Die Komplementaktivität wird bei der C3-Glomerulopathie durch IgG-Faktor-H-Fusionsproteine ​​mit und ohne Properdin-Targeting-Domänen reguliert

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Alyssa C. Gilmore, Yuchun Zhang, H. Terence Cook', Deborah P. Lavin, Suresh Katti, YiWang2, Krista K. Johnson, SungKwon Kim² und Matthew C. Pickering

'Zentrum für Entzündungskrankheiten, Imperial College London, UK; und² Alexion Pharmaceuticals, New Haven, Connecticut, USA

C3 Glomerulopathieist durch die Akkumulation von Komplement C3 in den Glomeruli gekennzeichnet. Zu den Ursachen zählen unter anderem Anomalien des Faktors H, des wichtigsten negativen Regulators des alternativen Komplementwegs. Faktor-H-defiziente (Cfh-/-) Mäuse entwickeln C3Glomerulopathiezusammen mit einer Verringerung der Plasma-C3-Spiegel. Unter Verwendung dieses Modells bewerteten wir die Wirksamkeit von zwei Fusionsproteinen, die die regulatorischen Domänen des alternativen Faktor-H-Wegs (FH1-5) enthalten.

entweder mit einem nicht zielgerichteten Maus-Immunglobulin (IgG-FH1-5) oder einem Anti-Maus-Properdin-Antikörper (Anti-P-FH1-5) verbunden. Beide Proteine ​​erhöhten Plasma-C3 und reduzierten die glomeruläre C3-Ablagerung in gleichem Maße, was darauf hindeutet, dass Properdin-Targeting nicht erforderlich war, damit FH1-5 die C3-Aktivierung weder im Plasma noch in den Glomeruli veränderte. Nach der Verabreichung von IgG-FH1-5 korrelierten die Plasma-C3-Spiegel zeitlich mit Änderungen der Faktor-B-Spiegel, während die Plasma-C5-Spiegel mit Änderungen der Plasma-Properdin-Spiegel korrelierten. Bemerkenswert ist die Erhöhung des Plasmas

Die C5- und Properdin-Spiegel hielten länger an als die Erhöhungen von C3 und Faktor B. Bei Cfh-/--Mäusen reduzierte IgG-FH1-5 die Nierenschädigung während einer beschleunigten nephrotoxischen Nephritis im Serum. Somit zeigen unsere Daten, dass IgG-FH1-5 die zirkulierende Aktivität des alternativen Stoffwechselwegs wiederherstellte und die glomeruläre C3-Ablagerung in Cfh-/--Mäusen reduzierte und dass Plasmaproperdinspiegel ein empfindlicher Marker der C5-Konvertaseaktivität bei Faktor-H-Mangel sind. Das Immunglobulin-konjugierte FH1-5-Protein kann aufgrund seiner vergleichsweise langen Plasmahalbwertszeit eine potenzielle Therapie für C3 seinGlomerulopathie.

Cistanche kann bei Glomerulopathie helfen

Übersetzungserklärung

C3 Glomerulopathie(C3G) ist eine Nierenerkrankung, die durch eine abnorme Akkumulation von Komplement C3 in den Glomeruli und eine glomeruläre Schädigung gekennzeichnet ist. Es ist auf eine unkontrollierte Aktivierung des alternativen Komplementweges zurückzuführen. Fusionsproteine, bestehend aus funktionellen Domänen des alternativen Pathway-Regulators Faktor H (FH), verbunden mit einem Antikörper, stellten die Komplementregulation wieder her und reduzierten glomeruläres C3 in einem C3G-Mausmodell. Die nicht zielgerichtete Antikörperkonjugation führte zu einer vergleichsweise langen Halbwertszeit des Fusionsproteins im Plasma, und dieses oder ähnliche Konjugationsverfahren könnten verwendet werden, um die FH-Funktion bei der Therapie von C3G zu steigern.

C3 Glomerulopathie(C3G) ist eine komplementvermittelte Nierenerkrankung, die durch abnorme C3-Mengen in den Glomeruli gekennzeichnet ist.1 Sie kann zu Nierenversagen fortschreiten und hat keine endgültige Behandlung.2 C3G ist mit einer abnormen Aktivierung des alternativen Komplementwegs (AP) verbunden. Die AP-Aktivierung führt zur Produktion von C3bBb (C3-Konvertase), einem Enzym, das C3 spaltet. Nach der Zugabe eines weiteren C3b-Moleküls kann der resultierende C3bBbC3b-Komplex (C5-Konvertase) das Komplement C5 spalten. Unkontrolliert

Die AP-Aktivierung in C3G kann mit einer Verringerung von zirkulierendem C3, C5, Faktor B (FB) und Properdin verbunden sein. Ursachen für eine unkontrollierte AP-Aktivierung sind der Verlust von Funktionsänderungen in Komplementregulatoren und der Gewinn von Funktionsänderungen in Komplementaktivatoren.2 Der wichtigste negative AP-Regulator ist Faktor H (FH), und ein FH-Mangel bei Menschen, Schweinen und Mäusen ist mit C3G verbunden. 3 C3-Nephritfaktor, ein Antikörper, der die AP-C3-Konvertase stabilisiert, ist bei C3G häufig. abhängiger nephritischer Faktor C3).5,6

Obwohl ein Properdin-Mangel die Plasma-C3-Spiegel nicht verbesserte, stiegen die C5-Spiegel, was darauf hindeutet, dass Properdin für die Aktivität der C5-Konvertase, nicht aber der C3-Konvertase notwendig war.8,9

Die Verabreichung von Maus10 oder menschlichem FH11,12 an Cfh–/–-Mäuse verringerte die glomeruläre C3-Färbung und erhöhte die zirkulierenden C3-Spiegel. Konstrukte, die nur die regulatorischen und zielgerichteten Domänen von FH (Mini-FH-Moleküle) enthalten, sind in diesem Modell ebenfalls wirksam.13 Andere Ansätze umfassen Proteine, die auf Stellen der Komplementaktivierung abzielen. Dazu gehören TT30,14 ein Protein, das die komplementregulierenden Domänen von FH (FH1-5) enthält, die mit den komplementbindenden Domänen des Komplementrezeptors 2 verknüpft sind, und homodimere FH-Moleküle,15 Mini-FH-Moleküle, die komplementbindende Domänen enthalten des Faktor-H-verwandten Proteins 1.

