Vergleich der einmaligen und wiederholten Gabe von entzündungshemmenden mesenchymalen Stromazellen der menschlichen Nabelschnur in einem Mausmodell der polymikrobiellen Sepsis

Zusammenfassung

Mesenchymale Stromazellen (MSCs) lindern präklinische Sepsis und Sepsis-assoziierte akute Nierenschäden (SAAKI), klinische Studien mit MSCs in Einzeldosis haben jedoch keine robuste Wirksamkeit gezeigt. Diese Studie untersuchte die immunmodulatorischen Wirkungen eines neuartigen MSC-Produkts (CD362-ausgewählte MSCs aus menschlicher Nabelschnur [hUC-MSCs]) in Endotoxämie- und polymikrobiellen Sepsismodellen bei Mäusen. Zunächst erhielten Mäuse intraperitoneales (ip) Lipopolysaccharid (LPS), gefolgt von einzelnen ip-Dosen von hUC-MSCs oder Vehikel. Als nächstes wurden die Mäuse einer Blinddarmligatur und -punktion (CLP) unterzogen, gefolgt von intravenösen (iv) Dosen von hUC-MSCs nach 4 Stunden oder 4 und 28 Stunden. Zu den Analysen gehörten Serum-/Plasmatests biochemischer Indizes, Entzündungsmediatoren und des AKI-Biomarkers NGAL; Mehrfarben-Durchflusszytometrie von Peritonealmakrophagen (LPS) und intrarenalen Immunzellsubpopulationen (CLP) sowie Histologie/Immunhistochemie der Niere (CLP). 72 Stunden nach der LPS-Injektion reduzierten hUC-MSCs die Entzündungsmediatoren im Serum und das Verhältnis von Peritonealmakrophagen M1/M2. Wiederholte, aber nicht einzelne hUC-MSC-Dosen, die 48 Stunden nach CLP verabreicht wurden, führten zu niedrigeren Serumkonzentrationen von Entzündungsmediatoren, niedrigerem Plasma-NGAL und einer Umkehrung der sepsisbedingten Depletion von intrarenalen T-Zellen und myeloischen Zellsubpopulationen. Die hierarchische Clusteranalyse aller 48-h-Serum-/Plasmaanalyten zeigte eine teilweise Co-Clusterung von hUC-MSC-CLP-Tieren mit wiederholter Gabe und einer Scheingruppe, ergab jedoch keine eindeutige Signatur des Ansprechens auf die Therapie. Es wurde der Schluss gezogen, dass wiederholte Dosen von CD362-selektierten hUC-MSCs erforderlich sind, um systemische und lokale Immun-/Entzündungsereignisse bei polymikrobieller Sepsis und SA-AKI zu modulieren. Die interindividuelle Variabilität und das Fehlen einer Wirkung der Einzeldosis-MSC-Verabreichung im CLP-Modell stimmen mit den bisherigen Beobachtungen aus frühen klinischen Studien überein.

Schlüsselwörter

Akute Nierenschädigung · Mesenchymale Stromazelle · Regenerative Medizin · Sepsis · Entzündung · Zelltherapie

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Einführung

Sepsis ist durch eine lebensbedrohliche Organfunktionsstörung aufgrund einer fehlregulierten Reaktion des Wirts auf die Infektion gekennzeichnet, die durch bakterielle, pilzliche, virale und parasitäre Krankheitserreger verursacht wird [1]. Jedes Jahr sind weltweit fast 50 Millionen Menschen von einer Sepsis betroffen, die häufig zu schwerwiegenden systemischen Folgen und Organschäden führt, einschließlich einer akuten Nierenschädigung (AKI), was etwa 11 Millionen Todesfälle zur Folge hat [2, 3]. Mesenchymale Stromazellen (MSC) sind multipotente Zellen mit umfangreichen immunmodulatorischen Eigenschaften, die aus verschiedenen Geweben isoliert werden können [4]. Es ist mittlerweile allgemein anerkannt, dass MSC eine potenziell krankheitsmodulierende Therapie für Sepsis und Sepsis-assoziiertes AKI (SA-AKI) bietet [5, 6]. Mehrere aktuelle Studien mit Blinddarmligatur und -punktion (CLP), Lipopolysaccharid (LPS) oder fäkaler Peritonitis bei Mäusen und Ratten haben gezeigt, dass die systemische Verabreichung von MSC das Potenzial hat, Entzündungen zu reduzieren, bakteriellen Infektionen entgegenzuwirken und die Reparatur von verletztem Gewebe zu verbessern Sepsis [7–11], einschließlich SA-AKI, [10, 12–15] durch Modulation des Gleichgewichts zwischen entzündungsfördernden und entzündungshemmenden Zuständen.

