Umfassende Analyse der Pyroptose-Regulatoren und der Tumor-Immun-Mikroumgebung beim klarzelligen Nierenzellkarzinom

Für mehr Information. Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt

Hintergrund: Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass Pyroptose das regulieren könnteTumor-Immunmikroumgebung(TIME) um die Tumorentwicklung zu beeinflussen. Als hochimmunogener Tumor kann das klarzellige Nierenzellkarzinom (ccRCC) von einer Immuntherapie profitieren, aber die damit verbundene Forschung zur Pyroptose in der Zeit des ccRCC ist noch unzureichend.

Methoden: Verfügbare Daten aus TCGA- und GEO-Datenbanken wurden analysiert, um die unterschiedlichen Expressionsprofile von Pyroptose in ccRCC und normalen Geweben zu identifizieren, und die Korrelation von Pyroptose-Regulatoren mit TIME wurde in cCRCC bewertet.

Ergebnisse: Gemäß der Konsensus-Clustering-Analyse wurden zwei unterschiedliche Expressionsniveaus von Subtypen identifiziert, die die Patientenprognose beeinflussen und mit dem histologischen Tumorstadium und -grad in Zusammenhang stehen. Immunzellen wurden durch den CIBERSORT-Algorithmus berechnet. In Cluster 1 wurden höhere infiltrierte Niveaus von B-Zellen, naiven T-Zellen, CD4-Gedächtnisruhe, NK-Zellen, Monozyten und Makrophagen beobachtet, während in Cluster 2 höhere infiltrierte Niveaus von CD8 plus T-Zellen, follikulären T-Helferzellen und Tregs beobachtet wurden Die Genset-Anreicherungsanalyse zeigte, dass Cluster 2 in mehreren immunbezogenen Signalwegen, einschließlich des JAK-STAT-Signalwegs, angereichert war. Darüber hinaus war die Überexpression von acht Immun-Checkpoints mit der ccRCC-Entwicklung verbunden, insbesondere in Cluster 2. Als vier potenziell wichtige Pyroptose-Regulatoren wurde durch RT-qPCR-Analyse bestätigt, dass AIM2, CASP5, NOD2 und GZMB in ccRCC hochreguliert sind, und durch die weiter verifiziert HPA-Datenbank. Eine weitere Pan-Krebs-Analyse deutete darauf hin, dass diese vier Pyroptose-Regulatoren bei mehreren Krebsarten unterschiedlich exprimiert wurden und mit der TIME in Beziehung standen.

Fazit: Die vorliegende Studie lieferte einen umfassenden Überblick über Pyroptose-Regulatoren in der TIME von ccRCC, was einen potenziellen Wert für die Immuntherapie bieten könnte.

Schlüsselwörter: Klarzelliges Nierenzellkarzinom, Pyroptose, Tumor-Immun-Mikroumgebung, Immun-Checkpoints, Immuntherapie

Klicken Sie hier, um zu erfahren, dass Herba-Cistanchen die Nierenfunktion behandeln

Hintergrund

Nierenzellkarzinom(RCC) ist der häufigste bösartige solide Tumor der Niere bei Erwachsenen und macht etwa 3 Prozent aller bösartigen Erkrankungen bei Erwachsenen und 90 Prozent aller bösartigen Nierenerkrankungen aus[1]. Gegenwärtig hat die Zahl der Todesfälle aufgrund von RCC jedes Jahr weltweit 1,00,000 überschritten, und die Morbiditäts- und Mortalitätsraten steigen alle 10 Jahre mit einer Rate von 2-3 Prozent [2]. Die Inzidenz des klarzelligen Nierenzellkarzinoms (ccRCC) beträgt nach der Version 2004 der RCC-Pathologieklassifikation der WHO etwa 70 Prozent [3]. Obwohl die chirurgische Resektion immer noch die beste Behandlung für ccRCC ist, gibt es derzeit keine wirksame postoperative adjuvante Behandlung, und ccRCC ist nicht empfindlich gegenüber Strahlen- und Chemotherapie. Laut Literatur kommt es bei 20-40 Prozent der Patienten nach einer Operation zu einem Rezidiv [4]. Als hochimmunogener Tumor kann ccRCC von einer Immuntherapie profitieren.