Da der therapeutische Nutzen der Hemmung der Komplement-C3-Aktivierung bei C3G2 untersucht wird, ist es wichtig, die Kinetik der glomerulären C3-Ablagerung und ihre Beziehung zur AP-Aktivierung sowohl in den Glomeruli als auch im Kreislauf zu verstehen. In Modellen der Immunkomplex-vermittelten Glomerulonephritis klärte sich glomeruläres C3c innerhalb von 24 Stunden nach Verhinderung der Komplementaktivierung, während glomeruläres C3d wochenlang bestehen blieb.16 In ähnlicher Weise führt exogenes FH bei Cfh–/–-Mäusen zu einer Verringerung der glomerulären C3c-Färbung nach 24 Stunden , während glomeruläres C3d unverändert bleibt.11

In dieser Studie untersuchten wir die Wirksamkeit von 2 neuen Fusionsproteinen mit komplementregulierender Aktivität im Cfh–/–-Mausmodell von C3G. Die Proteine ​​enthielten die regulatorischen Domänen von Maus-FH (FH1-5), die an Maus-Ig konjugiert war, um die biologische Halbwertszeit zu verlängern. Eines der Fusionsproteine ​​mit der Bezeichnung IgG-FH1-5 wurde an einen nicht zielgerichteten monoklonalen Maus-Antikörper konjugiert. Der andere, Anti-P-FH1-5 genannt, wurde an einen monoklonalen Antikörper gegen Maus-Properdin konjugiert. Dies wurde durchgeführt, um die Hypothese zu testen, dass das Zielen dieses Fusionsproteins auf Orte der Komplementaktivierung durch Wechselwirkung mit der Properdin-Ablagerung die Regulation des Gewebekomplements verbessern würde. Unsere Daten zeigen, dass sowohl die nicht zielgerichteten (IgG-FH1-5) als auch die Properdin-zielgerichteten (anti-P-FH1-5) Proteine ​​die Plasma- und glomeruläre C3-Regulierung in Cfh–/–-Mäusen wiederherstellten. Zeitverlaufsstudien zeigten, dass die Wiederherstellung der C3- und FB-Spiegel die Spiegel der Fusionsproteine ​​im Kreislauf widerspiegelte. Im Gegensatz dazu blieben Anstiege von Plasma-C5 bestehen, nachdem die Fusionsproteine ​​aus dem Kreislauf entfernt worden waren. Wir zeigen, dass IgG-FH1-5 die glomeruläre Schädigung während einer beschleunigten nephrotoxischen Nephritis im Serum bei Cfh–/–-Mäusen verbessert.

Cistanche kann Nierenerkrankungen behandeln und die Nierenfunktion verbessern

ERGEBNISSE

Erzeugung von Fusionsproteinen und In-vitro- und In-vivo-Beurteilung der Aktivität Fusionsproteine ​​wurden erzeugt, indem die ersten 5 Short Consensus Repeat (SCR)-Domänen von Maus-FH (FH1-5) entweder mit einem Anti-Maus-Properdin-Antikörper (Anti -P-FH1-5) oder ein Antikörper mit einer nicht zielgerichteten Ig-Domäne (IgG-FH1- 5, ergänzende Abbildung S1). Die Aktivität der Proteine ​​wurde mit einem AP-spezifischen hämolytischen Assay bestimmt (Abbildung 1a). Anti-P-FH1-5 und IgG-FH1-5 hemmten die Hämolyse auf dosisabhängige Weise mit größerer Wirksamkeit für Anti-P-FH1-5. Anti-Properdin (Anti-P) reduzierte die Hämolyse ebenfalls dosisabhängig, aber die IgG-Kontrolle hatte keine Wirkung. Nach äquimolarer Injektion der Proteine ​​in Cfh–/–-Mäuse war das IgG-FH1-5-Protein bis zu 11 Tage nach der Injektion nachweisbar, während Anti-P-FH1-5 bis zu 4 Tage danach nachweisbar war Injektion (ergänzende Abbildung S2). Um zu bestimmen, ob IgG-FH1-5 und Anti-P-FH1-5 die Plasma-AP-Regulierung in Cfh–/–-Mäusen wiederherstellen könnten, haben wir zuerst die Plasma-C3-Spiegel nach Injektion der Fusionsproteine ​​gemessen (Abbildung 1b). . Die Verabreichung von entweder IgG-FH1-5 oder Anti-P-FH1-5 führte zu einer signifikanten Erhöhung von C3 im Plasma 24 Stunden und in geringerem Maße 96 Stunden nach der Injektion (Abbildung 1b). Diese Daten zeigten, dass sowohl IgG-FH1-5 als auch Anti-P-FH1-5 die Plasma-AP-Regulierung bei Cfh–/–-Mäusen vorübergehend wiederherstellen konnten. Als nächstes führten wir eine detaillierte Analyse dieser Veränderungen durch, indem wir den zeitlichen Verlauf der Veränderungen nicht nur in Plasma C3, sondern auch von Plasma C5 und den Proteinen FB und Properdin des alternativen Stoffwechselwegs charakterisierten. Anstiege der zirkulierenden C5- und Properdin-Spiegel halten nach Verabreichung von IgG-FH{1-5} und Anti-P-FH1-5 bei Cfh–/–-Mäusen länger an als Anstiege von C3 und FB

