Koagulation, Protease-aktivierte Rezeptoren und diabetische Nierenerkrankung: Lehren aus ENOS-defizienten Mäusen

Endotheliale StickoxidsynthaseEs ist bekannt, dass eine (eNOS)-Dysfunktion das Fortschreiten und die Prognose verschlimmertdiabetische Nierenerkrankung(DKD). Einer der Mechanismen, durch die dies erreicht wird, besteht darin, dass niedrige eNOS-Werte mit Hyperkoagulabilität verbunden sind, was eine Nierenschädigung begünstigt. In der extrinsischen Gerinnungskaskade verschlimmern der Gewebefaktor (Faktor III) und nachgeschaltete Gerinnungsfaktoren wie der aktive Faktor X (FXa) die Entzündung durch Aktivierung der Protease-aktivierten Rezeptoren (PARs). Kürzlich wurde gezeigt, dass die fehlende oder verringerte eNOS-Expression bei diabetischen Mäusen als Modell für fortgeschrittene DKD die Nierengewebefaktorspiegel und die PAR1- und 2-Expression in ihren Nieren erhöht. Darüber hinaus kann es zu einer medikamentösen Hemmung oder genetischen Deletion von Gerinnungsfaktoren oder PARs kommengelinderte Entzündungbei DKD bei Mäusen, denen eNOS fehlt. In dieser Übersicht fassen wir die Beziehung zwischen eNOS, Gerinnung und PARs zusammen und schlagen eine neuartige Therapieoption für die Behandlung von Patienten mit DKD vor.

Schlüsselwörter:diabetische Glomerulosklerose; Faktor Xa;Entzündung; Gewebefaktor

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Einführung

Die Anzahl der Patienten mitdiabetische Nierenerkrankung(DKD) nimmt weltweit zu (de Boer et al. 2011; Kainz et al. 2015; Ogurtsova et al. 2017). DKD ist eine der Haupttodesursachen bei Patienten mit diabetischen Komplikationen (Afkarian et al. 2013). Darüber hinaus verläuft DKD fortschreitend und ist die Hauptursache für Nierenerkrankungen im Endstadium, die eine Nierenersatztherapie erfordern (Gregg et al. 2014; Liyanage et al. 2015). In Japan ist diabetische Nephropathie für mehr als 39 % der neuen Dialysepatienten verantwortlich (Nitta et al. 2020). Daher ist die Entwicklung vonneuartiges TherapeutikumFür die Behandlung von Patienten mit DKD sind verschiedene Optionen erforderlich.

System in der DKD-Pathogenese. Hyperkoagulabilität ist mit DKD verbunden (Goldberg 2009; Domingueti et al. 2016). Es wurde gezeigt, dass ein erhöhter Fibrinogenspiegel im Blut mit einer niedrigen geschätzten glomerulären Filtrationsrate, einer hohen Proteinurie und einer schweren histologischen Schädigung verbunden ist und ein Prädiktor für das Fortschreiten einer Nierenerkrankung im Endstadium ist (Dalla Vestra et al. 2005; Pan et al. 2018; Zhang et al. 2018). Einige Studien haben einen Zusammenhang zwischen dem D-Dimer-Spiegel, einem Fibrinabbauprodukt, und einer Nierenfunktionsstörung bei DKD gezeigt (Domingueti et al. 2018; Pan et al. 2018). Die Hyperkoagulabilität bei DKD wird wahrscheinlich durch mehrere Faktoren bestimmt. Beispielsweise aktiviert das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System den Gewebefaktor (TF, Faktor III) und erhöht thrombotische Ereignisse (Dielis et al. 2005). Ansonsten sind Hyperglykämie, Dyslipidämie, Entzündung oder endotheliale Dysfunktion am prothrombotischen Zustand bei der DKD-Pathogenese beteiligt (Goldberg 2009).

