Klonierung, funktionelle Identifizierung und Expressionsanalyse der Chalcon-Synthase aus Cistanche Tubulosa
Mar 25, 2024
Zusammenfassung: Ziel: Untersuchung der Funktion der Chalkonsynthase aus Guanhuaroucongrong (Cistanche tubulosa) und das Expressionsmuster des CtCHS-Gens in weißen, roten und violetten Blüten.
Methoden Das CtCHS-Gen wurde mittels RT-PCR kloniert und eine bioinformatische Analyse durchgeführt. Das pET-28a-CtCHS-Plasmid wurde in Escherichia coli übertragen, um die Proteinexpression durch IPTG zu induzieren. Das rekombinante CtCHS-Protein wurde mit den Substraten p-Cumaroyl-CoA und Malonyl-CoA inkubiert und die Produkte wurden durch HPLC und MS nachgewiesen. Das pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS-Plasmid wurde in den Protoplasten von Arabidopsis thaliana übertragen, um die subzelluläre Lokalisierung des CtCHS-Proteins zu beobachten. Das Expressionsmuster des CtCHS-Gens in den Blüten vonC. tubulosamit drei Farben wurde durch qRT-PCR nachgewiesen.
Ergebnisse Ein CtCHS-Gen wurde kloniert. Die Länge des offenen Leserahmens (ORF) betrug 1173 bp und kodierte 390 Aminosäuren, und das Molekulargewicht des Proteins betrug 42 8000. CtCHS enthielt die katalytischen Reste Cys164, His303, Asn336, die in der Chalkonsynthase konserviert wurden. Das CtCHS-Protein wurde in E. coli exprimiert und gereinigt, um das rekombinante Protein zu erhalten. Das CtCHS-Protein könnte p-Cumaroyl-CoA und Malonyl-CoA katalysieren, um Naringenin-Chalcon zu produzieren. Das CtCHS-Protein war hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. Das CtCHS-Gen wurde in violetten und roten Blüten stark exprimiert, und die relativen Expressionsniveaus waren 8,44- bzw. 3,21-mal höher als in weißen Blüten.
Schlussfolgerung Ein CtCHS-Gen wurde aus der Blüte von geklontC. tubulosaund Protein wurde exprimiert. Das CtCHS-Protein hat eine Chalkonsynthase-Funktion und die Expression des CtCHS-Gens ist in dunkleren Blüten höher, was darauf hindeutet, dass das CtCHS-Gen die Blütenfarbe von C. tubulosa regulieren könnte, was eine Grundlage für weitere Forschungen zu diesem Thema legtRegulationsmechanismus der Blütenfarbe von C. tubulosa.
Schlüsselwörter:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; Chalkonsynthase; Analyse der Enzymaktivität; subzelluläre Lokalisierung; Ausdrucksanalyse
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Die BiosyntheseWeg der Flavonoidebeginnt mit dem Phenylpropanoid-Weg.Phenylalaninwird zunächst in Zimtsäure umgewandeltWirkung der Phenylalanin-Ammonialyase(PAL) und Zimtsäure wird durch Zimtsäure 4-hydroxyliert. Das Enzym (Zimtsäure-4-hydroxylase, C4H) und 4-Cumaratecoenzym A-Ligase (4-Cumaratecoenzym A-Ligase, 4CL) katalysieren die Reaktion zur Bildung von 4-Cumaroyl-CoA [11 ]. Ein Molekül 4-Cumaroyl-CoA und drei Moleküle Malonyl-CoA werden durch Chalkonsynthase (CHS) katalysiert, um Naringenin-Chalcon zu erzeugen, das Flavonoidverbindungen enthält. Das Grundgerüst der Chalconisomerase, Flavanon-3-hydroxylase, Dihydroflavonol-4--Reduktase usw. erzeugt eine Vielzahl von Flavonoiden wie Isoflavone, Flavonole, Anthocyane usw. [12]. Als Schlüsselenzym im Flavonoid-Biosyntheseweg reguliert CHS den Flavonoidgehalt in Pflanzen und spielt auch eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Blütenfarbe von Pflanzen [13]. Beispielsweise kann die posttranskriptionelle Gen-Stummschaltung von Gentiana scabra Bunge CHS die Biosynthese von Anthocyanen hemmen und eine spezifische Aufhellung der Kronlappen bewirken [14]. CHS-Gen-Stummschaltung von Actinidia erianthaBenth. CHS reduziert den Anthocyangehalt in Blütenblättern und lässt die Blütenblätter rot werden. Die Blütenblätter werden heller[15]. Daher wurde in dieser Studie ein CtCHS-Gen aus Cistanche tubulosa-Blüten kloniert und eine bioinformatische Analyse, prokaryotische Expression und Reinigung, Enzymaktivitätsanalyse, subzelluläre Lokalisierungsanalyse und Expressionsanalyse in drei Blütenfarben durchgeführt, um die Funktion von CtCHS zu untersuchen Protein und das Expressionsmuster des CtCHS-Gens wurden verwendet, um vorläufig die Beziehung zwischen CtCHS und der Blütenfarbe von Cistanche tubulosa zu untersuchen, was den Grundstein für die Untersuchung des Regulierungsmechanismus von legteCistanche tubulosa Blütenfarbe.