Wir verglichen die Kinetik der Veränderungen in C3, C5, FB und Properdin, indem wir Proteine ​​in Intervallen von bis zu 27 Tagen nach einer einzelnen Injektion von entweder IgG-FH1-5 oder Anti-P-FH1-5 ( Figur 2). Nach Verabreichung von IgG-FH1-5 trat der Spitzenanstieg von C3, C5, FB und Properdin alle am Tag 1 nach der Injektion auf. Die Zeit, bis diese Veränderungen auf die Werte vor der Behandlung abfielen, war unterschiedlich. Die Rückkehr zu den Spiegeln vor der Behandlung erfolgte zwischen den Tagen 1 und 4 für FB, zwischen den Tagen 7 und 11 für C3 und zwischen den Tagen 14 und 21 für Properdin und C5 (Abbildung 2a, c, e und g). Nach der Verabreichung von Anti-P-FH1-5 traten C3-Spitzenwerte am Tag 1 auf, fielen aber zwischen den Tagen 4 und 7 auf die Werte vor der Behandlung (Abbildung 2b). C5-Spitzenwerte traten am Tag 4 auf und kehrten zwischen den Tagen 7 und 11 auf die Werte vor der Behandlung zurück (Abbildung 2d). Der maximale Anstieg der FB trat am Tag 1 auf und fiel zwischen den Tagen 1 und 4 auf das Niveau vor der Behandlung (Abbildung 2f). Wie erwartet war freies Plasma-Properdin nach Injektion von entweder Anti-P-FH1-5 oder Anti-P erschöpft (Fig. 2h). Freie Properdinspiegel im Plasma blieben bis zu 7 Tage nach Anti-P-FH1-5 und bis zu 14 Tage nach Anti-P niedrig (Fig. 2h). Obwohl beide Fusionsproteine ​​die Plasma-AP-Regulierung vorübergehend wieder herstellten, spiegelte die Dauer der Verbesserung der C3-, FB- und C5-Spiegel die Dauer ihres Nachweises im Plasma wider, die für Anti-P-FH 1-5 kürzer war (ergänzende Abbildung S2). . Zusammenfassend waren die Änderungen in den Spiegeln von C3 und FB nach der Injektion von jedem Protein kürzer als die von C5 und Properdin. Diese Daten legen nahe, dass Plasma-FB ein empfindlicher Marker der C3-Konvertase-Aktivität in dieser Umgebung ist, während Properdin ein Marker der C5-Konvertase-Aktivität ist. Bemerkenswerterweise gab es nach der Anti-P-Injektion einen Anstieg von C5 nach 24 und 96 Stunden und am Tag 7

Abbildung 1| (a) Ergänzen Sie den alternativen Signalweg-abhängigen Hämolyse-Assay. Antikörper wurden in 2--fachen Verdünnungen von 60 nM bis zu 0,5 nM titriert. Die IgG-FH1-5-, Anti-P-FH1-5- und Anti-P-Reagenzien reduzierten die Kaninchen-Erythrozyten-Hämolyse dosisabhängig. Das IgG-Kontrollprotein wurde nicht inhibiert. Horizontale Balken bezeichnen Mittelwerte und Fehlerbalken stellen SD dar. (b) Plasma-Komplement C3 in Cfh–/–-Mäusen nach Injektion von Fusionsproteinen. Plasma C3 wurde vor und 24 Stunden und 96 Stunden nach Verabreichung von IgG-FH1-5 (rote Dreiecke, n ¼ 5) Anti-P-FH1-5 (lila Dreiecke, n ¼ 6), Anti gemessen -P (grüne Punkte, n ¼ 5) und IgG-Kontrolle (blaue Punkte, n ¼ 5). Horizontale Balken bezeichnen Mittelwerte und Schnurrhaare bezeichnen SD. ***P # 0,001 gegenüber Vorbehandlungswert und abgeleitet aus 2--Weg-ANOVA mit Bonferroni-Mehrfachvergleichstest. FH, Faktor H; P, Properdin.

(Abbildung 2d). Wie berichtet,8,9 weist darauf hin, dass die C5-Konvertase in Cfh–/–-Mäusen von Properdin abhängig ist.

IgG-FH1-5 und Anti-P-FH1-5 reduzierten das glomeruläre C3c, veränderten jedoch nicht die C3d-Färbung in Cfh–/–-Mäusen

Als nächstes untersuchten wir den Einfluss von IgG-FH1-5 und Anti-P-FH1-5 auf glomeruläre C3b/iC3b/C3c-, C3d-, Properdin- und FH-verwandte (FHR) Proteine. 96 Stunden nach der Injektion von IgG-FH1-5 war die glomeruläre C3b/iC3b/C3c-Färbung reduziert, die glomeruläre C3d- (Abbildung 3a) und FHR-Färbung (Abbildung 3b) jedoch nicht. Glomeruläres C3b/iC3b/C3c blieb entweder mit IgG-Kontrolle oder Anti-P unverändert. Das abnormale lineare Muster der glomerulären Properdin-Färbung bei unbehandelten Cfh–/–-Mäusen9 blieb 96 Stunden nach der IgG-Kontrolle bestehen. Bei Cfh–/–-Mäusen, denen entweder Anti-P oder IgG-FH1-5 injiziert wurde, war der glomeruläre Properdinspiegel nach 96 Stunden fast nicht nachweisbar (Abbildung 3b). Unerwarteterweise führte die Anti-P-FH1-5-Injektion unter Verwendung von Anti-Properdin-, Anti-FH/FHR- und Anti-IgG-Antikörpern zu einem körnigen glomerulären Färbemuster (Abbildung 3b). Dieser Befund legte nahe, dass das Anti-P-FH1-5-Protein in den Glomeruli abgelagert wurde. Die Injektion von Anti-P-FH1-5-Protein in Wildtyp-Mäuse führte nach 96 Stunden zu einer glomerulären Färbung mit Anti-Properdin-, Anti-FH/FHR- und Anti-IgG-Antikörpern (ergänzende Abbildung S3), was darauf hinweist Reagenz interagiert mit normalen Glomeruli. Wir spekulierten jedoch, dass das Anti-P-FH1-5-Protein auch mit dem bereits vorhandenen glomerulären Properdin in Cfh–/–-Mäusen interagieren könnte. Als wir das Reagenz in Cfh–/–-Mäuse injizierten, die mit Anti-P vorbehandelt worden waren, um glomeruläres Properdin zu entfernen, gab es eine Verringerung der granulären Färbemuster unter Verwendung von Anti-Properdin-, Anti-FH/FHR- und Anti-IgG-Antikörpern ( Ergänzende Abbildung S4). Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass die glomeruläre Wechselwirkung des Anti-P-FH1-5-Proteins in Cfh–/–-Mäusen teilweise von glomerulärem Properdin abhängt.