Eine kürzlich durchgeführte Studie an gesunden Erwachsenen bestätigte, dass eine vorbeugende intravenöse (iv) Behandlung mit 4 × 106 MSC/kg frühe immunmodulatorische Effekte auf die Reaktion des Wirts auf LPS hervorruft [16]. Darüber hinaus zeigte die Verabreichung allogener MSC an Patienten mit septischem Schock (NCT01849237, NCT02421484 und NCT02328612) und sepsisbedingtem akutem Atemnotsyndrom (NCT01775774) in klinischen Phase-1-Studien eine gute Sicherheit und Verträglichkeit [16–19]. Trotz dieser ermutigenden Ergebnisse haben Galstyan et al. berichteten außerdem, dass eine Einzeldosis iv MSC den Tod aufgrund einer sepsisbedingten Organfunktionsstörung nicht verhindern konnte, was die Möglichkeit erhöht, dass zusätzliche Dosen erforderlich sein könnten, um einen signifikanten klinischen Nutzen zu erzielen [17]. Eine kürzlich durchgeführte Nicht-Sepsis-Phase-2-Studie (NCT01602328), in der Einzeldosen allogener MSC intravortikal an Patienten mit sterilem AKI nach einer kardiopulmonalen Bypass-Operation verabreicht wurden, konnte trotz vielversprechender Aussichten ebenfalls keinen positiven Effekt auf Organfunktionsstörungen und das Patientenüberleben nachweisen präklinische und Phase-1-Studienergebnisse [20]. Ob eine wiederholte Gabe im frühen Verlauf einer Sepsis und anderer akuter Entzündungssyndrome die krankheitsmodulierenden Wirkungen von MSC verstärken oder verlängern könnte, ist auf präklinischer und translationaler Ebene noch relativ wenig untersucht. Darüber hinaus schränkt die unvollständige Kenntnis des Wirkmechanismus, der Dosisreaktion und der optimalen klinischen Indizes für die MSC-Verabreichung bei Sepsis das Potenzial für die Gestaltung erfolgreicher Studien ein [5, 21, 22].

In der aktuellen Studie führten wir eine präklinische Untersuchung der entzündungshemmenden Wirkung von CD362-ausgewählten menschlichen Nabelschnur-MSC (hUC-MSC) in Mausmodellen der Sepsis durch. Dieses durch Oberflächenmarker selektierte hUC-MSC ist ein neuartiges therapeutisches Produkt, das in Rattenmodellen für bakterielle Lungenentzündung und Sepsis Wirksamkeitsnachweise erbracht hat, wenn es früh nach Krankheitsbeginn verabreicht wurde [23, 24]. Als klinisches Prüfpräparat (IMP) durchläuft hUC-MSC derzeit eine Phase-I/II-Studie bei Patienten mit mittelschwerem bis schwerem akutem Atemnotsyndrom (ARDS) aufgrund von COVID-19 (NCT03042143) und bei mehreren entzündliche Autoimmunerkrankungen (POLARISIEREN). Unser Ziel war es, das entzündungshemmende Potenzial von Einzeldosen von hUC-MSC in Mausmodellen mit LPS- und CLP-induzierter Endotoxämie/polymikrobieller Sepsis zu demonstrieren [25, 26] und im letzteren Fall zu bestimmen, ob eine zweite Verabreichung von hUC-MSC während der Behandlung erforderlich ist Der frühe Krankheitsverlauf führte zu größeren oder häufigeren positiven Auswirkungen auf systemische Entzündungen und organspezifische Verletzungen, beispielhaft dargestellt durch SA-AKI.