1 Materialien und Instrumente
1.1 Materialien
Cistanche tubulosa-Blüten wurden im Mai 2018 im Landkreis Yutian, Präfektur Hotan, Xinjiang, gesammelt. Bei der Probenahme wurde das Zufallsprinzip befolgt und Cistanche tubulosa-Blüten mit gutem physiologischem Zustand und gleichbleibender Pflanzenhöhe ausgewählt. Drei Stämme von Cistanche tubulosa mit den drei Blütenfarben Weiß, Rot und Lila wurden von Professor Tu Pengfei von der Fakultät für Pharmazie der Universität Peking entnommen und als Cistanche tubulosa (Schenk) Wight identifiziert. Sie wurden schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann im Trockeneislager nach Peking transportiert. Chemisch kompetente E. coli DH5-Zellen wurden von Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd. erworben, und chemisch kompetente E. coli BL21 (DE3)-Zellen wurden von Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd. erworben; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Der Vektor wurde von Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. erworben. Malonyl-CoA wurde von Sigma Company erworben, 4-Cumaroyl-CoA, Naringenin -Chalcon wurde von Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. gekauft und Naringenin wurde von Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd. gekauft.
1.2 Instrumente
Nanodrop 2000C-Spektrophotometer (Thermo Fisher Company, USA); Gradienten-PCR-Instrument (Eppendorf Company, Deutschland); CFX 96 Fluoreszenz-quantitatives PCR-Instrument, UVP-Gel-Imager, Gelelektrophorese-Instrument, Protein-Elektrophorese-Instrument (BioRad Company, USA); EnSpire
Mikroplattenlesegerät (PerkinElmer Company, USA); Inkubator mit konstanter Temperatur (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D-Volltemperaturoszillator mit großer Kapazität (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Ein Wasserbad-Konstanttemperaturoszillator (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH Ultra-Clean-Werkbank (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); Hochdruck-Dampfsterilisator (TOMY Company, Japan); Reinwassergerät Milli Q (Millipore, USA); LC-20Ein hocheffizienter Flüssigphasenchromatograph (Shimadzu Company, Japan); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap hochauflösende Massenspektrometrie (Thermo Fisher Company, USA); Konfokales Lasermikroskop FV1200 (Olympus Company, Japan).
2 Experimentelle Methoden
2.1 RNA-Extraktion und cDNA-Synthese.
Cistanche tubulosa-Blüten wurden in flüssigem Stickstoff gemahlen und dann einem RNA-Extraktionstest unterzogen.
Die Gesamt-RNA wurde mit einem Kit (Norgen, Kat. 17200) extrahiert, die RNA-Konzentration und -Qualität wurden mit NanoDrop 2000C ermittelt und RNA-Proben mit einem A260/A280-Verhältnis zwischen 1,8 und 2,1 wurden für die Reverse Transkription zur Synthese von cDNA ausgewählt. M-MLV-Reverse-Transkriptase (Promega, M170B) wurde verwendet, um die qualifizierte Gesamt-RNA revers in cDNA zu transkribieren. Die experimentellen Arbeiten wurden gemäß den Anweisungen durchgeführt.