Pyroptose ist eine Art programmierter Zelltod, der von begleitet wirdEntzündungausgelöst durch eine Infektion mit pathogenen Mikroorganismen oder andere schädliche Signale [5]. Die Pyroptose ist hauptsächlich durch Zellschwellung, Lyse und Freisetzung von zytoplasmatischem Inhalt gekennzeichnet. Eine angemessene Pyroptose ist ein wichtiger Mechanismus für den Wirt, um einer Infektion durch fremde pathogene Mikroorganismen zu widerstehen. Übermäßige Pyroptose ist jedoch für den Wirt schädlich oder sogar tödlich. Immer mehr Studien belegen, dass die Pyroptose auch bei der Entstehung von Tumoren eine wichtige Rolle spielt [6]. Die Pyroptose schafft durch die Freisetzung von Entzündungsfaktoren ein tumorhemmendes Milieu. Pyroptose kann jedoch auch die Immunfunktion des Körpers gegenüber Tumorzellen schwächen und das Wachstum von Tumoren bei verschiedenen Krebsarten beschleunigen. Einige Studien haben gezeigt, dass die effektive proinflammatorische Wirkung der Pyroptose mit der Regulierung der Mikroumgebung des Tumorimmunsystems zusammenhängt [7]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Pyroptose eine wichtige Rolle bei der Tumorentwicklung und dem Antitumorprozess spielt. Die Auswirkung der Pyroptose auf die Prognose des ccRCC ist jedoch unklar. Ein umfassendes Verständnis der Pyroptose bei ccRCC fehlt noch, einschließlich der Wechselwirkung zwischen Pyroptose-Regulatoren und der Mikroumgebung des Tumorimmunsystems.

In der vorliegenden Studie haben wir eine umfassende retrospektive Analyse basierend auf der Datenbank The Cancer Genome Atlas (TCGA) und der Gene Expression Omnibus Database (GEO) durchgeführt, um den Einfluss der Pyroptose auf die TIME abzuschätzen und die zugrunde liegenden Mechanismen zwischen Pyroptose und individueller TIME weiter zu untersuchen Charakterisierungen basierend auf der Konsensus-Cluster-Analyse. Darüber hinaus verifizierte die vorliegende Studie auch die Beziehung zwischen Pyroptose und Immun-Hot-Checkpoint-Expression.

Materialen und Methoden

Datenerfassung und Identifizierung der differentiellen Expression

Die RNA-Sequenzierungsdaten (RNA-seq) von 539 ccRCC-Geweben und 72 normalenNiereGewebe sowie die entsprechenden klinischen Merkmale aus der TCGA-Datenbank (https://portal.gdc.cancer.gov/) bezogen wurden. Die GSE46699- und GSE53757-Daten aus der GEO-Datenbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) wurden gesammelt und zur Bewertung der Pyroptose-Regulator-Expression verwendet. Darüber hinaus wurden TCGA-Pan-Krebs-Genexpressionsdaten für 33 Arten von bösartigen Tumoren und entsprechende klinische Informationen, wie Stemness-Scores basierend auf mRNA (RNAss) und DNA-Methylierung (DNAss) sowie Immunsubtypen, von der Universität erhalten Kalifornische Santa Cruz-Datenbank (UCSC Xena, http://xena.ucsc.edu/). Die 37 Pyroptose-Regulatoren sind in der zusätzlichen Datei 4: Tabelle S1 dargestellt und wurden aus früheren Untersuchungen extrahiert [8, 9]. Durch die Verwendung des "limma"-Pakets, mehr als zweifache Änderungen und eine falsche Entdeckungsrate (FDR, angepasster p-Wert)<0.05 is="" considered="" differential="" gene="" expression.="" the="" immunohistochemistry="" (ihc)="" staining="" images="" of="" pyroptosis="" regulators="" in="" normal="" kidney="" and="" tumor="" tissues="" were="" analyzed="" and="" obtained="" from="" the="" hpa="" database="" (http://www.proteinatlas.org/).to="" compare="" the="" expression="" between="" normal="" and="" tumor="" samples,="" all="" tissues="" were="" selected="" using="" the="" same="">