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Materialien & Methoden

1. Zellen

Anti-CD362 plus -selektierte hUC-MSC wurden aus ethisch einwandfreiem menschlichem Nabelschnurgewebe kultiviert, das von Tissue Solutions Ltd. (Glasgow, UK) bezogen wurde. Primäre Isolierungs- und Expansionskulturen von CD362 plus hUC-MSC wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [19, 23, 27]. Kryokonservierte Fläschchen (1 × 107 in 1 ml) mit anti-CD362 plus-selektiertem hUC-MSC wurden aufgetaut und in 9 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) überführt. Nach der Lebend/Tot-Analyse entweder mit Trypanblau-Farbstoff oder einem automatischen Zellzähler (NucleoCounter® NC-200™, Chemometec A/S, Dänemark) wurde die erforderliche Anzahl an Zellen durch 5-minütige Zentrifugation bei 400 × g pelletiert Die Zellen wurden in 100 μl steriler Kochsalzlösung zur intraperitonealen (ip) oder iv-Injektion resuspendiert.

2. Tierversuche

Alle Tierversuche wurden unter einer Lizenz (Nr. 255/17) der Ethikkommission für Tierversuche der Universität Barcelona und unter Genehmigung (AE19125/P082 und AE19125/P066) der Health Products Regulatory Authority, Irland, durchgeführt und genehmigt vom NUI Galway Animal Care Research Ethics Committee. Alle Eingriffe wurden in lizenzierten Tierhaltungseinrichtungen an der NUI Galway und der Universität Barcelona durchgeführt.

Für das LPS-Modell der Endotoxämie wurden 10-12 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse von Charles River Ltd., Kent, UK verwendet. Mäusen wurden 5 μg/g LPS (LPS 0111:B4, Katalog-Nr. L2630, Sigma Aldrich, UK) in 100 μl steriler Kochsalzlösung ip injiziert. Die Mäuse wurden während der Studie in Gruppen von 3-5 Mäusen/Käfig in individuell belüfteten Käfigen gehalten. Einzelne ip-Injektionen von 2,5 × 105 hUC-MSC oder gleichen Vehikelvolumina (sterile Kochsalzlösung) wurden 4 Stunden nach den LPS-Injektionen verabreicht. Die Tiere wurden bis zum Ende der Studie alle 4 Stunden mithilfe eines Belastungsbewertungsblatts und Unterstützungsmaßnahmen gemäß einem festgelegten Protokoll überwacht. Die humane Euthanasie wurde am definierten Versuchsendpunkt oder früher durchgeführt, wenn die Tiere den vordefinierten Schweregradschwellenwert überschritten. Zum Zeitpunkt der Euthanasie wurden peritoneale Exsudate für die Durchflusszytometrie-Analyse gesammelt, indem 5 ml steriles PBS vorsichtig in die Bauchhöhle hinein und aus dieser heraus gefischt wurden.

Die Blinddarmligatur und -punktion (CLP) wurde an {{0}} Wochen alten, männlichen C57BL/6-Mäusen (Charles River Ltd., UK) durchgeführt. Die Mäuse erhielten Buprenorphin {{1{{20}}}},1 mg/kg (Richter Pharma AG, Österreich) subkutan 25-30 Minuten vor dem Eingriff und wurden mit 1,{{8 }} Prozent Isofluran (mit einem O2-Fluss von 0,5 l/min) an der NUI Galway oder mit Anesketin (100 mg/ml; Dechra Veterinary Products SLU, Spanien) und Rampun (20 mg/ml; Bayer, Deutschland) an der Universität Barcelona. Die untere Hälfte des Bauches wurde rasiert und mit 4-prozentigem Chlorhexidin oder Povidon-Jod gereinigt und 1 cm vertikal entlang der Mittellinie eingeschnitten. Der Blinddarm wurde nach außen verlegt und die distalen 50 Prozent wurden mit 4,0-M-Nähten abgebunden. Blinddarmmaterial wurde durch eine „Durch-und-Durch“-Punktion mit einer 21--Nadel freigesetzt und ein Tropfen Stuhlmaterial wurde ausgeschieden, bevor der Blinddarm wieder in die Bauchhöhle eingesetzt und der Muskel und die Haut verschlossen wurden. Scheinoperierte Mäuse wurden einem identischen Eingriff unterzogen, einschließlich der Öffnung des Peritoneums und der Freilegung des Darms, jedoch ohne Unterbindung und Perforation des Blinddarms. Mäuse erhielten vor dem Wundverschluss 0,5 ml Gelofusin (Braun Melsungen AG, Deutschland) durch ip-Instillation. Die postoperative Unterstützung bestand aus verdünntem Buprenorphin, das alle 8-12 Stunden bis zu den festgelegten Endpunkten (48 oder 72 Stunden für einzelne Experimente) subkutan (sc) verabreicht wurde. Die Verabreichung von 1 × 106 hUC-MSC oder äquivalenten Vehikelvolumina (sterile Kochsalzlösung) erfolgte iv über die Schwanzvene 4 Stunden oder 4 und 28 Stunden nach CLP. Regelmäßige Überwachung und Unterstützung wurden gemäß einem ethisch anerkannten Protokoll durchgeführt. Die humane Euthanasie wurde am definierten Versuchsendpunkt oder früher durchgeführt, wenn die Tiere einen vordefinierten Schweregrad-Score-Schwellenwert überschritten.