Bei DKD liegt eine endotheliale Dysfunktion vor, die zu mikrovaskulären Komplikationen führt (Goldberg 2009; Nakagawa et al. 2011). Eine beeinträchtigte endotheliale Stickoxidsynthase (eNOS)-Produktion oder eine verringerte eNOS-Aktivität (z. B. beeinträchtigte eNOS-Phosphorylierung) ist ein Kennzeichen der endothelialen Dysfunktion bei DKD (Nakagawa et al. 2011; Cheng et al. 2012). Wir haben gezeigt, dass ein Verlust der eNOS-Expression mit einem Anstieg des TF-Spiegels und der Aktivität des extrinsischen Gerinnungssystems zusammenhängt (Li et al. 2010; Wang et al. 2011a), was eng mit thrombotischen Ereignissen bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung verbunden ist Krankheiten (Kolachalama et al. 2018).

Zusätzlich zum erhöhten Risiko thrombotischer Ereignisse vermitteln Gerinnungsproteasen wie der aktive Faktor FVII (FVIIa), der aktive Faktor (FXa) und Thrombin, die in der extrinsischen Gerinnungskaskade vorhanden sind, Gewebeschäden durch einen Protease-aktivierten Rezeptor ( PAR)-abhängigen Mechanismus (Madhusudhan et al. 2016; Posma et al. 2019). In dieser Übersicht fassen wir die Ergebnisse von diabetischen Mäusen ohne eNOS zusammen und diskutieren die Beziehung zwischen dem Gerinnungs-PAR-Signalweg, den eNOS-Spiegeln undDKD-Pathogenese.

Gewebefaktor/Protease-aktivierter Rezeptorweg

Gewebefaktor (TF), bekannt als Faktor III, ist ein 47 kDa großes Transmembranprotein, das mit Faktor VII (FVII) interagiert (Grover und Mackman 2018). Der TF/FVIIa-Komplex ist ein Aktivator der extrinsischen Gerinnungskaskade und katalysiert die Aktivierung von FX und FIX. FXa und aktivierter Cofaktor V (FVa) bilden einen prothrombotischen Komplex, der Thrombin erzeugt. Schließlich wandelt Thrombin Fibrinogen in Fibrin um, was zur Bildung von Thromben führt (Grover und Mackman 2018). TF wird sowohl in glatten Gefäßmuskelzellen als auch in Adventitialfibroblasten exprimiert. Unter entzündlichen Bedingungen wird seine Expression in Endothelzellen oder zirkulierenden Zellen wie Monozyten induziert (Østerud und Bjørklid 2006).

Protease-aktivierte Rezeptoren (PARs) sind Mitglieder der G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Superfamilie, die vier PAR-Proteine ​​(PAR1-4) umfasst. PARs werden am N-terminalen Ende durch Proteasen gespalten und bei der Bindung an einen neuen N-Terminus, der einen gebundenen Liganden enthält, aktiviert. Die vier Mitglieder von PARs (PAR1-4) werden durch spezifische Gerinnungsproteasen aktiviert: Der TF- und FVIIa-Komplex aktiviert PAR2, Faktor Xa aktiviert sowohl PAR1 als auch PAR2 und Thrombin aktiviert PAR1, PAR3 und PAR4 (Camerer et al. 2000; Coughlin 2005; Rothmeier und Ruf 2012; Zhao et al. 2014). Die Beziehung zwischen TF, Gerinnungsproteasen und PARs ist in Abb. 1 dargestellt.

Es ist bekannt, dass PARs in großem Umfang in Nierenzellen exprimiert werden und an der Pathophysiologie von Nierenschäden beteiligt sind. Sowohl PAR1 als auch PAR2 werden in glomerulären Endothelzellen, Mesangialzellen und Nierentubuluszellen exprimiert, die von Menschen oder Mäusen stammen; PAR2, PAR3 und PAR4 werden in menschlichen Podozyten exprimiert; PAR1, PAR3 und PAR4 werden in murinen Podozyten exprimiert (Tanaka et al. 2005; Vesey et al. 2005; Madhusudhan et al. 2012; Dong et al. 2015; Madhusudhan et al. 2016).