Konsens-Clustering

Univariate Cox-Regressionsanalyse wurde verwendet, um Pyroptoseregulatoren über den R-Paket-"Überlebens"-p-Wert zu extrahieren<0.05). consensus="" clustering="" was="" performed="" to="" explore="" the="" potential="" molecular="" subtype="" between="" the="" bca="" patients="" using="" the="" r="" package"consensus="" cluster="" plus".="" the="" cluster="" count="" (k)="" was="" set="" from="" 1="" to="" 9,="" and="" the="" best="" optimal="" k="" value="" was="" selected="" for="" further="">

Schätzung der Tumor-Immunmikroumgebung

CIBERSORT, ein Analysetool, das auf der LM22-Immungensignatur basiert, wurde verwendet, um die Tumorimmuninfiltrationsniveaus von ccRCC zu bewerten. Der Algorithmus wurde für 1000 Permutationen und ccRCC-Samples mit einer Ausgabe P ausgeführt<0.05 were="" selected="" for="" further="" analysis.="" the="" "estimate"="" package="" in="" r="" was="" used="" to="" evaluate="" the="" immune="" score="" and="" the="" stromal="" score.="" moreover,="" 8="" com-mon="" immune="" checkpoint="" genes,="" including="" pd-1,="" pd-l1,="" pd-l2,="" ctla4,="" siglec15,="" tigit,="" tim3,="" and="" lad3,="" were="" extracted="" and="" evaluated="" for="" their="" correlations="" with="" pyroptosis="" regulators="" in="">

Funktionelle Anreicherungsanalyse

Gene Ontology (GO)-Analyse und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Signalweganalyse wurden unter Verwendung des „Cluster Profiler“-Pakets in R durchgeführt. Zusätzlich wurde Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) durchgeführt, um die Unterschiede im Satz von zu identifizieren Gene, die zwischen den beiden Clustern in der Anreicherung des KEGG-Signalwegs exprimiert werden. Die Anzahl der Permutationen wurde 1000 Mal durchgeführt

jeder Analyse und die Pfade mit angepasstem p-Wert<0.05 and="" q="" values=""><0.05 were="" considered="" statistically="">

Vorhersage des Ansprechens auf Medikamente

Basierend auf den Informationen aus der Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC)-Datenbank (https://www.cancerrxgene.org/) wurden die chemotherapeutischen Sensitivitäten für ccRCC berechnet. Drei gängige klinische Arzneimittel wurden ausgewählt, um das chemotherapeutische Ansprechen vorherzusagen, und das R-Paket „pRRophetic“ wurde verwendet, um das chemotherapeutische Ansprechen abzuschätzen, das durch die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) bestimmt wurde.

Zelllinien und RT-qPCR-Analyse

Die menschlichen ccRCC-Zelllinien 786-O und Caki-1 wurden von Haixiang Shen bereitgestellt, und die normale menschliche Nierenkortex-Epithelzelllinie HK-2 wurde von Yanhong Ma.RPMI bereitgestellt 1640-Medium (Gibco), ergänzt mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (FBS, Gibco), wurde verwendet, um die Zellen zu kultivieren. Und alle Zellen wurden bei 37 Grad mit 5 Prozent Kohlendioxid kultiviert. Gesamt-RNAs wurden aus den Zellen mit dem Trizol-Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Der erste Strang (cDNA) wurde revers transkribiert und als Matrize für die qPCR-Analyse verwendet, wie zuvor beschrieben [10]. Die Expressionsniveaus von Pyroptose-Regulatoren (AIM2, NOD2, GZMB und CASP5) wurden mit einem SYBR Green qPCR Kit (Takara, Japan) gemessen. Der Genname und die Primersequenzen sind in der zusätzlichen Datei 5 aufgeführt: Tabelle S2. Die mRNA-Spiegel aller Gene wurden auf GAPDH (eine endogene Normalisierungsreferenz) normalisiert.

statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit der R-Software (http://www.R-project.org, Version 4.0.3), der Programmiersprache PERL (Version 5.32.1.1, https://www.perl.org /) und GraphPad Prism 8.0. Korrelationskoeffizienten wurden durch Spearmen und Distanzkorrelationsanalysen berechnet. Kaplan-Meier-Kurven wurden aufgetragen, und ein Log-Rank-Test wurde verwendet, um den signifikanten Überlebensunterschied zu berechnen. Der Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test wurde verwendet, um kontinuierliche Variablen zu analysieren, während der Chi-Quadrat-Test verwendet wurde, um die kategorialen Daten zu analysieren. Die RT-qPCR-Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch einfache ANOVA bewertet, gefolgt von dem Ad-hoc-Dunnett-Mehrfachvergleichstest zum Vergleich mit normalen Nierenzellen. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde für alle Analysen als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Identifizierung und Klassifizierung von differentiell Pyroptose-assoziierten Regulatoren