Die Zelldosen für die beiden für die Studie verwendeten Tiermodelle wurden auf der Grundlage früherer Berichte über entzündungshemmende Wirkungen menschlicher MSC in ähnlichen Modellen ausgewählt [9, 13, 14, 28, 29]. Die Gruppengrößen für die LPS-Studie wurden empirisch auf der Grundlage relevanter früherer Berichte für dieses Modell ausgewählt (30, 31). Die Gruppengrößen für die CLP-Studie wurden für einen primären Endpunkt von Plasma-NGAL 24 Stunden nach der Operation bestimmt. Unter Verwendung von Daten aus einem Pilotversuch wurde eine Stichprobengröße von 9 Tieren pro Gruppe berechnet, um eine Aussagekraft von 90 Prozent zu liefern, unter der Annahme eines Signifikanzniveaus von 5 Prozent und eines zweiseitigen Tests (http://www.3rs-reduction.co.uk/html). /6__power_and_sample_size.html). Zur Auswahl der endgültigen Gruppengröße von n=10 wurde eine erwartete Fluktuationsrate von 10 Prozent angewendet.

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3. Blutentnahme und Gewebebeschaffung

Venöse Blutproben mit einem maximalen Volumen von 20 μl wurden intermittierend aus Schwanz- und Gesichtsvenen durch eine aseptische Technik unter Verwendung von Nadeln der Stärke 25-21 entnommen und in Heparin (VWR International, Dublin, Irland) enthaltenden Röhrchen gesammelt. Zum Zeitpunkt der Euthanasie wurde mittels Herzpunktion eine Blutprobe im Endstadium entnommen. Das Serum wurde in Mikroröhrchen mit Serumgel und Gerinnungsaktivator (Sarstedt, Wexford, Irland) gesammelt. Plasma- und Serumproben wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 10,000×g hergestellt. Serumproben wurden bei –80 Grad gelagert und anschließend von NationWide Laboratories (Lancashire, UK) auf biochemische Parameter analysiert. Milz, Lunge, Nieren und Leber wurden unmittelbar nach der Euthanasie präpariert.

4. Immunoassays

Die Konzentration von Plasma-Neutrophilen-Gelatinase-assoziiertem Lipocalin (NGAL) wurde mit dem Maus-Lipocalin-2/NGAL Duo-Set ELISA Development Kit (R&D Systems, Minneapolis, MI, USA) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll quantifiziert (Einzelheiten in den ergänzenden Methoden). ). Zur Multiplex-Quantifizierung von Zytokinen und Chemokinen im Serum wurde der Bio-Plex Pro Maus-Zytokin-Standard-23-Plex-Assay (Bio-Rad, Accuscience) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Proben wurden auf einem Bioplex 200-Multiplex-ELISA-System (BioRad, Accuscience) analysiert.

5. Semiquantitative Bewertung von Nierengewebeschnitten

Gefärbte Abschnitte der Niere wurden blind durch Lichtmikroskopie bei 40-facher Vergrößerung unter Verwendung eines Olympus BX43-Hellfeldmikroskops (Olympus, Center Valley, PA) und mit der IS TCapture-Software (Tucsen Photonics Co., Fujian, China) analysiert. Für jede Niere wurden zwanzig nicht überlappende Felder eines gefärbten Abschnitts erfasst und der positiv gefärbte Bereich wurde von einem verblindeten Beobachter hinsichtlich (A) tubulärer Dilatation, Zylinder und Nekrose (PAS) und (B) NGAL-Expression bewertet [32]. Die Bewertung erfolgte auf einer semiquantitativen Bewertungsskala 0-4 (Einzelheiten in den ergänzenden Methoden). Für jede Niere wurden Durchschnittswerte berechnet und die Endergebnisse als Gruppenmittelwerte ± SD ausgedrückt.