Obwohl die schädlichen oder schützenden Wirkungen von PARs inNierenverletzungObwohl nachgewiesen wurde, deuten zunehmende Daten darauf hin, dass PARs Entzündungen verschlimmern, indem sie die Produktion von Zytokinen und Chemokinen stimulieren (Rothmeier und Ruf 2012; Isermann 2017; Posma et al. 2019). In Übereinstimmung mit diesem Befund fördern PAR1- und PAR2-Agonisten die Expression von Entzündungsmediatoren wie Monozyten-chemotaktischem Protein 1 (MCP1) und Plasminogenaktivator-Inhibitor-1 (PAI-1) ​​sowie profibrotischen Molekülen im Endothel , Mesangial- und Nierentubuluszellen (Vesey et al. 2005; Vesey et al. 2013; Ellinghaus et al. 2016; Waasdorp et al. 2016; Oe et al. 2019). In In-vivo-Studien reduzierte das Fehlen von PAR1 oder das Vorhandensein von PAR1-Inhibitoren die Entzündung in Modellen mit halbmondförmiger Glomerulonephritis oder obstruktiver Nierenschädigung (Cunningham et al. 2000; Waasdorp et al. 2019; Lok et al. 2020). Ebenso wurden die therapeutischen Wirkungen der PAR2-Hemmung bei Nierenverletzungen begleitetreduzierte Entzündungin den Nieren (Hayashi et al. 2016; Du et al. 2017; Han et al. 2019; Watanabe et al. 2019).

Endotheliale Stickoxid-Synthase-Polymorphismen bei DKD

Endotheliale Stickoxidsynthase(eNOS) ist eine der drei NOS-Isoformen und trägt zur Produktion von NO im Gefäßendothel bei (Walford und Loscalzo 2003). NO, das von eNOS im Gefäßendothel produziert wird, spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Gefäßentspannung, der Entzündungshemmung und der Verhinderung der Thrombusbildung (Walford und Loscalzo 2003). Eine beeinträchtigte eNOS-Expression ist mit der Entwicklung von DKD verbunden. Kürzlich durchgeführte Metaanalysen am Menschen haben ergeben, dass G894T (rs1799983), C-786T (rs2070744) und Intron 4b/4a ​​(rs869109213) in den eNOS-Genen (NOS3) eng mit den Genen assoziiert sind Entwicklung von DKD (Dellamea et al. 2014; Zhang et al. 2015; Dong et al. 2018). Von diesen Varianten ist die Rolle des G894T (Glu298Asp)-Polymorphismus bei der eNOS-Funktion gut charakterisiert. In transfizierten CHO-Zellen mit 298Asp wurde im Vergleich zu denen mit 298Glu eine verringerte Produktion von NO oder Nitritakkumulation angezeigt (Noiri et al. 2002). Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die verringerte NO-Produktion durch eine eNOS-Dysfunktion wichtig für das Fortschreiten der DKD beim Menschen ist.

Diabetische Mäuse ohne eNOS als Modell für menschliche diabetische Nephropathie

Die Etablierung zuverlässiger präklinischer Modelle, die der menschlichen DKD ähneln, ist für die Erforschung neuer Therapieoptionen von entscheidender Bedeutung. Basierend auf den Beweisen, die einen Zusammenhang zwischen eNOS-Polymorphismus und DKD belegen, haben mehrere Studien gezeigt, dass eNOS-Knock-out-Modelle von Typ-I- und Typ-II-DM zu den erfolgreichen Modellen gehören, die menschliche DKD nachahmen (Brosius et al. 2009; Azushima et al. 2018). Es wurde gezeigt, dass Streptozotocin-induzierte diabetische Mäuse ohne eNOS schwere Albuminurie, mesangiale Ausdehnung, Verdickung der glomerulären Basalmembran und arterioläre Hyalinose entwickeln, die der menschlichen DKD ähneln (Nakagawa et al. 2007). In ähnlicher Weise zeigten Typ-II-diabetische Mäuse (db/db), denen eNOS fehlte, schwere Glomerulosklerose und Albuminurie (Zhao et al. 2006).

