Zusammensetzungsanalyse und immunologische Aktivitäten der aus Cistanche Deserticola isolierten Oligosaccharide

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Abstrakt.Ein Oligosaccharid (CDOS) wurde erhalten ausCistanche DeserticolaB. durch Alkaliextraktion (pH{0}}), Ethanolfällung und Fraktionierung in zwei gereinigte Fraktionen (d. h. CDOS-1 und CDOS-2) durch Sephadex G-100 und Sephadex G-25-Säulenfiltrationschromatographie. Die Monosaccharidzusammensetzung des CDOS wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) untersucht. Es wurde festgestellt, dass CDOS-1 nur aus Saccharose bestand und CDOS-2 hauptsächlich aus Saccharose, Rhamnose und Mannitol mit einem Molverhältnis von 1:0,73:3,61 bestand. Immunologische Tests zeigten, dass CDOS eine signifikante Wirkung auf den Milzindex der Maus zeigte, indem es die Phagozytose-Aktivität von Makrophagen erhöhte und die Proliferation von Antikörper-produzierenden Zellen stimulierte. Es ist zu hoffen, dass das CDOS zu einem funktionellen Lebensmittel oder einer Medizin entwickelt wird.

Schlüsselwörter:CistancheDeserticola, Oligosaccharid, Reinigung, Zusammensetzung, immunologische Aktivitäten.

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1. Einleitung

CistancheDeserticola YCMa. (Familie Orobanchaceae) ist eine kurze parasitäre Pflanze, die im Nordwesten Chinas beheimatet ist. Die ganze getrocknete Pflanze (ohne Blüten) ist als Stärkungsmittel bekannt und wird „Rou Congrong“ genannt Die Funktion vonbelebenddasNiereund Nahrungsergänzung, Befeuchtung des Darms und Entspannung des Darms [1]-[3]. Die moderne pharmakologische Studie zeigte, dass es die DNA-Synthese anregen und den Prozess der Senilität verzögern, das Antioxidans erhöhen [4] , Herz-Kreislauf-Erkrankungen verhindern und behandeln kann [3]. Darüber hinaus könnte es auch schmerz- und schmerzlindernd wirkenAnti-entzündlichEffekte [5], verbessern das Lernen und Gedächtnis durch die Induktion von Nervenwachstumsfaktoren [6]. Einige Studien zeigten, dass C. deserticola-Extrakte die phagozytische Funktion intraabdominaler Makrophagen bei Mäusen aktivieren könnten [7]-[9] undverbessern dieKarosserie's Immunität[10]. Laut früheren Studien enthält diese Pflanze mehrere aktive Bestandteile, darunter Phenylethanoid-Glykoside, Iridoide, Lignane, Saccharide, Alkaloide usw. [11] Da C.DeserticolaPhenylethanoidGlykosideund Polysaccharide als die wichtigsten aktiven Komponenten anerkannt sind, haben sich zahlreiche Studien in den letzten Jahrzehnten auf ihre Strukturen und Bioaktivitäten konzentriert [12]-[17]. Wie für die wertvollen Oligosaccharide inC. Deserticola, die Berichte sind ziemlich begrenzt. Oligosaccharide, ein kurzkettiges Saccharid, das Homo- oder Heterozucker enthält, sind für ihre wohltuende Wirkung auf das menschliche Leben bekannt und werden seit langem umfassend genutzt [18]. Funktionelle Oligosaccharide, die eine physiologische Funktion wie geringe Kariogenität und Bifidobakterien-Wachstumsfaktor haben [19], verbessern die Gesundheit von Mensch und Tier. Sie wurden als Lebensmittelzutat verwendet. Kürzlich wurde über neue Funktionen von Oligosacchariden berichtet, die das Immunsystem von Menschen, Tieren und Fischen modulieren können [20]. In diesem Artikel berichten wir über den ersten Teil der Ergebnisse des Forschungsprogramms, die Fraktionierung der gesamten Oligosaccharide, die aus dem Alkaliextrakt von C. deserticola durch eine Kombination aus Ultrafiltration und Gelpermeationschromatographie erhalten wurden, und deren Zusammensetzungsanalyse durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Darüber hinaus präsentieren wir auch die immunologischen Aktivitäten der C. deserticola-Oligosaccharide. Unseres Wissens gibt es nur wenige veröffentlichte Berichte über die immunstimulatorischen Aktivitätsstudien vonC. DeserticolaOligosaccharide.