Die Expression von 37 Pyroptose-assoziierten Genen wurde in der TCGA-KIRC-Kohorte verglichen, und 11 Gene wurden als differentiell exprimierte Gene identifiziert (Abb. 1A). Nachdem zwei unabhängige Datensätze aus der GEO-Datenbank verwendet wurden, um die Expression dieser 11 Gene in ccRCC extern zu veranschaulichen, wurde gezeigt, dass sechs Pyroptose-assoziierte Regulatoren (AIM2, CASP5, NLRP3, NOD2, GZMA und GZMB) in ccRCC stark exprimiert werden (Abb .1B). In Kombination mit prognostischen Patienteninformationen, die aus TCGA-Datensätzen heruntergeladen wurden, wurde dann eine univariate Cox-Regression implementiert, um Gene von diesen 6 Regulatoren zu screenen, und vier von ihnen (AIM2, CASP5, NOD2 und GZMB) standen in signifikantem Zusammenhang mit der ccRCC-Patientenprognose (Abb. 1C). . Um die Beziehung zwischen der Expression dieser 4 Regulatoren und ccRCC-Subtypen weiter zu untersuchen, wurde eine Konsens-Clustering-Analyse mit TCGA-KIRC-Kohortenpatienten durchgeführt. Die Konsens-Clustering-Analyse wurde mit ccRCC-Patienten basierend auf diesen vier Pyroptose-Regulatoren durchgeführt, und das Ergebnis zeigte, dass die Clustering-Variable (k) =2 als die höchste Clustering-Stabilität von k =1 bis 9 identifiziert wurde, was darauf hinweist dass ccRCC-Patienten in zwei Cluster mit den höchsten Intragruppen-Korrelationen und den niedrigsten Intergruppen-Korrelationen eingeteilt werden konnten (Abb. 1D). Darüber hinaus hatten Patienten in Cluster 1 ein günstigeres Gesamtüberleben (OS) im Vergleich zu Patienten in Cluster 2 (Abb. 1E).