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Diskussion

Sepsis und ihre häufige Komplikation SA-AKI stellen aufgrund des anhaltenden Mangels an wirksamen Behandlungen und enttäuschenden Ergebnissen aus klinischen Studien im Spätstadium eine große Herausforderung für die öffentliche Gesundheit dar [2, 3]. Mehrere aktuelle präklinische Studien haben Ergebnisse berichtet, die darauf hinweisen, dass MSC aus verschiedenen Quellen und ihre Produkte positive Auswirkungen auf die Schwere der Erkrankung und das Überleben in Modellen für Sepsis und AKI haben [7, 8, 11–15]. Dennoch ist der klinische Nutzen von MSC bei Sepsis und SA-AKI noch nicht bewiesen, da nur begrenzte Daten von menschlichen Patienten verfügbar sind [5]. Bislang haben klinische Studien dokumentiert, dass eine iv-MSC-Einzeldosis-Infusion bei LPS-Verabreichung, Sepsis und ARDS sicher und machbar ist [16–19], aber die Sterblichkeit durch Sepsis-bedingtes Organversagen nicht deutlich verringert [17] . In dieser Studie verglichen wir die Auswirkungen der iv-Verabreichung einer Einzel- und Doppeldosis eines bestimmten humanen MSC-Therapeutikums (CD362- ausgewähltes hUC-MSC) im Maus-CLP-Modell der polymikrobiellen Sepsis. Zunächst bestätigten wir im Einklang mit kürzlich veröffentlichten Ergebnissen für dasselbe MSC-Produkt in Rattenmodellen für bakterielle Lungenentzündung und Sepsis [23, 24] das Potenzial einer frühen Verabreichung von hUC-MSC zur Modulation LPS-induzierter systemischer Entzündungen bei Mäusen. In einem Maus-CLP-Modell der polymikrobiellen Sepsis zeigten unsere Ergebnisse jedoch, dass iv verabreichte Einzeldosen von hUC-MSC 4 Stunden nach der Auslösung einer fäkalen Peritonitis keine eindeutige positive Wirkung auf systemische Entzündungen oder organspezifische (Nieren-)Gewebeschäden hatten. Im Gegensatz dazu führte die Verabreichung einer zweiten iv-Dosis hUC-MSC 24 Stunden später zu mehreren Anzeichen einer gelinderten Entzündung und Nierenschädigung 48 Stunden nach Beginn der Sepsis. Dennoch wurde kein Überlebensvorteil für die Doppeldosis-Therapie nachgewiesen. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Durchführung von In-vivo-Studien zu MSC-Therapeutika in mehreren Modellen und der Meldung sowohl positiver als auch negativer präklinischer Ergebnisse, um die klinische Umsetzung und das Studiendesign besser zu informieren. Zusammenfassend liefern unsere Ergebnisse auch Belege dafür, dass der begrenzte oder fehlende Nutzen einer frühen Einzeldosistherapie mit entzündungshemmenden MSC-Produkten in Sepsis-Studien durch wiederholte Gabe zumindest teilweise ausgeglichen werden kann.

