Klonierung, funktionelle Identifizierung und Expressionsanalyse der Chalcon-Synthase aus Cistanche Tubulosa Ⅱ

3 Ergebnisse und Analyse

3.1 Klonierung des CtCHS-Gens

Vier als „Chalconsynthase“ bezeichnete Sequenzen wurden anhand der Transkriptomdaten von Cistanches tubulosa-Blüten herausgesucht. Durch den Blast-Vergleich von NCBI wurde festgestellt, dass nur eine Sequenz die volle Länge des CHS-Gens und einen FPKM von mehr als 10 aufwies. Basierend auf dieser Sequenz wurden spezifische Primer entworfen und durch PCR-Amplifikation wurde ein Fragment von etwa 1200 bp erhalten Cistanches tubulosa-Blüten-cDNA als Vorlage (Abbildung 1). Das PCR-Produkt wurde über ein Gel gewonnen und mit dem pCE2TA/Blunt-Zero-Vektor verbunden. Die Sequenzierungsergebnisse stimmten mit der Transkriptomanalyse überein. Das Gen wurde CtCHS genannt. Die Sequenzlänge beträgt 1173 bp und kodiert 390 Aminosäuren.

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3.2 Bioinformatische Analyse von CtCHS

3.2.1 Physikalische und chemische Eigenschaften von CtCHS und Transmembrandomänenanalyse

Mit der Online-Software ProtParam wurden die physikalischen und chemischen Eigenschaften des vom CtCHS-Gen kodierten Proteins analysiert. CtCHS kodiert für 39 0 Aminosäuren, die Summenformel lautet C1908H3041N511O562S22, die relative Molekülmasse beträgt 42 836.54, der theoretische isoelektrische Punkt beträgt 5,85 und es ist instabil. Der Koeffizient II beträgt 43,24, was einem instabilen Protein entspricht, und die durchschnittliche Gesamthydrophilie (GRAVY) beträgt –0,052, was einem hydrophilen Protein entspricht. Das Online-Tool Prot Scale wurde außerdem zur Analyse der Proteinhydrophilie/-hydrophobie verwendet. Die Analyseergebnisse zeigten, dass der Maximalwert der Hydrophilie/Hydrophobie des CtCHS-Proteins 2,422 (342) und der Minimalwert –2,489 (119) betrug. Die vom CtCHS-Gen kodierte Aminosäurepeptidkette weist mehr hydrophile Aminosäurereste als hydrophobe Aminosäurereste auf, es handelt sich also um ein hydrophiles Protein. Zur Vorhersage der Transmembranstruktur des Proteins wurde die Online-Software TMHMM verwendet. Das CtCHS-Protein hat keine Transmembrandomäne.

Abb. 1 PCR-Amplifikation des CtCHS-Gens

3.2.2 Vorhersage der Sekundärstruktur und Tertiärstruktur des CtCHS-Proteins

Zur Vorhersage der Proteinsekundärstruktur wurde das Online-Tool SOPMA verwendet. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2-A dargestellt. 44,87 % -Helices, 31,03 % Random-Coils, 15,64 % verlängerte Ketten und 8,46 % -Faltblätter bilden die Sekundärstruktur des CtCHS-Proteins. Ebenenstruktur. Die Online-Analysesoftware SWISS-MODEL wurde verwendet, um die Tertiärstruktur des Proteins vorherzusagen, und die Kristallstruktur von Reis CHS1 wurde als Vorlage verwendet, um die dreidimensionale Struktur des CtCHS-Proteins vorherzusagen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2-B dargestellt. Die Konsistenz zwischen Cistanche tubulosa CtCHS und Reis CHS1 beträgt 83,55 %.

3.2.3 Sequenzvergleich und phylogenetische Baumanalyse und Anwendung

Die DNAMAN-Software führt einen Homologievergleich zwischen CtCHS und den CHS-Aminosäuresequenzen anderer Spezies durch. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3-C dargestellt. Die CtCHS-Aminosäuresequenz stimmt mit Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) und Antirrhinum majus L. (P06515. 1), Mazus pumilus (NL Burman)Steenis (AAN05791.1) und Erythranthe lewisiiG überein. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1) und Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). Die Aminosäuresequenzen von CHS sind sehr ähnlich, wobei die Ähnlichkeit 90,93 %, 90,68 %, 90,18 %, 89,42 %, 89,42 % und 81,61 % beträgt.

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Darüber hinaus zeigte das Mehrfachsequenz-Alignment, dass CtCHS die katalytischen Reste Cys164, His303 und Asn336 konserviert hat. Um die evolutionäre Position von Cistanche tubulosa CtCHS in der pflanzlichen CHS-Familie besser zu verstehen, wurde die MEGA-X-Software verwendet, um einen phylogenetischen Baum zwischen CtCHS- und CHS-Proteinen anderer Pflanzen zu erstellen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3-DE lewisii AHJ80976.1) dargestellt. ElCHS ist eng verwandt.