Erhöhter TF bei diabetischen Mäusen ohne eNOS

NO hemmt die Thrombusbildung und die Thrombozytenaggregation (Walford und Loscalzo 2003). Da bei diabetischen Mäusen ohne eNOS eine glomeruläre Thrombusbildung beobachtet wurde (Nakagawa et al. 2007), ist eine beeinträchtigte eNOS-Expression wahrscheinlich mit der Zunahme der TF-abhängigen Gerinnung verbunden. Der Zusammenhang zwischen eNOS und TF bei DKD wurde in unseren früheren Berichten behandelt (Li et al. 2010; Wang et al. 2011a; Oe et al. 2016) (Abb. 2).

Eine verringerte oder fehlende eNOS-Expression erhöht die renale TF-Aktivität bei diabetischen Akita-Mäusen. Wir charakterisierten die TF-Expression bei diabetischen Akita-Mäusen (Ins2Akita/+), einem Modell des Typ-I-DM, mit verschiedenen Expressionsniveaus von eNOS (eNOS+/+, eNOS+/-). , und eNOS-/-) (Wang et al. 2011a). Wir fanden heraus, dass der Schweregrad der DKD mit einer verringerten eNOS-Expression verbunden war. Die Ausscheidung von Albumin im Urin, Glomerulosklerose und die Verringerung der glomerulären Filtrationsrate wurden in der folgenden Reihenfolge verstärkt: eNOS+/+; Ins2Akita/+ < eNOS+/-; Ins2Akita/+ < eNOS-/-; Ins2Akita/+. Interessanterweise waren die Nieren-TF-Expression und -Aktivität bei eNOS+/- erhöht; Ins2Akita/+ und eNOS-/-; Ins2Akita/+-Mäuse im Vergleich zu denen in eNOS+/+; Ins2Akita/+ Mäuse. Die glomeruläre Fibrinablagerung war auch bei eNOS+/- bemerkenswert; Ins2 Akita/+ und eNOS-/-; Ins2 Akita/+ Mäuse. Darüber hinaus korrelierte die renale Tf-mRNA-Expression mit der Schwere der Erkrankung, der Albuminausscheidung im Urin uswNierenentzündungZytokinexpression.

Eine fettreiche Ernährung und ein Mangel an eNOS erhöhen synergistisch die TF bei diabetischen Mäusen

Viele Studien haben einen Zusammenhang zwischen Fettleibigkeit und Thrombose nachgewiesen (Samad und Ruf 2013). Beispielsweise erhöht eine Hochregulierung des TLR4-NF-kB-Signalwegs unter Stoffwechselerkrankungen die TF-Spiegel (Lv et al. 2009; Owens et al. 2012; Rogero und Calder 2018). Darüber hinaus induziert gesättigtes Fettsäurepalmitat die Freisetzung von Histon H3 über ROS- und JNK-Weg-abhängige Mechanismen und extrazelluläre Histone, die die TF-Expression in Monozyten erhöhen (Shrestha et al. 2013). Unsere vorherige Studie konzentrierte sich auf den Zusammenhang zwischen Gerinnung, eNOS und Dyslipidämie und zeigte die kombinierten Auswirkungen von eNOS-Mangel und einer fettreichen Ernährung auf die TF-Expression (Li et al. 2010). In der Studie wurden eNOS-Null-Mäuse mit niedrig dosiertem STZ behandelt, um DM zu entwickeln, und erhielten eine fettreiche Diät. Der Mangel an eNOS-Expression erhöhte die Albuminausscheidung im Urin und histologische Verletzungen, die durch eine fettreiche Ernährung noch verschlimmert wurden. Die Expression und Aktivität von TF waren in den Nieren von Mäusen aufgrund einer fehlenden eNOS-Expression und einer fettreichen Ernährung synergistisch erhöht. Interessanterweise wurde durch Kolokalisierungsexperimente mit einem glomerulären Monozyten-/Makrophagen-Marker ein Anstieg des Spiegels an immunreaktivem TF nachgewiesen.