Im Maus-LPS-Modell modulierte eine einzelne, frühe Dosis von hUCMSC die systemischen Spiegel sowohl angeborener als auch adaptiver Entzündungsmediatoren für mindestens 72 Stunden, allerdings ohne offensichtliche Auswirkung auf den Schweregrad und das Überleben. Die phänotypische Analyse peritonealer Makrophagen lieferte Hinweise darauf, dass die Verabreichung von hUC-MSC mit einem vorhergesagten lokalen immunmodulatorischen Effekt verbunden war – einer Verschiebung der Makrophagen in Richtung M2-Polarisation, die mit der Auflösung entzündlicher Verletzungen und der Förderung der Gewebereparatur in Verbindung gebracht wurde [29, 35] und wird wahrscheinlich durch MSC-Interaktion mit residenten myeloischen Zellen vermittelt [36]. In der Tat wurde in neueren Studien berichtet, dass die therapeutische Immunmodulation durch MSC bei Sepsis möglicherweise von deren Phagozytose durch myeloische Zellen (mononukleäre Phagozyten) abhängt, die dann einer alternativen Aktivierung unterliegen, was zur Produktion von IL-10 und anderen parakrinen Anti-Antikörper-Zellen führt. Entzündungsmediatoren [7, 27, 37]. Obwohl es von Interesse gewesen wäre, festzustellen, ob die Vorteile einer solchen Immunmodulation durch wiederholte Dosen von hUC-MSCs nach der LPS-Verabreichung verstärkt werden, kamen wir zu dem Schluss, dass ein experimentelles Modell, das die sich entwickelnde Sepsis besser widerspiegelt, eine größere klinische Relevanz hätte. Nachdem die biologische Aktivität von hUC-MSC bei Mäusen unter LPS-Verabreichung bestätigt wurde, wurde das Maus-CLP-Modell zur Charakterisierung entzündungshemmender Wirkungen im Zusammenhang mit wiederholter Gabe und Quantifizierung nierenspezifischer Wirkungen von hUC-MSC bei polymikrobieller Sepsis verwendet und SA-AKI. In unseren Händen war dieses Modell mit mittelschwerer Sepsis (ungefähr 70 Prozent, 50 Prozent und 40 Prozent Überleben nach 48, 96 bzw. 168 Stunden bei unbehandelten Tieren) ohne offensichtliches Leber- und Nierenversagen verbunden. Unsere Beobachtungen für das Modell, einschließlich Sterblichkeitsraten und Trends bei Serumleberparametern und Albumin, stimmen mit der sehr umfassenden Profilierung von Maus-CLP überein, die von Li et al. berichtet wurde. [38], das auch eine verringerte Körpertemperatur, einen verringerten Blutdruck und eine verringerte Herzfrequenz während der ersten 48 Stunden nach CLP dokumentiert. Interessanterweise haben Li et al. dokumentierten einen Anstieg des Serumkreatinins und des Blutharnstoffstickstoffs 8 und 16 Stunden nach CLP. Ihre Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese renalen funktionellen Biomarker 48 Stunden lang auf normale Werte (oder unter den Normalwert) gesunken waren – was möglicherweise auf die sich entwickelnden Auswirkungen eines veränderten Stoffwechsels/einer veränderten Muskelmasse zurückzuführen ist Diese Biomarker werden im weiteren Verlauf des Modells untersucht [38]. In Übereinstimmung damit zeigte die Analyse von Serum/Plasma und Nierengewebe nach 48 Stunden eine signifikante systemische Entzündung und Nierenschädigungsreaktion ohne offensichtliche Anzeichen einer ischämischen Schädigung/Nekrose. Diese letztgenannten Analysen lieferten den klarsten Beweis für eine modulierende Wirkung des hUCMSC-Regimes mit doppelter Dosis auf den Schweregrad der polymikrobiellen Sepsis im Vergleich zur Verabreichung mit einer Einzeldosis, die im Gegensatz zu kürzlich in einem Ratten-CLP-Modell [24] berichteten Ergebnissen nicht unterscheidbar war aus der mit Kochsalzlösung behandelten CLP-Gruppe über alle untersuchten Indizes hinweg. Insbesondere der klinisch relevante AKI-Biomarker NGAL erwies sich in diesem Modell als wertvolles Unterscheidungsmerkmal für den Schweregrad der Sepsis und den Behandlungseffekt und könnte ein wichtiger Biomarker für zukünftige klinische Studien zu Zelltherapien bei Sepsis und SA-AKI sein [33, 39]. ].