2.2 Klonierung des CtCHS-Gens
Basierend auf den Cistanche tubulosa-Blütentranskriptomdaten unserer Forschungsgruppe (16) wurde ein CtCHS mit einem vollständig offenen Leserahmen herausgesucht und die SnapGene-Software verwendet, um spezifische Primer basierend auf der Gensequenz zu entwerfen (Tabelle 1). Die PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung der cDNA der Blüte von Cistanche tubulosa als Matrize durchgeführt. Das Amplifikationssystem bestand aus 2×Phanta Max Buffer 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, Upstream- und Downstream-Primer (10 μmol/L) jeweils 2 μL, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL, ddH2O 17 μL. Die Reaktionsbedingungen waren: Vordenaturierung bei 95 Grad für 3 Minuten; 25 Denaturierungszyklen bei 95 Grad für 15 Sekunden, Annealing bei 55 Grad für 15 Sekunden und Extension bei 72 Grad für 1 Minute; Reaktionsverlängerung bei 72 Grad für 5 Minuten. Das PCR-Produkt wurde durch 1 % Agarosegelelektrophorese nachgewiesen und das DNA-Reinigungskit (Novizan, Cat DC301-01) wurde zur Gelgewinnung verwendet. Anschließend wurde die gewonnene DNA mit einem Schnellklonierungskit (Novizan, Cat C601-01). Das DNA-Fragment wurde mit dem pCE2TA/Blunt-Zero-Vektor ligiert, in kompetente Escherichia coli DH5-Zellen transformiert und nach Kultivierung über Nacht bei 37 Grad wurden einzelne Klonstämme ausgewählt und zur Sequenzierung an das Unternehmen geschickt.
Tabelle 1 Primersequenzen
2.3 Bioinformatische Analyse
Verwenden Sie die Online-Software ProtParam, um die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Proteinen zu analysieren. Verwenden Sie das Online-Tool Prot Scale, um die Hydrophilie/Hydrophobie von Proteinen zu analysieren. Verwenden Sie das Online-Tool SOPMA, um die Sekundärstruktur von Proteinen vorherzusagen. Verwenden Sie die Online-Analysesoftware SWISS-MODEL, um die Tertiärstruktur von Proteinen vorherzusagen. Verwenden Sie die Online-Software TMHMM. Sagen Sie die Transmembranstruktur des Proteins voraus. Verwenden Sie die DNAMAN-Software, um die Homologie von CtCHS mit den CHS-Aminosäuresequenzen anderer Arten zu vergleichen. Verwenden Sie die MEGA-X-Software, um mithilfe von Neighbor-Joining (NJ) und Poisson-Korrektur einen phylogenetischen Baum zu erstellen. Die evolutionäre Distanz wird mithilfe der Bootstrap-Methode berechnet und die Anzahl der Bootstrap-Wiederholungen beträgt 1000 Mal.
2.4 CtCHS-prokaryotische Expression und Reinigung
Entwerfen Sie Primer mit den Restriktionsstellen BamHⅠ und XhoⅠ basierend auf der CtCHS-Sequenz und verstärken Sie die entsprechenden Zielfragmente per PCR. Der pET-28a-Vektor und das Zielfragment wurden mit den Endonukleasen BamHI und verdaut. Der klonierte Stamm wird sequenziert und das Plasmid nach korrekter Sequenzierung extrahiert. Das durch Sequenzierung verifizierte pET-28a-CtCHS-Plasmid wurde in kompetente Escherichia coli BL21 (DE3)-Zellen übertragen. Siehe die Methode von Ding Ning et al. [17] mit Isopropyl
-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) wurde zur Induktion der Proteinexpression bei niedriger Temperatur verwendet und über eine Ni2+-Affinitätschromatographiesäule (Cytiva, Cat 17531901) gereinigt. Das Protein wurde durch Zentrifugation in einem Ultrafiltrationsröhrchen (Millipore, 30 000) konzentriert und entsalzt. In 20 mmol/L KPB-Puffer (pH 8,0, enthält 1 mmol/LEDTA) lagern und zur Langzeitlagerung in einem Kühlschrank mit −80 Grad aufbewahren.
2.5 CtCHS-Enzymaktivitätsanalyse
CtCHS-Enzymreaktionssystem: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L Malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-Cumaroyl-CoA 2 μL, CtCHS rekombinant Protein 20 μL, in Nach 12-stündiger Reaktion in einem Wasserbad bei 37 Grad wurde die Mischung dreimal mit 800 μL Ethylacetat extrahiert, im Stickstoffstrom getrocknet und dann in 100 μL Methanol gelöst. Verwenden Sie Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, um das Produkt nachzuweisen. Die Bedingungen sind Ultimate LP-C18-Säule (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), Säulentemperatur 30 Grad, Probenvolumen 10 μl und Wasser (A) und Acetonitril (B) als Fluss. Phase, Elutionsgradient: 0~10
min. 30 % B; 10–20 Min., 30–60 % B; 20–25 Min., 60–70 % B; 25–30 Min., 70–80 % B; 30–35 Min., 80–100 % B; 35-40 min, 100 % B; 40-46 min, 100 %-30 % B. Die Volumenflussrate beträgt 1 ml/min und die Detektion erfolgt bei einer Wellenlänge von 290 nm.