Neutralisierende Antikörper gegen TF lindern Entzündungen in diabetischen Nieren bei eNOS-Knockout-Mäusen

Eine Erhöhung der TF-abhängigen Gerinnung geht mit einer verstärkten Entzündung einher (Witkowski et al. 2016). Die Hemmung des TF-abhängigen Gerinnungssystems wurde verbessertentzündliche Erkrankungen, wie LPS-induzierte Sepsis (Pawlinski et al. 2010). Um den kausalen Zusammenhang zwischen Entzündung und TF bei DKD aufzuklären, untersuchten wir die kurzfristige Wirkung neutralisierender Antikörper gegen TF auf die Entzündung diabetischer Nieren bei Mäusen mit eNOS-Mangel (Li et al. 2010). Die Ergebnisse zeigten, dass die Verabreichung von Anti-TF-Antikörpern die renale Expression von entzündungs- und fibrosebedingten Genen wie Tnfa-, Ccl2-, Tgfb- und Col4-mRNA in Mäusenieren vier Tage nach der TF-Neutralisierung deutlich reduzierte.

Der Gerinnungs-FXa-Inhibitor lindert Nierenverletzungen bei diabetischen Mäusen ohne eNOS

Die Koagulation FXa, die sich stromabwärts von TF/VIIa befindet, trägt über den PAR-abhängigen Weg ebenfalls zur Entzündung bei. Seine Rolle bei DKD wurde in mehreren Tiermodellen nachgewiesen. Sumi et al. (2011) zeigten, dass Fondaparinux, ein FXa-Inhibitor, die Proteinspiegel im Urin, die glomeruläre Hypertrophie und die Fibrinablagerung bei db/db-Mäusen reduzierte. Die therapeutische Wirkung der FXa-Hemmung bei DKD-Mäusen ohne eNOS wurde von unserer Gruppe nachgewiesen (Oe et al. 2016). Edoxaban (50 mg/kg/Tag), ein oraler FXa-Inhibitor, wurde eNOS-/- verabreicht; Ins2Akita/+-Mäuse wurden drei Monate lang getestet, und die Ergebnisse zeigten eine Verbesserung histologischer Verletzungen, wie z. B. der Proliferation der mesangialen Matrix. Die Expressionsniveaus von Entzündungsgenen in den Nieren wurden durch Edoxaban reduziert (Tabelle 1). FXa aktiviert sowohl PAR1 als auch PAR2. Um den Mechanismus einer FXa-vermittelten Nierenschädigung aufzuklären, haben wir gezeigt, dass die entzündungshemmenden Wirkungen von FXa-Inhibitoren denen ähneln, die bei PAR2-/- Mäusen und PAR2-/- Mäusen mit FXa-Inhibitoren gefunden werden . Diese Ergebnisse legen nahe, dass FXa bei DKD wahrscheinlich eine Entzündung durch einen PAR2-abhängigen Mechanismus verursacht. Im Gegensatz dazu verbesserte Edoxaban die glomeruläre Schädigung bei eNOS+/+ nicht; Ins2Akita/+-Mäuse, was darauf hindeutet, dass die therapeutische Wirkung der FXa-Hemmung mit der eNOS-abhängigen Hyperkoagulabilität bei Mäusen mit Typ-I-Diabetes verbunden ist.

Andere Gerinnungsfaktoren bei DKD

Da Thrombin auf PAR1 abzielt, das Gefäßentzündungen vorantreibt (Chen und Dorling 2009), verschlimmert Thrombin wahrscheinlich die DKD. Es wurde jedoch nachgewiesen, dass Thrombin eine schützende oder schädliche Rolle bei der DKD-Pathogenese spielt; Niedrig dosiertes Thrombin (50 pM) verhinderte, wohingegen hoch dosiertes Thrombin (20 nM) die glukoseinduzierte Apoptose in Podozyten verschlimmerte (Wang et al. 2011b). Die Auswirkungen von Thrombininhibitoren wie Dabigatran auf diabetische Mäuse ohne eNOS sollten in Zukunft aufgeklärt werden.

Fibrinogen ist an verschiedenen Entzündungszuständen beteiligt. Interessanterweise war eine teilweise Reduzierung oder das Fehlen von Fibrinogen vorteilhaft für renale Ischämie-Reperfusionsmodelle oder obstruktive Nierenfibrose (Sörensen et al. 2011; Craciun et al. 2014). Da die glomeruläre Fibrinablagerung bei diabetischen Mäusen ohne eNOS erhöht ist (Nakagawa et al. 2007; Li et al. 2010; Wang et al. 2011a), bedarf die Aufklärung seiner Rolle bei der DKD-Pathogenese weiterer Forschung.