IgG-FH1-5 verbesserte die Nierenschädigung während einer beschleunigten nephrotoxischen Nephritis im Serum bei Cfh–/–-Mäusen

Bei Patienten mit C3G kann sich im Rahmen interkurrenter Infektionen eine akute Nierenschädigung entwickeln. Beispielsweise ist der Verlust der Nierenfunktion bei FHR5-Nephropathie mit Episoden synpharyngitischer makroskopischer Hämaturie verbunden.17 Die zugrunde liegende C3-Dysregulation bei C3G-Patienten führt wahrscheinlich zu einer verstärkten komplementvermittelten Nierenschädigung nach einem Auslöser, der zu einer Nierenentzündung führt. Um dies zu modellieren, induzierten wir eine beschleunigte nephrotoxische Nephritis im Serum, einen Immunkomplex

Abbildung 2| Plasma-Komplementprofil-Zeitverlauf bei Cfh–/–-Mäusen, denen IgG-FH1-5 und Anti-P-FH1-5 injiziert wurden. Plasma C3 (a,b), C5 (c,d), FB (e,f) und Properdin (P; g,h) vom Versuchsbeginn bis 27 Tage nach einmaliger Injektion von IgG-FH{{1{{21 }}}} (a,c,e,g; rote Dreiecke, n ¼ 5) oder Anti-P-FH1-5 (b,d,f,h; violette Dreiecke, n ¼ 6). Zu den Kontrollen gehörten Anti-P (grüne Punkte, n=5) und ein Isotyp-angepasster monoklonaler Antikörper (IgG-Kontrolle; blaue Punkte, n=5). Horizontale Balken bezeichnen Mittelwerte und Schnurrhaare bezeichnen SD. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001 im Vergleich zum Wert vor der Behandlung und abgeleitet aus der 2--Wege-Varianzanalyse mit Bonferroni-Mehrfachvergleichstest. FB, Faktor B; FH, Faktor H.

Glomerulonephritis-Modell, das Komplement- und Fc-Rezeptor-vermittelte Signalwege umfasst,18,19 bei Cfh–/–-Mäusen. Wir haben zuvor gezeigt, dass Cfh–/–-Mäuse in dieser Umgebung überempfindlich auf Nierenschäden reagieren7 und die Hypothese aufgestellt, dass das FH1-5-Protein durch Verstärkung der AP-Regulierung die Komplement-vermittelte Nierenschädigung in diesem Modell verbessern könnte. Da unsere Daten zeigten, dass das Anti-P-FH1-5-Protein in normalen Glomeruli abgelagert wurde, verwendeten wir IgG-FH1-5 während einer beschleunigten nephrotoxischen Nephritis im Serum. Vierundzwanzig Stunden vor der Injektion von nephrotoxischem Schafserum erhielten die Mäuse eine ip-Injektion von entweder IgG-Kontrolle (n=7) oder IgG-FH1-5 (n=8). Das experimentelle Protokoll ist in Abbildung 4adargestellt. Die Mäuse wurden 6 Tage nach der Verabreichung von nephrotoxischem Schafserum gekeult. Alle 3 histologischen Maße der glomerulären Pathologie (Schweregrad, Gesamtzellzahl und Makrophagenzahl) waren in der IgG-FH1-5-Gruppe signifikant niedriger (Abbildung 4b). Die tubulointerstitielle Schädigung war in der IgG-FH1-5-Gruppe ebenfalls geringer (Abbildung 4b). Der Serumharnstoff war signifikant erhöht

Abbildung 3| Glomeruläre Komplement-Immunfärbung bei Cfh–/–-Mäusen 96 Stunden nach Injektion von entweder IgG-FH1-5 oder Anti-P-FH1-5. (a) Repräsentative Bilder zusammen mit Quantifizierung von glomerulärem C3b/iC3b/C3c und C3d in den 4 experimentellen Gruppen: IgG-FH1-5 (rote Dreiecke, n ¼ 5), Anti-P-FH1-5 (violette Dreiecke, n=6), Anti-P (grüne Punkte, n=5) und IgG-Kontrolle (blaue Punkte, n=5). (b) Datenpunkte stellen Medianwerte dar, und Whisker bezeichnen einen Interquartilbereich. P-Werte abgeleitet vom Kruskal-Wallis-Test mit Dunn-Mehrfachvergleichstest. (b) Repräsentative Bilder von glomerulärem IgG, FHR und Färbung in den 4 Versuchsgruppen. Balken ¼ 100 mm. AFU, willkürliche fluoreszierende Einheiten; FH, Faktor H; P, Properdin. Um die Anzeige dieses Bildes zu optimieren, lesen Sie bitte die Online-Version dieses Artikels unterwww.kidney-international.org.

die IgG-Kontrollgruppe, aber Veränderungen im Serumalbumin und im Urin-Albumin-zu-Kreatinin-Verhältnis unterschieden sich nicht (Abbildung 4b). Wie erwartet war glomeruläres C3b/iC3b/C3c in der IgG-FH1-5-Gruppe signifikant reduziert (Abbildung 4b), aber glomeruläres Maus-IgG (Abbildung 4b) und Schaf-IgG (Daten nicht gezeigt) unterschieden sich nicht zwischen den Gruppen .

Abbildung 4| Die Vorbehandlung mit IgG-FH1-5 verbesserte die Nierenschädigung während einer beschleunigten nephrotoxischen Nephritis im Serum bei Cfh–/–-Mäusen. (a) Schematische Darstellung des Protokolls für beschleunigte nephrotoxische Nephritis im Serum. Mit Schaf-IgG vorimmunisierte Mäuse erhielten entweder IgG-FH1-5 (Behandlungsgruppe, n ¼ 8) oder IgG-Kontrolle (Kontrollgruppe, n ¼ 7) 24 Stunden vor Verabreichung des nephrotoxischen Schafserums. (b) Nierenfunktion und Histologie 6 Tage nach Induktion einer beschleunigten nephrotoxischen Nephritis im Serum bei Mäusen, die entweder mit IgG-FH1-5 (Behandlung; rote Dreiecke, n=8) oder IgG-Kontrolle (Kontrolle; blaue Kreise, n ¼ 7). Horizontale Balken bezeichnen Medianwerte und Schnurrhaare bezeichnen einen Interquartilbereich. *P # 0.05, **P # 0.01, ***P # 0,001 gegenüber der Kontrolle und abgeleitet vom Mann-Whitney-Test. FH, Faktor H; P, Properdin.