2. Experimentell

2.1. Materialien

Die C. deserticola wurde von Alxa League (Innere Mongolei, China) kultiviert und gesammelt. Kunming-Mäuse (Grad II, sechs Wochen alt) wurden vom Pharmacology Experimental Center der Inner Mongolia University gekauft. Sephadex G-100,Sephadex G-25, Trifluoressigsäure (TFA), 1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolon (PMP), D-Glucose, D- Galactose, D-Fructose, D-Xylose, D-Mannose, D-Galacturonsäure, D-Glucuronsäure, Saccharose, Rhamnose, Mannit, Fucose, Rhamnose, wurden von Sigma (St. Louis, MO, USA) bezogen. Medium RPMI-1640 wurde von Gibco Invitrogen Co. (San Diego, CA, USA) bezogen. Alle anderen Chemikalien waren analysenrein.

2.2. Extraktion von Oligosacchariden

Die getrockneten Körper von C. deserticola wurden in kleinere Stücke geschnitten und durch eine Mühle weiter zu Pulver gemahlen und mit wasserfreiem Ethanol (3 × 5000 ml) bei 70 Grad für 3 h unter atmosphärischem Druck extrahiert. Zur Entfernung von Lipiden wurde ein Rückflusskühler angebracht. Der verbleibende Rückstand wurde dann mit Alkali (pH =10) bei 60 Grad 3 Mal (jeweils 2 Stunden) extrahiert. Nach Zentrifugation (2000 g für 15 min, bei 20 Grad) wurde der Überstand im Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck bei 50 Grad auf ein Zehntel des Volumens eingeengt und filtriert. Anschließend wurde das Filtrat mit dem Sevag-Reagenz [21] enteiweißt und mit Aktivkohle entfärbt.

2.3. Isolierung und Reinigung von Oligosacchariden

Die gefriergetrockneten rohen Oligosaccharide wurden in destilliertem Wasser gelöst, zentrifugiert und dann wurde der Überstand durch eine Sephadex G-100-Säule (1 × 50 cm), äquilibriert mit ultrareinem Wasser, gereinigt. Nach dem Beladen mit der Probe wurde die Säule mit Reinstwasser bei einer Flussrate von 5 ml/min eluiert. Verschiedene Fraktionen wurden unter Verwendung von Reagenzgläsern gesammelt. Der Gesamtkohlenhydratgehalt jedes Röhrchens wurde bei 490 nm nach der Phenol-H2SO4-Methode gemessen [22]. Die mit Wasser eluierte Lösung wurde in zwei Fraktionen CDOS-1 und CDOs-2 getrennt. Zwei Fraktionen wurden jeweils auf einer Sephadex G-25-Säule (2,7 x 85 cm) unter Verwendung von Reinstwasser (bei einer Flussrate von 1 ml/min) weiter gereinigt. Nach dem Sammeln der gereinigten Fraktion wurde sie lyophilisiert.

2.4. Analyse der Monosaccharidzusammensetzung

Die Monosaccharidzusammensetzung der CDOs wurde durch HPLC-Analyse ermittelt. Die CDOs (2 mg) wurden zuerst mit wasserfreiem Methanol, das 2 M HCl enthielt, bei 8 0 Grad für 16 h unter einer Stickstoffatmosphäre und dann mit 2 M TFA bei 120 Grad für 1 h hydrolysiert. Nachdem TFA durch Verdampfen entfernt worden war, wurden die Hydrolysate anschließend mit PMP gemäß dem berichteten Verfahren [23] derivatisiert und durch HPLC analysiert. Die HPLC-Trennung wurde auf dem EF-2002-HPLC-System (Firma KNAUER, Deutschland) durchgeführt. Die PMP-Derivate wurden unter Verwendung von Sugar-PAK-Volumen (6,5 × 300 mm, Gläser der Water Company, America) chromatographiert, und die Extinktion wurde bei 245 nm gemessen. Das Injektionsvolumen betrug 20 &mgr;l, und die mobile Phase, bestehend aus PBS (Lösungsmittel A) und Acetonitril (Lösungsmittel B), wurde für die isokratische Elution in einem Volumenverhältnis von 82 Prozent (A) zu 18 Prozent (B) verwendet. Die gesamte HPLC-Laufzeit betrug 40 min, und die Flussrate betrug 0,5 ml/min.