3.3 CtCHS-prokaryotische Expression und Reinigung

Das pET-28a-CtCHS-Plasmid wurde in den E. coli-Expressionsstamm BL21 (DE3) transformiert und die Proteinexpression wurde durch IPTG bei niedriger Temperatur induziert. Das Protein wurde unter Verwendung einer Nickelionen-Affinitätschromatographiesäule gereinigt und das gereinigte Protein wurde durch 10 % SDSPAGE nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3 dargestellt. Die CtCHS-Proteinbande erschien in der Nähe von 40,000, was mit der relativen Molekülmasse des CtCHS-Proteins von 42.800 übereinstimmt.

3.4 CtCHS-Enzymaktivitätsanalyse

Um die Funktion von CtCHS zu identifizieren, wurde das gereinigte CtCHS-Protein mit Malonyl-CoA und 4-Cumaroyl-CoA inkubiert und die Produkte mittels HPLC und MS nachgewiesen. Unter natürlichen Bedingungen ist Naringenin-Chalcon in Lösung instabil und wird leicht zu Naringenin zyklisiert. Daher wurden Naringenin-Chalcon und Naringenin als Standardkontrollen ausgewählt.

Die HPLC-Testergebnisse sind in den Abbildungen 4-A und B dargestellt. Die Retentionszeit des Enzymreaktionsprodukts ähnelt der des Naringenin-Standards. Beide weisen im UV-Absorptionsspektrum eine maximale Absorption bei 289 nm auf, was sich von der Retentionszeit von Naringenin-Chalcon unterscheidet. Die Zeit- und UV-Absorptionsspektren waren unterschiedlich, aber als Negativkontrolle enthielt das Produkt nach der Inkubation des bei hoher Temperatur inaktivierten CtCHS-Proteins mit dem Substrat kein Naringenin, Chalkon und Naringenin. Der weitere Nachweis durch Massenspektrometrie, das Massenspektrum der ersten Ebene (Abbildung 4-C, D), zeigte, dass das Enzymreaktionsprodukt einen [MH]-Peak m/z271.060 97 aufweist, während Naringenin einen [MH]-Peak aufweist ]-Peak m/z 271.060 91.

Beim Vergleich der MS2-Spektren (Abbildung 5-E, F) weisen das CtCHS-Enzymreaktionsprodukt und Naringenin beide charakteristische Fragmentpeaks bei m/z 107, 151 und 177 auf, was mit dem Literaturbericht übereinstimmt [19]. Dies weist darauf hin, dass CtCHS einen Chalkonkomplex aufweist. Enzymatische Aktivität, kann die Reaktion von Malonyl-CoA und 4-Cumaroyl-CoA zu Naringenin-Chalcon katalysieren.

3.5 Subzelluläre Lokalisierungsanalyse

Um die Rolle des CtCHS-Proteins in Zellen zu untersuchen, wurde das Plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS konstruiert und in Protoplasten von Arabidopsis thaliana transformiert, um dessen subzelluläre Lokalisierung zu beobachten. Die Ergebnisse sind in Abbildung 5 dargestellt. Als Kontrolle war das pCAMBIA1300-35S-GFP-Protein im Zellkern und im Zytoplasma verteilt, während das pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS-Fusionsprotein hauptsächlich darin verteilt war im Zytoplasma, was darauf hindeutet, dass das CtCHS-Protein im Zytoplasma von Pflanzenzellen funktionieren könnte. Funktion.

3.6 CtCHS-Expressionsmusteranalyse

qRT-PCR wurde verwendet, um die relative Expression von CtCHS in Cistanche deserticola-Blüten in drei Farben nachzuweisen: Weiß, Lila und Rot. Die Ergebnisse sind in Abbildung 6 dargestellt. Die Expression von CtCHS in violetten und roten Blüten war deutlich höher als die in weißen Blüten. Menge. Im Vergleich zu weißen Blüten ist das Expressionsniveau von CtCHS in violetten Blüten 8,44-mal höher und das Expressionsniveau von CtCHS in roten Blüten 3,21-mal höher. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Veränderungen im CtCHS-Expressionsniveau möglicherweise mit der unterschiedlichen Blütenfarbe von Cistanche deserticola zusammenhängen. Je höher der Ausdrucksgrad, desto dunkler ist die Blütenfarbe. , je niedriger der Ausdrucksgrad, desto heller die Blütenfarbe.