DISKUSSION

Sowohl IgG-FH1-5 als auch Anti-P-FH1-5 normalisierten die C3-, FB- und C5-Spiegel in Cfh–/–-Mäusen. Dieser Befund stimmt mit der Tatsache überein, dass sich die komplementregulierenden Domänen von Maus-FH innerhalb der SCR-Domänen 1 bis 5 befinden (eine C3b-Bindungsstelle und die Cofaktor-Aktivität für die Faktor-I-vermittelte Spaltung von C3b).20 Oberflächenerkennungsdomänen, die Bindung an Heparin und Endothelzellen beeinflussen und eine zweite C3b-Bindungsstelle beinhalten, sind innerhalb der SCR-Domänen 18 bis 18 vorhanden

20 (FH18-20) und sind daher in den Fusionsproteinen nicht vorhanden.20 Dennoch reduzierten beide Proteine ​​glomeruläres iC3b/C3b/C3c, was darauf hindeutet, dass FH18-20 in dieser Umgebung nicht erforderlich war. Dieser Befund stimmt mit früheren Daten überein, die zeigten, dass Cfh–/–-Mäuse, die ein mutiertes FH-Protein exprimierten, das aus den SCR-Domänen 1 bis 15 (Cfh–/– .FHD16-20) exprimierte, keine abnormale glomeruläre C3-Ablagerung entwickelten.21,22 Cfh–/–.FH D16-20-Tiere waren jedoch nicht in der Lage, die C3-Aktivierung entlang des Nierenendothels zu regulieren und entwickelten eine thrombotische Mikroangiopathie. Aufgrund des Fehlens der FH18-20-Domänen, die auf die Oberfläche zielen, ist es möglich, dass die Verabreichung von Fusionsproteinen, die FH1-5 enthalten, bei FH-Mangel zu einer Anfälligkeit für thrombotische Mikroangiopathie führen könnte. Es ist auch möglich, dass die erhöhte Avidität für die C3b-Bindung unter der dimeren Struktur der Fusionsproteine ​​ausreicht, um das Fehlen der oberflächengerichteten FH18-20-Domänen zu kompensieren. Die Oberflächenerkennung von C3b wird jedoch auch durch Konformationsänderungen in FH beeinflusst.23 Ein Streptococcus pneumoniae FH-bindendes Protein (PspCN, das die SCR-Domäne 9 bindet) löst eine FH-Konformationsänderung aus, und der FH-PspCN-Komplex hatte eine erhöhte C3b-Bindung und verbesserte zerfallsbeschleunigende Aktivität. Die FH20-C3d-Bindungsstelle ist bei FH nicht exponiert, wird aber im FH-PspCN-Komplex exponiert. Dies könnte erklären, warum FH19-20 mit Oberflächen-C3d interagiert, FH jedoch nicht.24,25 Wir spekulieren, dass unsere Wirkstoffe durch Konformationsänderungen effizient sowohl mit der Flüssigphase als auch mit Oberflächen-C3b interagieren können. Bemerkenswerterweise schützten sowohl IgG-FH1-5 als auch Anti-P-FH1-5 Erythrozyten vor Lyse in einem AP-abhängigen Hämolyse-Assay.

Keines der Fusionsproteine ​​reduzierte die glomeruläre C3d-Färbung, möglicherweise aufgrund der anhaltenden Natur von glomerulärem C3d. Bei experimenteller Immunkomplexnephritis löste sich das glomeruläre C3c innerhalb von 24 Stunden nach Beendigung der Komplementaktivierung auf, aber C3d blieb wochenlang bestehen.16 Außerdem bleibt glomeruläres C3d bei Lupusnephritis bestehen.26 Dies spiegelt wahrscheinlich seine kovalente Wechselwirkung mit glomerulären Oberflächen wider. Wiederholte Injektionen von humanem FH in Cfh–/–-Mäuse zeigten eine Verringerung des glomerulären C3d über 10 Tage.11 Es ist wahrscheinlich, dass die wiederholte Gabe von IgG-FH1-5 das glomeruläre C3d in diesem Modell verringern könnte. Es gab auch keine Veränderung in der glomerulären FHR-Färbung. Über die Funktionen der Maus-FHR-Proteine ​​ist wenig bekannt, aber sie können sowohl mit C3b27,28 als auch mit C3d interagieren.27 Tatsächlich ist die offensichtliche Affinität sowohl von FHR-A als auch von FHR-B für C3d stärker als die von FH.27 Wir spekulieren, dass glomeruläre FHR-Proteine ​​wahrscheinlich nur dann aus den Glomeruli entfernt werden, wenn C3d entfernt wurde. In diesem Zusammenhang ist bemerkenswert, dass in menschlichem C3G Faktor-H-verwandtes Protein 5 mit glomerulärem C3d assoziiert.29

Das Anti-P-FH1-5-Protein verringerte wie erwartet die Spiegel an freiem Properdin im Plasma, da der Anti-Properdin-Teil dieses Fusionsproteins die AP-Aktivität (aufgrund der Properdin-Verarmung) für 8 Tage nach einer einzigen Injektion blockieren kann.30 Unsere Daten zeigten, dass die Wirksamkeit von FH1-5 bei der Erhöhung der Plasma-C3-Spiegel und der Verringerung der glomerulären C3b/iC3b/C3c-Färbung zwischen den beiden Fusionsproteinen vergleichbar war (dh unabhängig vom Properdin-Targeting). Darüber hinaus war die abnormale glomeruläre Properdin-Färbung nach Verabreichung von entweder Anti-P oder IgG-FH1-5 signifikant reduziert. Offensichtlich wird glomeruläres Properdin im Gegensatz zu C3d- und FHR-Proteinen nach der Wiederherstellung der C3-Regulation leicht entfernt. Das Muster des glomerulären Properdins änderte sich nach der Verabreichung des Anti-P-FH1-5-Proteins, aber dies wurde durch die Beobachtung erschwert, dass wir eine Ablagerung dieses Fusionsproteins sowohl in Cfh–/– als auch in Wildtyp-Glomeruli entdeckten. Dies war teilweise auf eine Wechselwirkung mit glomerulärem Properdin zurückzuführen, aber die Ablagerung in Wildtyp-Glomeruli deutete darauf hin, dass dies auch teilweise völlig unabhängig vom glomerulären Komplement war und wahrscheinlich mit den physikochemischen Eigenschaften des Fusionsproteins zusammenhängt.

