch Hypoxie verursachte GC-1-Zellschädigung mit dem OS zusammenhängt, das durch die ROS-Akkumulation induziert wird.