Zur weiteren Detektion wurde UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS verwendet. Die Flüssigphasenbedingungen waren Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18-Säule (100 mm × 3,0 mm, 1,7 μm), Säulentemperatur 40 Grad, Naringenin- Chalkon- und Naringenin-Kontrollen. Das Ladevolumen des Produkts beträgt 4 μL und das Ladevolumen des Enzymreaktionsprodukts beträgt 7 μL. Als mobile Phase wird Wasser (A)-Acetonitril (B) verwendet. Der Elutionsgradient beträgt: 0 bis 5 Min., 30 % B; 5 bis 15 Min., 30 %-60% B; 15-20 min, 60 %-100 % B; 20-25 min, 100 % B; 25-31 min, 100 %-30 % B. Die volumetrische Flussrate beträgt 0,3 ml/min. Die Massenspektrometriebedingungen sind Elektrospray-Ionenquelle, Stickstoff als Trägergas, Hüllgasdruck 3,5 MPa, Hilfsgasdruck 1,0 MPa, Sprühdruck 3500 V, Kapillartemperatur 350 Grad, Hilfsgas-Heiztemperatur 200 Grad, positive und negative Ionenmodi, Scannen Ionenbereich m/z ist 100-1500, volle MS-Auflösung ist 35 000, dd-MS2-Auflösung ist 17 500, (N)
CE/Stufenzahl auf 35, 60 eingestellt.
2.3 Bioinformatische Analyse
Verwenden Sie die Online-Software ProtParam, um die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Proteinen zu analysieren. Verwenden Sie das Online-Tool Prot Scale, um die Hydrophilie/Hydrophobie von Proteinen zu analysieren. Verwenden Sie das Online-Tool SOPMA, um die Sekundärstruktur von Proteinen vorherzusagen. Verwenden Sie die Online-Analysesoftware SWISS-MODEL, um die Tertiärstruktur von Proteinen vorherzusagen. Verwenden Sie die Online-Software TMHMM. Sagen Sie die Transmembranstruktur des Proteins voraus. Verwenden Sie die DNAMAN-Software, um die Homologie von CtCHS mit den CHS-Aminosäuresequenzen anderer Arten zu vergleichen. Verwenden Sie die MEGA-X-Software, um mithilfe von Neighbor-Joining (NJ) und Poisson-Korrektur einen phylogenetischen Baum zu erstellen. Die evolutionäre Distanz wird mithilfe der Bootstrap-Methode berechnet und die Anzahl der Bootstrap-Wiederholungen beträgt 1000 Mal.
2.4 CtCHS-prokaryotische Expression und Reinigung
Entwerfen Sie Primer mit den Restriktionsstellen BamHⅠ und XhoⅠ basierend auf der CtCHS-Sequenz und verstärken Sie die entsprechenden Zielfragmente per PCR. Der pET-28a-Vektor und das Zielfragment wurden mit den Endonukleasen BamHI und verdaut. Der klonierte Stamm wird sequenziert und das Plasmid nach korrekter Sequenzierung extrahiert. Das durch Sequenzierung verifizierte pET-28a-CtCHS-Plasmid wurde in kompetente Escherichia coli BL21 (DE3)-Zellen übertragen. Siehe die Methode von Ding Ning et al. [17] mit Isopropyl
-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) wurde zur Induktion der Proteinexpression bei niedriger Temperatur verwendet und über eine Ni2+-Affinitätschromatographiesäule (Cytiva, Cat 17531901) gereinigt. Das Protein wurde durch Zentrifugation in einem Ultrafiltrationsröhrchen (Millipore, 30 000) konzentriert und entsalzt. In 20 mmol/L KPB-Puffer (pH 8,0, enthält 1 mmol/LEDTA) lagern und zur Langzeitlagerung in einem Kühlschrank mit −80 Grad aufbewahren.