Unsere kinetischen Daten zeigten neue Erkenntnisse bezüglich der zeitlichen Veränderungen von FB, C5 und Properdin, die mit einem Anstieg von C3 in Cfh–/–-Mäusen nach Injektion der Fusionsproteine ​​einhergehen. Die FB-Spiegel stiegen nach der Injektion schnell an

und kehrte zu einem Zeitpunkt, als sowohl C5- als auch Properdin-Spiegel erhöht blieben, auf die Ausgangswerte zurück. Die Properdin-Spiegel bei Cfh–/–-Mäusen waren zu Studienbeginn reduziert und stiegen nach der Injektion von IgG-FH1-5 auf normale Werte (20 mg/ml30) an und blieben mindestens 14 Tage lang auf diesen Spiegeln. Ein ähnlicher Zeitverlauf wurde für den Anstieg der Plasma-C5-Spiegel beobachtet. Auffallenderweise war IgG-FH1-5 nach 11 Tagen größtenteils nicht mehr im Blutkreislauf, was darauf hindeutet, dass die Bildung der C5-Konvertase in Cfh–/–-Mäusen langsamer ist als die der C3-Konvertase (weil die C3-Spiegel zwischen den Tagen auf den Ausgangswert zurückkehrten). 7 und 11 Tage). Plasma-C5 stieg nach Anti-P-Behandlung an und stieg weiter mit Anti-P-FH1-5-Protein an. Daher trugen sowohl das Properdin-Targeting als auch die Wirkungen von FH1-5 zu den erhöhten C5-Spiegeln bei und weisen darauf hin, dass die C5-Konvertase in Cfh–/–-Mäusen teilweise Properdin-abhängig ist. Dieser Befund steht im Einklang mit der Verbesserung der C5-Dysregulation bei Mäusen mit kombiniertem FH- und Properdin-Mangel.8,9 Zirkulierende Properdin-Spiegel können in C3G reduziert sein und scheinen mit der Oberflächen-C5-Konvertaseaktivität im Gegensatz zu entweder Plasma-C5 oder löslichem C5b zu korrelieren. {30}}.31,32 Unsere Daten unterstützen eine enge Verbindung zwischen Properdin-Spiegeln und C5-Konvertase-Aktivität und unterstützen die Verwendung von Properdin-Spiegeln als Biomarker der laufenden glomerulären C5-Aktivierung.

Bemerkenswerterweise war das IgG-FH1-5-Protein noch bis zu 11 Tage nach einer einzigen Injektion im Kreislauf nachweisbar. Dies ist viel länger als zuvor für das unkonjugierte Maus-FH1-5-Protein berichtet, das innerhalb von 24 Stunden aus dem Kreislauf entfernt wurde.14 Dieser Befund weist darauf hin, dass die längere Plasmahalbwertszeit des IgG-FH{ {9}}-Protein wird von der Antikörperkonjugation abgeleitet. Die Plasmahalbwertszeit des IgG-FH1-5-Proteins war auch länger als das, was wir zuvor für FH in voller Länge beobachtet haben.10,11 Zum Beispiel wurde menschliches FH 96 Stunden nach einer einzigen Injektion aus dem Kreislauf entfernt in Cfh–/–-Mäusen.11 In Kombination mit unseren Daten, die die Wirksamkeit des IgG-FH1-5-Proteins bei der Komplementregulation zeigen, sind wir der Ansicht, dass die Konjugation des FH1-5-Proteins zur Verlängerung seines pharmakokinetischen Profils potenziell therapeutisch ist Dienstprogramm in C3G.

Zusammenfassend zeigen wir, dass die FH1-5-Fusionsproteine ​​trotz fehlender Oberflächenerkennungsdomänen bei der Verringerung der glomerulären C3-Aktivierung und der Wiederherstellung der Plasmakomplementregulation bei FH-Mangel wirksam waren. Es gab keinen offensichtlichen Vorteil bei der Konjugation der FH1-5-Domänen an Antiproperdin, und das IgG-FH1-5-Protein verringerte die Nierenschädigung bei experimenteller Nephritis. Im Gegensatz zu den Herausforderungen bei der Herstellung von FH-Präparaten im großen Maßstab für therapeutische Zwecke ist die großtechnische Produktion von Therapien auf Antikörperbasis gut etabliert, was IgG-FH1-5 zu einem attraktiven potenziellen Therapeutikum für C3G macht.

METHODEN

Fusionsproteine

IgG-FH1-5. Die ersten 5 Maus-FH-SCR-Domänen (mFH1-5) verknüpft

gegen ein nicht zielgerichtetes IgG1-Maus-Ig (ein anti-idiotypischer Antikörper, der gegen einen monoklonalen Maus-Antikörper gezüchtet wurde).

Anti-P-FH1-5. Murines FH1-5, verknüpft mit Maus-Anti-Properdin-Antikörper (Anti-P),30 Alexion von W. Song, University of Pennsylvania, zur Verfügung gestellt).

Kontrollen. Kontrollen waren Isotyp-abgestimmtes, nicht zielgerichtetes Maus-Ig (IgG-Kontrolle) und Maus-Anti-Properdin (Anti-P) (ergänzende Abbildung S1). Proteine ​​wurden unter Verwendung von pVEK-Vektoren und Expi293-Zellen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) erzeugt, gereinigt unter Verwendung von Protein A (MabSelect SuRe, Cytiva, Marlborough, MA).