2.5. Immunbiologische Aktivitäten

2.5.1. Phagozytische Funktion von Monozyten-Makrophagen

Sechzig Kunming-Mäuse (Grad II, sechs Wochen alt) wurden vom Pharmacology Experimental Center der Inner Mongolia University gekauft und vor der Verwendung eine Woche lang akklimatisiert. Alle Mäuse wurden zufällig in vier Gruppen eingeteilt, bestehend aus einer Kochsalz-Kontrollgruppe, einer Gruppe mit hoher CDO-Dosierung, einer Gruppe mit moderater Dosierung und einer Gruppe mit niedriger CDO-Dosierung. Den Mäusen wurde 5 Tage lang einmal täglich 0,5 ml Oligosaccharidlösung intraperitoneal injiziert. Die Gruppe mit hoher, mittlerer oder niedriger CDO-Dosierung erhielt 10{{10}}, 50 bzw. 25 mg/kg/KG CDOs; und der Kontrollgruppe wurden 0,5 ml Kochsalzlösung injiziert. Am siebten Tag wurde ein Kohlepartikel-Clearance-Experiment nach Hou [24] durchgeführt und der Milzindex und der Thymusindex gemessen. Kurz gesagt, 0,05 ml/10 g/bw Tusche wurde in jede Maus durch die Vena caudalis injiziert, dann wurden 20 &mgr;l Blut aus der Vena orbitalis posterior 3 und 7 Minuten nach der Injektion entnommen. Die Blutproben wurden in Röhrchen mit 2 ml 0,1 % Na2CO3 gegeben und die OD-Werte wurden bei 600 nm gemessen. Der Clearance-Index (K), der Phagozytenindex ( ) und der Immunorganindex wurden wie folgt berechnet (1), t2 und t1 bedeuten 7 Minuten bzw. 3 Minuten.

2.5.2. Die Antikörper-produzierende Zellproliferation

Gruppen von Kunming-Mäusen (fünf pro Gruppe) wurden durch intraperitoneale Injektion von 2 x 107 SRBC in 1,0 ml PBS, zugesetzt mit 50 ug Testmaterialien (keine in der Kontrolle), immunisiert. Eine Woche später wurden Splenozyten (106 Zellen pro 2 ml pro Vertiefung) von Kunming-Mäusen mit oder ohne Testmaterialien für 72 h in 10 % RPMI 1640-Medium unter 5 % CO2 in der Luft kultiviert, in dreifacher Ausführung für jede Kultur. Die Zahl der PFC gegen SRBC pro 106 Splenozyten wurde bestimmt [25], [26].

2.6. statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwerte ± SD ausgedrückt. Der Unterschied zwischen den getesteten Gruppen und der Kontrolle wurde durch Student's t-Test analysiert. P < 0,05="" wurde="" als="" signifikant="">

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Isolierung und Reinigung von Oligosacchariden

CDOs wurden aus dem Alkaliextrakt der getrockneten Körper von C. deserticola mit einer Ausbeute von 3,07 Prozent isoliert. Zwei Fraktionen von CDOS-1 und CDOS-2 wurden jeweils aus destilliertem Wasser als Eluat durch die Sephadex G-100-Säule isoliert (Fig. 1). Die gereinigten Fraktionen von CDOS-1 und CDOS-2 zeigten einen einzigen Peak auf der Sephadex G-25-Säule, was darauf hinweist, dass keine anderen Oligosaccharide in der Probe vorhanden waren. Die Ergebnisse der Monosaccharidzusammensetzungen zeigten, dass CDOS-1 nur aus Saccharose (Fig. 2) und CDOS-2 hauptsächlich aus Saccharose, Rhamnose und Mannitol (Fig. 3) mit einem Molverhältnis zusammengesetzt war von 1:0,73:3,61.

3.2. Immunbiologische Aktivitäten von CDOs

Zahlreiche In-vivo- und In-vitro-Beweise haben gezeigt, dass natürliche Oligosaccharide eine immunmodulierende Funktion zeigen, indem sie sowohl zellulär als auch humoral stimulierenimmun Antworten[27], [28]. In dieser Veröffentlichung erhöhten 100 mg/kg/KG CDOs den Milzindex der Maus, aber es gab keine signifikanten Unterschiede im Thymusindex zwischen den behandelten Gruppen und den Kontrollgruppen (Tabelle 1). Makrophagen sind eine wichtige Komponente der Wirtsabwehr gegen virale Infektionen, indem sie die intrazelluläre Replikation von Viren hemmen und virusinfizierte Zellen abtöten [29]. Bei Aktivierung werden eine Vielzahl von Sauerstoff- oder Stickstoff-Zwischenprodukten und Zytokinen aus Makrophagen freigesetzt und nehmen an verschiedenen wichtigen biologischen Funktionen teil, wie z. B. entzündungshemmende und Antitumoraktivitäten [30]-[32]. Daher ist die phagozytische Aktivität von Makrophagen ein wichtiger Indikator für die Immunfunktionen des Organismus. In dieser Studie erhöhten die moderaten und hohen Dosen von CDOs die Phagozytose-Aktivität von Makrophagen (Tabelle 1). Die Proliferation von Antikörper produzierenden Zellen, die durch CDOs induziert wurde, wurde durch Untersuchung des Anstiegs der hämolytischen PFC in der Milz von Kunming-Mäusen untersucht, die mit SRBC plus der Testprobe immunisiert wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass moderate und hohe CDO-Dosen die Proliferation von Antikörper-produzierenden Zellen signifikant steigern (Tabelle 2). Hohe CDO-Dosen verursachten einen hochsignifikanten Anstieg der PFC-Zahl (P <>

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