2.5 CtCHS-Enzymaktivitätsanalyse
CtCHS-Enzymreaktionssystem: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L Malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-Cumaroyl-CoA 2 μL, CtCHS rekombinant Protein 20 μL, in Nach 12-stündiger Reaktion in einem Wasserbad bei 37 Grad wurde die Mischung dreimal mit 800 μL Ethylacetat extrahiert, im Stickstoffstrom getrocknet und dann in 100 μL Methanol gelöst. Verwenden Sie Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, um das Produkt nachzuweisen. Die Bedingungen sind Ultimate LP-C18-Säule (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), Säulentemperatur 30 Grad, Probenvolumen 10 μl und Wasser (A) und Acetonitril (B) als Fluss. Phase, Elutionsgradient: 0~10
min. 30 % B; 10–20 Min., 30–60 % B; 20–25 Min., 60–70 % B; 25–30 Min., 70–80 % B; 30–35 Min., 80–100 % B; 35-40 min, 100 % B; 40-46 min, 100 %-30 % B. Die Volumenflussrate beträgt 1 ml/min und die Detektion erfolgt bei einer Wellenlänge von 290 nm.
Zur weiteren Detektion wurde UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS verwendet. Die Flüssigphasenbedingungen waren Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18-Säule (100 mm × 3,0 mm, 1,7 μm), Säulentemperatur 40 Grad, Naringenin- Chalkon- und Naringenin-Kontrollen. Das Ladevolumen des Produkts beträgt 4 μL und das Ladevolumen des Enzymreaktionsprodukts beträgt 7 μL. Als mobile Phase wird Wasser (A)-Acetonitril (B) verwendet. Der Elutionsgradient beträgt: 0 bis 5 Min., 30 % B; 5 bis 15 Min., 30 %-60% B; 15-20 min, 60 %-100 % B; 20-25 min, 100 % B; 25-31 min, 100 %-30 % B. Die volumetrische Flussrate beträgt 0,3 ml/min. Die Massenspektrometriebedingungen sind Elektrospray-Ionenquelle, Stickstoff als Trägergas, Hüllgasdruck 3,5 MPa, Hilfsgasdruck 1,0 MPa, Sprühdruck 3500 V, Kapillartemperatur 350 Grad, Hilfsgas-Heiztemperatur 200 Grad, positive und negative Ionenmodi, Scannen Ionenbereich m/z ist 100-1500, volle MS-Auflösung ist 35 000, dd-MS2-Auflösung ist 17 500, (N)
CE/Stufenzahl auf 35, 60 eingestellt.
2.6 Subzelluläre Lokalisierung des CtCHS-Proteins
Basierend auf der CtCHS-Sequenz und dem Prinzip der nahtlosen Klonierung wurden Primer mit den Enzymschnittstellen Kpn Ⅰ und BamH Ⅰ entworfen und die entsprechenden Zielfragmente durch PCR amplifiziert. Das pCAMBIA1300-35S-GFP-Plasmid wurde mit den Restriktionsendonukleasen Kpn Ⅰ und BamH Ⅰ verdaut, und das Zielfragment und der Vektor wurden über das Seamless Cloning Kit (Novizan, Cat C115-01) verbunden und dann übertragen in E. coli DH5-kompetente Zellen. , wählen Sie einzelne Klonstämme für die Sequenzierung aus und extrahieren Sie Plasmide aus den richtigen Stämmen. Die Plasmide pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS und pCAMBIA 1300-35S-GFP wurden mit PEG4000 in Arabidopsis thaliana-Protoplasten transformiert und 8 bis 10 Stunden lang bei schwachem Licht kultiviert. Die subzelluläre Lokalisierung des CtCHS-Proteins wurde unter einem konfokalen Lasermikroskop beobachtet.
2.7 CtCHS-Expressionsmusteranalyse
Quantitative Echtzeit-Fluoreszenzprimer wurden mit DNAMAN basierend auf der CtCHS-Sequenz mit F-Box als internem Referenzgen entworfen. Die Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die relative Expression von CtCHS in Cistanche tubulosa-Blüten unterschiedlicher Farbe wurde durch quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR nachgewiesen. Verwenden Sie TransStart Green qPCR SuperMix (Vollgold, AQ101-02), um mit der SYBRGreen-Fluoreszenzfarbstoffmethode zu messen. Reaktionssystem: 2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL, Upstream- und Downstream-Primer (10 μmol/L) jeweils 0,2 μL, cDNA-Template 0,5 μL, 4,1 μL nukleotidasefreies Wasser wurden verwendet für die Reaktion mit einem zweistufigen Verfahren. Das Reaktionsverfahren basierte auf der Methode von Dong Xianjuan et al. [18]. Jede Probe enthielt drei biologische Replikate und das Experiment wurde dreimal wiederholt. Die experimentellen Daten wurden mit Excel analysiert, der relative Ausdruck von CtCHS wurde mit der 2−ΔΔCt-Methode berechnet und GraphPadPrism 8 wurde verwendet, um eine Signifikanzanalyse durchzuführen und Histogramme zu zeichnen.