AP-spezifischer hämolytischer Assay

Zwanzig Prozent normales Mausserum, titriert von 60 nM bis 0,5 nM, wurde mit Kaninchenerythrozyten (1,5 106 Zellen/ml) bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Häm-Freisetzung wurde spektrophotometrisch quantifiziert (optische Dichte 415 nm); 100 % Lyse war Serum ohne Inhibitor.

Plasma FB und FH

Plasma wurde nach Zentrifugation von Blut gewonnen, das in Röhrchen gesammelt wurde, die Ethylendiamintetraessigsäure (Sarstedt, Nordrhein-Westfalen, Deutschland) enthielten. Proteine ​​wurden durch Kapillarelektrophorese-Immunoassay (WES, ProteinSimple, San Jose, CA) gemessen. Die verwendeten Antikörper waren polyklonaler Anti-Maus-FH-Antikörper (Alexion Pharmaceuticals, Boston, MA) und Anti-Maus-FB-Antikörper (Abcam, Cambridge, UK); Es wurde das Anti-Kaninchen-Erkennungsmodul von WES (ProteinSimple, San Jose, CA) verwendet. Chemilumineszenzsignale wurden mit Compass for SW Software (ProteinSimple, Version 5.0.1) analysiert, als Peakflächen quantifiziert und auf die Assaykontrolle normalisiert.

Mäuse

Alle Mäuse wurden unter speziellen pathogenfreien Bedingungen gehalten; Die Verfahren wurden gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom britischen Innenministerium genehmigt. C57BL/6-Wildtyp-Mäuse wurden von Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erworben, und Cfh–/–-Mäuse wurden wie zuvor beschrieben erzeugt.7 Mäuse wurden hinsichtlich Alter und Geschlecht abgeglichen; Äquimolare Proteindosen wurden über ip-Injektion verabreicht (1 mg für Anti-Properdin und IgG-Kontrolle; 1,4 mg für IgG-FH1-5 und Anti-P-FH1-5). Eine beschleunigte nephrotoxische Nephritis im Serum wurde durch iv-Injektion von nephrotoxischem Schafserum in mit Schaf-IgG vorimmunisierte Mäuse induziert.7 Die Verabreichung der Fusionsproteine ​​erfolgte 24 Stunden vor der Induktion von nephrotoxischem Schafserum ( 4a ).

C3, C5 und freies Properdin C3-Plasma wurden durch einen enzymgebundenen Immunadsorptionsassay gemessen.14 Plasmaspiegel von „freiem“ Properdin und C5 wurden unter Verwendung von Elektrochemilumineszenz-Immunoassays (Meso Scale Discovery [MSD], Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD) mit anti – Properdin oder ein kundenspezifisches Anti-Maus-C5, beschichtet auf hochbindenden MSD-Platten. Gebundenes "freies" Properdin und C5 wurden mit Anti-Properdin (von W. Song) oder biotinyliertem monoklonalem Anti-C5 (Alexion) kombiniert mit Streptavidin-SULFO (MSD, Meso Scale Diagnostics) nachgewiesen. Das Chemilumineszenzsignal wurde mit einem SECTOR S 6000 Imager (MSD, Meso Scale Diagnostics) aufgenommen und mit der MSD Discovery Workbench Software (Meso Scale) analysiert

Diagnose, Version 4.0.12.1). Als Standards wurden rekombinantes murines Properdin und C5 verwendet.

Nierenfunktion und Histologie

Hämaturie und Proteinurie wurden mit Hema-Combistix (Bayer, Reading, UK) beurteilt; Plasma-Harnstoff wurde gemessen und Nierengewebe wie zuvor beschrieben aufbereitet.9 Kreatinin im Urin wurde in Spot-Urinproben unter Verwendung des Creatinine Companion Protocol Assay (#1012; Excell, Philadelphia, PA) und Spot-Urin/ Plasmaalbumin wurde durch einen enzymgebundenen Immunadsorptionstest (#E99-134; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) gemessen. Perjodsäure-Schiff-gefärbte Nierenschnitte wurden verblindet beurteilt und nach Schweregrad der glomerulären und tubulointerstitiellen Schädigung eingestuft (0 [keine], 1 [leicht], 2 [mäßig]). Zehn Glomeruli pro Abschnitt wurden bewertet, um die mittlere glomeruläre Zellzahl zu bestimmen. Die Immunfluoreszenzfärbung wurde an Kryoschnitten von 5- mm durchgeführt, die unter Verwendung von Vectashield-Medium mit DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) befestigt wurden. Die verwendeten Antikörper waren Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugierter polyklonaler Ziegen-Anti-Maus-C3b/C3c/iC3b (1:200; Nr. 55500; MP Biomedical, Santa Ana, CA)9; Feigenketten-spezifisches FITC-konjugiertes polyklonales Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:400; #F5387; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); FITC-konjugiertes monoklonales Maus-anti-Ziege/Schaf-IgG (1:100; #F5137; Sigma-Aldrich); oder FITC-konjugiertes Ziegen-Anti-Mensch-Properdin (1:50; #GAHu/PPD/FITC, Nordic Immunologic Laboratories, Kopenhagen, Dänemark).9 Biotinyliertes Ziegen-Anti-Maus-C3d (1:10; # BAF2655; R&D Systems , Minneapolis, MN) wurde auf Biotin-blockierten Schnitten (Biotin Blocking System; Agilent Dako, Santa Clara, CA) mit sekundärem Streptavidin AF488-Antikörper (1:200; #S-32354; Thermo Fisher Scientific) verwendet. FH wurde in gereinigten Ratten-Anti-Maus-CD16/CD32--blockierten Schnitten (1:100; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) unter Verwendung von Ziegen-Anti-Mensch-FH (1:1000; #A312; Quidel, San Diego) sichtbar gemacht , CA) und monoklonaler Anti-Ziegen-IgG-FITC-Sekundärantikörper (1:100; Klon GT-34; F4891; Sigma-Aldrich). Glomeruläre Makrophagen wurden unter Verwendung von FITC-konjugiertem Ratten-Anti-Maus-CD68 (FA-11-Klon GTX43518; GeneTex, Irvine, CA) identifiziert. Die quantitative Immunfluoreszenzanalyse wurde unter Verwendung eines optischen Mikroskops Leica DM4B gekoppelt mit einer Digitalkamera Leica DFC700T (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) und der Software Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD, Version 7) durchgeführt. Pro Abschnitt wurden zehn Glomeruli untersucht, und die mittlere Intensität wurde in willkürlichen fluoreszenzwissenschaftlichen Einheiten ausgedrückt.

statistische Analyse

GraphPad Prism, Version 8.0 (GraphPad, San Diego, CA) wurde für die statistische Analyse verwendet. Für die Zeitverlaufsanalyse wurde eine 2--Weg-Varianzanalyse mit wiederholten Messungen mit Bonferroni-Mehrfachvergleichstest (Faktoren waren Zeit und Behandlung) verwendet. Der Kruskal-Wallis-mit-Dunn-Mehrfachvergleichstest wurde verwendet, wenn mehrere Gruppen verglichen wurden, und der Mann-Whitney-Test wurde für 2 Gruppen verwendet.