Unsere Ergebnisse zur Auswirkung von iv MSC auf das Überleben in Sepsis-Kleintiermodellen stehen im Gegensatz zu einigen anderen Berichten [28, 40], stimmen jedoch insbesondere mit den beobachteten Auswirkungen allogener MSCs in klinischen Studien am Menschen überein [5, 16– 18, 41]. In diesem Zusammenhang möchten wir die potenzielle Rolle des Publikationsbias – insbesondere der selektiven Veröffentlichung von Ergebnissen, die positive Effekte widerspiegeln – als wichtigen Treiber unrealistischer Erwartungen an die Wirksamkeit von Einzeldosis-MSC-Therapien und anderen neuartigen Therapien in den frühesten Stadien der klinischen Entwicklung hervorheben Übersetzung [42]. Tatsächlich stellten Sun et al. in einer aktuellen Metaanalyse von 29 Tierstudien zur Wirksamkeit von MSC-Therapien bei Sepsis in diesen präklinischen Berichten eine erhebliche Publikationsverzerrung und mangelnde Klarheit hinsichtlich der optimalen Zelldosis fest [43]. Dennoch berichten wir auch über eindeutig positive Ergebnisse, die dazu beitragen können, die Translationsziele für UC-MSCs bei Sepsis oder anderen systemischen und organspezifischen entzündlichen Erkrankungen wie AKI, Leber- oder Atemwegserkrankungen voranzutreiben. In beiden Modellen deuten diese molekularen Veränderungen auf komplexe Wechselwirkungen von hUC-MSC mit der Th1- und Th2-Immunantwort hin. Solche Auswirkungen auf die Aktivierung von T-Effektorzellen und das Gleichgewicht des T-Helfer-Phänotyps könnten eine Schlüsselrolle bei der Modulation der akuten Phase der Sepsis spielen, da eine wahllose, fehlregulierte Aktivierung von Immuneffektoren, die zu hohen Mengen an zirkulierenden Zytokinen führt, zum Multiorganversagen beiträgt [44] und im Fall von T-Zellen kann es zu einer weit verbreiteten Apoptose und anschließenden Immunschwächen kommen [45]. Es wurde auch gezeigt, dass die Verabreichung von MSC lokalisierte Gewebeentzündungen verringern kann, indem es die Zytokinhomöostase reguliert und den Transport von Immunzellen in Organe verringert [44]. Dementsprechend ergab unsere quantitative Analyse einer Reihe intrarenaler Immunzellpopulationen 48 Stunden nach der CLP-induzierten Sepsis sepsisbedingte Defizite, die sowohl angeborene als auch adaptive Effektoren betreffen, einschließlich des Verlusts doppelt negativer T-Zellen, über den kürzlich berichtet wurde früh auf AKI reagieren [46]. Bemerkenswerterweise gab es bei mit doppelter, aber nicht mit Einzeldosis hUC-MSC behandelten Tieren Hinweise auf eine Umkehrung der intrarenalen Immunzelldepletion. Da ähnliche Trends auch in der Lunge und der Milz beobachtet wurden, deuten unsere Ergebnisse auf das Potenzial einer wiederholten iv-Gabe von MSC hin, die Depletion von Immunzellen aus nicht-lymphoiden und lymphoiden Organen weitgehend zu verbessern – ein Aspekt der Sepsis, der mit späterer Mortalität in Verbindung gebracht wird Sekundärinfektion [47, 48]. Basierend auf der zusätzlichen Beobachtung eines erhöhten Zelltods bei intrarenalen CD45-Plus-Zellen bei unbehandelten CLP-Tieren ist es plausibel, dass dies die direkten oder indirekten Auswirkungen von hUC-MSC auf die Verringerung der mitochondrialen Dysfunktion und der proapoptotischen Signalübertragung widerspiegelt [49–51]. Dennoch sind gezieltere Experimente erforderlich, um die Mechanismen vollständig aufzuklären, durch die die systemische MSC-Verabreichung die Anzahl myeloischer und/oder lymphoider Zellen bei Sepsis erhält, und um festzustellen, ob sie therapeutisch genutzt werden können.