Expression von PAR1 und PAR2 in diabetischen Mäusen ohne eNOS

Eine erhöhte Expression von PARs ist mit einer Nierenschädigung verbunden. Wir und andere haben gezeigt, dass die Expressionsniveaus von Par1- und/oder Par2-mRNA in Tiermodellen mit diabetischer Nephropathie, Ade-9-induzierter Nierenschädigung, obstruktiver Nierenfibrose und Cisplatin-induzierter Nierenschädigung erhöht waren (Chung et al. 2013; Hayashi et al. 2016; Oe et al. 2016; Watanabe et al. 2019). Darüber hinaus waren die glomerulären PAR2-Proteinspiegel bei db/db-Mäusen, einem Modell für Typ-II-DM, erhöht (Sumi et al. 2011). Wir haben den Zusammenhang zwischen PAR-Expression und eNOS-Mangel bei diabetischen Mäusen nachgewiesen (Oe et al. 2016). Das Expressionsniveau der Par1-mRNA war in eNOS–/– signifikant höher; Ins2Akita/+ Mäuse als in eNOS−/−; Ins2Akita/+ und Nicht-DM-Mäuse. In ähnlicher Weise war die Expression von Par2 in eNOS–/– signifikant höher; Ins2Akita/+-Mäuse als bei Nicht-DM-Mäusen. Im Gegensatz dazu unterschieden sich die Par4-mRNA-Spiegel zwischen den Genotypen nicht. Ein Mangel an eNOS verschlimmert die Entzündung bei DKD (Wang et al. 2011a). Da entzündungsfördernde Zytokine Berichten zufolge die PARs erhöhen (Nystedt et al. 1996), induziert eine erhöhte Entzündung, die durch einen Mangel an eNOS verursacht wird, wahrscheinlich die renale Pars-Expression bei DKD. Insgesamt deuten die Ergebnisse unserer Studien darauf hin, dass die Expressionsniveaus von PAR1 und PAR2, ähnlich wie im Fall von TF, in diabetischen Nieren erhöht waren, wenn eNOS fehlte (Abb. 2).

PAR2-Deletion verbesserte diabetische Nierenverletzung bei Mäusen mit reduziertem eNOS

Wir und andere haben uns in früheren Studien mit der Rolle von PAR2 bei DKD befasst. Die Par2-Deletion hatte keinen Einfluss auf die glomeruläre Schädigung bei diabetischen Wildtyp-Akita-Mäusen (Ins2Akita/+) mit eNOS (Oe et al. 2016). Darüber hinaus zeigten STZ-induzierte diabetische Mäuse, denen PAR2 fehlte, im Vergleich zu diabetischen Wildtyp-Mäusen eine geringere Albuminurie, aber eine erhöhte mesangiale Expansion (Waasdorp et al. 2017). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass es in den frühen und milden Modellen der DKD keine oder nur leichte therapeutische Wirkungen der PAR2-Hemmung auf Nierenschäden gibt. Im Gegensatz dazu haben wir die Auswirkungen eines PAR2-Mangels auf DKD bei diabetischen Akita-Mäusen mit reduzierter Expression von eNOS (eNOS+/-; Ins2Akita/+) gezeigt (Oe et al. 2016). Der Mangel an PAR2 verringerte die Albuminausscheidung im Urin, die mesangiale Ausdehnung und die Dicke des GBM erheblich. Die Expressionsniveaus entzündungsfördernder und fibrosebedingter Gene, einschließlich Tnfa, Tgfb und Col4, waren in den Nieren von Mäusen ebenfalls verringert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass PAR2 nicht im Frühstadium, sondern bei der relativ fortgeschrittenen diabetischen glomerulären Schädigung, die durch einen eNOS-Mangel verursacht wird, pathogen ist (Tabelle 1).

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