OFFENLEGUNG

MCP hat Beratungshonorare von Alexion, ChemoCentryx, Novartis, Gyroscope und Achillion Pharmaceuticals erhalten. HTC hat Beratungshonorare von Alexion, Novartis, Aurinia und Achillion Pharmaceuticals erhalten. YZ, YW, KKJ und SK-K sind Mitarbeiter von Alexion Pharmaceuticals. SK ist ein ehemaliger Mitarbeiter von Alexion Pharmaceuticals und ist derzeit bei Gemini Pharmaceuticals beschäftigt. Alle anderen Autoren erklärten keine konkurrierenden Interessen.

DANKSAGUNGEN

MCP ist ein Wellcome Trust Senior Fellow in Clinical Science (Fördernummer 212252/Z/18/Z), und ACG und DPL werden von diesem Stipendium unterstützt. YZ, SK, YW, KKJ und SK-K wurden von Alexion Pharmaceuticals finanziert.

ERGÄNZUNGSMATERIAL

Ergänzende Datei (PDF)

Abbildung S1. In dieser Studie verwendete Fusionsproteine. IgG-FH1-5 enthält die ersten 5 Domänen von Maus-Faktor H (FH1-5), die mit einem nicht zielgerichteten Maus-Ig verknüpft sind. Anti-P-FH1-5 besteht aus mFH1-5, das an einen neutralisierenden Maus-Anti-Maus-Properdin-Antikörper (Anti-P; siehe Miwa et al.30) gebunden ist. Zu den Kontrollproteinen gehörten ein Isotyp-angepasstes nicht zielgerichtetes Maus-Ig (IgG-Kontrolle) und der neutralisierende Maus-Anti-Maus-Properdin-Antikörper (Anti-P). Abbildung S2. WES-Blot-Analyse zum Nachweis von FH1-5 in Plasmaproben von Mäusen mit FH-Mangel, denen entweder (A) IgG-FH1-5 oder (B) Anti-P-FH1-5 injiziert wurde. Das 94-kDaIghheavychainlinkedtomouseFH1-5 (HC-FH1-5) ist bis zu 11 Tage nach Injektion von IgG-FH1-5 und bis zu 4 Tage nach Injektion von Anti-P-FH1-5-Protein nachweisbar (rote Kästchen Die Kontrollen umfassten Plasma von Wildtyp-Mäusen, bei denen das Faktor-H-Protein in voller Länge nachgewiesen wurde (FH, schwarze Kästchen, Spur C1) und nicht injizierte FH-defiziente Mäuse, bei denen kein FH nachweisbar war (schwarze Kästchen, Spur C2). Wie erwartet ist weder FHnorFH1-5 in Plasmaproben von Mäusen nachweisbar, denen Anti-P- oder IgG-Kontrolle injiziert wurde.

Abbildung S3. Glomeruläre Komplement-Immunfärbung 96 Stunden nach Injektion von IgG-Kontrolle oder Anti-P-FH1-5 bei Wildtyp-Mäusen. Repräsentative glomeruläre Bilder werden gezeigt (Balken ¼ 100 mm).

Abbildung S4. Die Rolle von Properdin bei der Ablagerung von Anti-P-FH1-5 in Glomeruli von Mäusen mit FH-Mangel. Cfh–/–-Mäusen wurde entweder IgG-Kontrolle oder Anti-P (Behandlung 1) injiziert, gefolgt von 24-Stunden später entweder IgG-Kontrolle oder Anti-P-FH1-5 (Behandlung 2). Die Tiere wurden 120 Stunden nach Behandlung eins getötet und die glomeruläre Färbung auf IgG, Properdin und FH/FHR wurde bewertet. Repräsentative Bilder werden gezeigt. Die Anti-P-Injektion reduzierte deutlich das Properdin (Reihe 1, Spalte 2), aber nicht die FH/FHR- (bleibt unverändert) oder IgG- (bleibt abwesend) Färbung. Die Verabreichung von Anti-P-FH1-5 24-Stunden nach der IgG-Kontrolle führte zum Auftreten einer körnigen Färbung mit Anti-IgG-, Anti-FH/FHR- und Anti-P-Antikörpern, wie sie nach der Injektion von Anti-P-FH zu sehen waren 1-5 allein (siehe Abbildung 3b). Diese körnige Färbung wurde reduziert, wenn der Anti-P-FH1-5-Injektion eine Anti-P-Injektion vorausging, die sowohl zirkulierend (siehe Fig. 1h) als auch glomerulär (siehe Fig. 3b) erschöpft. Eine glomeruläre Färbung mit Anti-IgG war nur bei Mäusen erkennbar, denen Anti-P-FH1-5 (Reihe 3, Spalten 3 und 4) injiziert worden war, und war signifikant geringer bei Mäusen, die Anti-P-FH1-5 erhielten. vorangestellt von Anti-P. Wir kamen zu dem Schluss, dass die Ablagerung von Anti-P-FH1-5 in den Glomeruli von Cfh–/–-Mäusen teilweise von Properdin abhängig war. Horizontale Balken bezeichnen Medianwerte und Schnurrhaare bezeichnen den Interquartilbereich. Der P-Wert wurde aus dem Mann-Whitney-Test abgeleitet. Stab ¼ 100 mm.

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