****P＜0.000 1Abb. 6 Relatives Expressionsniveau von CtCHS in Blüten mit unterschiedlichen Farben

4. Diskussion

CHS ist einSchlüsselenzym im Flavonoid-Biosynthesewegund hängt damit zusammene Regulierung der Blütenfarbein vielen Pflanzen. Zum Beispiel die Blütenfarbe vonDianthus chinensisL.[20] und Petunia × hybrida Hort. exVilm.[22] sind alle von CHS betroffen. Kontrolle.Cistanches tubulosahat hauptsächlich drei Blütenfarben: Weiß, Rot und Lila, über den Mechanismus zur Regulierung der Blütenfarbe wurde jedoch noch nicht berichtet. In dieser Studie wurde ein CtCHS-Gen mittels RT-PCR kloniertTranskriptomdatenanalyse von Cistanches tubulosa-Blüten, und sein

Bioinformatische Analysedurchgeführt und die Ergebnisse zeigten, dass CtCHS eine hohe Ähnlichkeit und eine enge genetische Beziehung zur Aminosäuresequenz von ElCHS von Physalis nigra (AHJ80976.1) aufweist. CHS ist eine Typ-III-Polyketidsynthase (PKSIII), und Studien haben ergeben, dass CHS eine konservierte katalytische Cys-His-Asn-Triade aufweist [23]. In dieser Studie zeigte die Aminosäuresequenz-Alignment-Analyse, dass CtCHS die katalytischen Reste Cys164, His303 und Asn336 konserviert hat, was darauf hindeutet, dass CtCHS möglicherweise eine typische Chalkonsynthase-Funktion aufweist.

fähig. Die Enzymaktivitätsanalyse wurde mithilfe der prokaryotischen Expression des CtCHS-Proteins in Escherichia coli durchgeführt und mittels HPLC und MS nachgewiesen. Es wurde festgestellt, dass das CtCHS-Protein 4-Cumaroyl-CoA und Malonyl-CoA katalysieren kann, um Naringenin-Chalcon zu produzieren.

CHS ist in vielen Pflanzen an der Synthese von Flavonoiden beteiligt, sein subzellulärer Standort ist jedoch bei verschiedenen Arten unterschiedlich. Zum Beispiel Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. EaCHS[26] sind alle im Zytoplasma lokalisiert, während Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27], bei der Aubergine Solanum melongena L. befindet sich SmCHS [28] im Zytoplasma und Zellkern und bei der Weintraube Vitis vinifera L. befindet sich VvCHS im Zytoplasma, Zellkern und in der Zellwand [29]. In dieser Studie wurde das Plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS zur Transformation von Protoplasten von Arabidopsis thaliana verwendet und es wurde beobachtet, dass das CtCHS-Protein hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert war und möglicherweise die Produktion von Naringenin-Chalcon im Zytoplasma katalysiert fördern die Ansammlung von Flavonoiden.

Der Phenylpropanoid-Weg verzweigt sich von 4-Cumaroyl-CoA in den Flavonoid-Syntheseweg und den Lignan-Biosyntheseweg. CHS katalysiert 4-Cumaroyl-CoA und Malonyl-CoA, um Naringenin und Chalkon zu erzeugen, um Flavonoide zu initiieren. Der Biosyntheseweg verbindungsähnlicher Verbindungen ist das erste Schlüsselenzym in diesem Weg [30]. Daher ist hochexprimiertes CHS für Pflanzen von Vorteil, da sie höhere Mengen an Flavonoiden ansammeln und dunklere Blüten produzieren. Beispielsweise ist das Expressionsniveau von CHS in Sorten mit violetten Blüten von Hosta plantaginea (Lam.) Aschers höher als bei Sorten mit weißen Blüten. Hosta HpCHS wird in Tabak umgewandelt, um zu erhalten. Im Vergleich zu Wildtyp-Tabak haben überexprimierte Pflanzen dunklere Blütenblätter und einen höheren Gesamtanthocyangehalt [31].

In dieser Studie hängt das Expressionsniveau des CtCHS-Gens mit der Farbe der Blüten von Cistanches tubulosa zusammen. Der Anteil an dunkelvioletten und roten Blüten ist stark ausgeprägt, der Anteil an hellen weißen Blüten ist gering. Der Expressionsunterschied von CtCHS kann auf den Unterschied in den Blüten von Cistanches tubulosa zurückzuführen sein. Einer der Gründe für unterschiedliche Anzüge und Farben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie ein CtCHS-Gen aus Cistanche deserticola-Blüten geklont und eine bioinformatische Analyse daran durchgeführt hat. Das rekombinante CtCHS-Protein wurde durch exogene Expression in Escherichia coli erhalten. Die Enzymaktivitätsanalyse bewies, dass das CtCHS-Protein 4-Cumaroyl-Coenzym katalysieren kann. A und Malonyl-Coenzym A erzeugen Naringenin-Chalcon. Es wurde festgestellt, dass das CtCHS-Gen in violetten und roten Blüten stark und in weißen Blüten schwach exprimiert wird. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das CtCHS-Gen die Produktion verschiedener Blütenfarben in Cistanche deserticola regulieren könnte, was für die weitere Erforschung des Regulierungsmechanismus der Blütenfarbe von Cistanche tubulosa von Vorteil ist und eine Referenz für nachfolgende Forschungen zur Rolle von CtCHS bei der Regulierung von Cistanche deserticola darstellt Blütenfarbe in Cistanche deserticola.