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Angesichts der inhärenten Variabilität, die wir und andere bei einzelnen Ergebnissen für das Maus-CLP-Modell beobachten, stellten wir die Hypothese auf, dass eine hierarchische Clusteranalyse quantitativer Messwerte für eine Reihe zirkulierender entzündungsbedingter Mediatoren nach 48 Stunden dazu beitragen würde, eine eindeutige „Responder-Signatur“ besser zu definieren. unter MSC-behandelten Tieren. Obwohl sich 60 Prozent der Gruppen mit doppelter Dosis in einem Muster gruppierten, das sie von der Mehrheit der Gruppen mit Einzeldosis und unbehandelten Medikamenten unterschied und näher an der Scheingruppe lag, konnte kein sehr klares Multianalytprofil der Krankheitsmodulation identifiziert werden. Ein Ansatz der Hauptkomponentenanalyse (PCA) ergab eine ähnliche Schlussfolgerung (Daten nicht gezeigt). Es sollte berücksichtigt werden, dass Daten von Tieren, die nicht bis zu 48 Stunden überlebten, nicht erfasst werden konnten, und es ist möglich, dass Analysen zu einem oder mehreren früheren Zeitpunkten eine deutlichere Unterscheidung zwischen Respondern und Non-Respondern liefern könnten. Dennoch unterstreicht diese Analyse die Komplexität der interindividuellen Variation, die Tiermodellen für Sepsis und Zelltherapien innewohnt, selbst wenn die Prinzipien einer guten experimentellen Gestaltung genau beachtet werden [52, 53], und die ähnliche Herausforderungen widerspiegelt, denen man sich bei der klinischen Anwendung von gegenübersieht neuartige Therapien gegen Sepsis [18, 20, 41, 54, 55].

Einige Einschränkungen der Studie sollten anerkannt werden. Zunächst haben wir uns auf die Untersuchung der In-vivo-Wirkungen von CD{0}}ausgewähltem hUC-MSC konzentriert, da dieses Zellprodukt derzeit in klinischen Studien für andere entzündungsbedingte Krankheiten, einschließlich COVID{3}}assoziiertem ARDS, getestet wird. Dieses Studiendesign verhinderte, dass weitere Einblicke in die vergleichenden Wirkungen des getesteten Zellprodukts bei Sepsis und SA-AKI mit denen von unselektiertem hUC-MSC oder mit MSC aus Knochenmark oder anderen Geweben gewonnen wurden. Zweitens ist es nicht möglich zu bestimmen, ob die mehrfache Verabreichung höherer oder niedrigerer Zellzahlen einen größeren Nutzen bringt, da die verwendeten Zelldosen auf der Grundlage früherer Studien zur entzündungshemmenden Wirkung von menschlichem MSC bei Mäusen ausgewählt wurden. Da schließlich die Gruppengrößen für die CLP-Modellexperimente darauf ausgelegt waren, die Auswirkungen von hUC-MSC auf einen systemischen entzündlichen Biomarker für den Schweregrad von Sepsis/SA-AKI zu untersuchen, wäre es möglich, dass größere Gruppengrößen die Auswirkungen wiederholter Dosen klarer definiert hätten Überleben. Während diese Probleme die Notwendigkeit aufeinanderfolgender präklinischer Experimente weiter unterstreichen, die sich so genau wie möglich an den Schlüsselparametern halten, die für ein optimales klinisches Studiendesign erforderlich sind, unterstützen die hier präsentierten Ergebnisse einen anhaltenden Fokus auf Mehrfachdosis-Therapien von entzündungshemmendem MSC bei Sepsis und SA-AKI.

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Barbara Fazekas1 · Senthilkumar Alagesan2 · Luke Watson2 · Olivia Ng1,2 · Callum M. Conroy1,2 · Cristina Català3 · Maria Velascode Andres3 · Neema Negi1 · Jared Q. Gerlach4 · Sean O. Hynes5,6 · Francisco Lozano3,7,8 · Stephen J. Elliman2 · Matthew D. Grifn1,9,10

1 Regenerative Medicine Institute am CÚRAM Centre for Research in Medical Devices, School of Medicine, National University of Ireland Galway, Galway, Irland

2 Orbsen Therapeutics Ltd., Galway, Irland

3 Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer, Barcelona, ​​Spanien

4 Glycoscience Group, National Centre for Biomedical Engineering Science, National University of Ireland Galway, Galway, Irland

5 Fachrichtung Pathologie, School of Medicine, National University of Ireland Galway, Galway, Irland

6 Abteilung für Histopathologie, Galway University Hospitals, Galway, Irland

7 Servei d'Immunologia, Hospital Clínic de Barcelona, ​​Barcelona, ​​Spanien

8 Department de Biomedicina, Universitat de Barcelona, ​​Barcelona, ​​Spanien

9 Abteilung für Nephrologie, Saolta University Health Care Group, Galway University Hospitals, Galway, Irland

10 National University of Ireland Galway, REMEDI, Biomedizinische Wissenschaften, Corrib Village, Dangan, Galway H91 TK33, Irland