TIME-Analyse der Cluster nach den Pyroptose-Regulatoren

Um zu untersuchen, welche Signalwege in den Clustern angereichert sind, wurde eine GSEA-Analyse durchgeführt, um die signifikanten KEGG-Signalwege zu identifizieren, die mit den beiden Clustern assoziiert sind. Die Ergebnisse zeigten, dass Zytokin-Rezeptor-Interaktion, T-Zell-Rezeptor-Signalweg, Antigen-Prozessierung und -Präsentation, Chemokin-Signalweg, natürliche Killerzellen-vermittelte Zytotoxizität, Toll-like-Rezeptor-Signalweg, B-Zell-Rezeptor-Signalweg und JAK-STAT-Signalweg Signalweg waren signifikant mit Cluster 2 verwandt (zusätzliche Datei 1: Abbildung S1), was darauf hindeutet, dass die Cluster, die Pyroptose-Regulatoren enthalten, mit der Mikroumgebung des Tumorimmunsystems assoziiert waren. Um den Unterschied in der Immunfunktion zwischen den beiden Clustern zu untersuchen, wurden daher ESTIMATE-Scores berechnet und gezeigt, dass Cluster 2 im Vergleich zu Cluster 1 (Abb. 2A) signifikant höhere ESTIMATE-, Stroma- und Immun-Scores aufwies und die vier Pyroptose-Regulatoren positiv waren im Zusammenhang mit diesen Werten (Abb. 2B). Darüber hinaus zeigten die beiden Cluster signifikante Unterschiede in der Immunzellinfiltration (Abb. 2C). Cluster 1 wies höhere infiltrierte Niveaus von naiven B-Zellen, T-Zellen CD4-Speicher ruhend, NK-Zellen ruhend, Monozyten, Makrophagen M0, Makrophagen M2, aktivierten dendritischen Zellen und ruhenden Mastzellen auf, während Cluster 2 höher war im Zusammenhang mit Plasmazellen, CD8-T-Zellen, gedächtnisaktivierten T-Zellen, follikulären Helfer-T-Zellen, regulatorischen T-Zellen (Tregs), Gamma-Delta-T-Zellen und aktivierten NK-Zellen. Die Analyse der Korrelation zwischen den vier Regulatoren und Immunzelltypen zeigte, dass die vier Regulatoren eine positive oder negative Korrelation mit den meisten Immunzelltypen aufwiesen (Abb. 2D). Interessanterweise ergaben weitere Untersuchungen zur unterschiedlichen Expression von Immungenen zwischen zwei Clustern, dass eine Masse von Immungenen in Cluster 2 hochreguliert wurde, während nur 5 Gene herunterreguliert wurden (Zusatzdatei 2: Abbildung S2A). Die 10 am stärksten hoch- und herunterregulierten Gene wurden ausgewählt, um die Korrelation zu analysieren, und das Ergebnis ist in der zusätzlichen Datei 2 dargestellt: Abbildung S2B. Die GO-Analyse biologischer Prozesse zeigte, dass die unterschiedliche Expression von Immungenen zwischen Clustern bei der Aktivierung des Zelloberflächenrezeptor-Signalwegs und der Signaltransduktion angereichert warImmunreaktion. Die Analyse der zellulären Komponenten zeigte, dass die differentiell exprimierten Immungene im Immunglobulinkomplex reichlich vorhanden waren. Molekulare Funktionsanalysen zeigten, dass die differentiell exprimierten Immungene an einer Antigenbindung beteiligt waren. Die KEGG-Analyse zeigte, dass die unterschiedlich exprimierten Immungene an Zytokin-Zytokin-Rezeptor-Wechselwirkungen angereichert waren (Zusatzdatei 2: Abbildung S2C, D). Diese Ergebnisse zeigten, dass Cluster 2 und die vier Regulatoren an der Tumor-Immunmikroumgebung beteiligt sind.

Assoziation von Pyroptose-Regulatoren mit den Immun-Checkpoint-Inhibitoren und den zielgerichteten Arzneimittelsensitivitäten Therapien mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICI) haben sich als wirksame Behandlungsoption für mehrere Tumorarten etabliert, während nur ein Bruchteil der Patienten von einer solchen Therapie profitiert. Daher wurde die differentielle Expression von ICIs in verschiedenen Subtypen weiter untersucht. Acht heiße Immun-Checkpoint-Gene (SIGLEC15, TIGIT, PD-L1, TIM3, PD-1, CTLA4, LAG3 und PD-L2) waren positiv mit Cluster 2 verwandt (Abb. 3A, B). Interessanterweise waren vier Aufsichtsbehörden eng mit den meisten ICIs verbunden, während es keine signifikante Beziehung zwischen GZMB und SIGLEC15 gab (Abb. 3C). Darüber hinaus zeigten Sunitinib und Temsirolimus unter Berücksichtigung des klinischen Behandlungswerts in Bezug auf die Empfindlichkeit der Zielarzneimittel eine höhere Empfindlichkeit in Cluster 1, während Axitinib eng mit Cluster 2 verwandt war (Abb. 3D-F). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass diese Klassifikation einen gewissen Referenzwert für die klinische Medikation verschiedener ccRCC-Patienten liefern kann.

Stratifizierungsanalyse des klinischen Nutzens des Clusters Um den klinischen Wert der Beziehung zwischen dieser Klassifikation und verschiedenen klinischen Merkmalen weiter zu untersuchen, wurden ccRCC-Patienten in verschiedene Gruppen nach Patientenalter, Geschlecht, Grad und Krankheitsstadium eingeteilt. Es ist erwähnenswert, dass das höhere Krankheitsstadium stärker mit den Patienten in Cluster 2 sowie dem pathologischen Grad assoziiert war (Tabelle 1; Abb. 4B). Eine weitere Analyse der Beziehung zwischen Pyroptose-Regulatoren und klinischen Merkmalen zeigte, dass das Expressionsniveau der vier Regulatoren mit zunehmendem Krankheitsstadium und pathologischem Grad anstieg, während nur AIM2 bei Männern stärker exprimiert wurde als bei Frauen. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen der Expression der vier Regulatoren und dem Patientenalter (Abb. 4A).

Experimentelle Überprüfung der Expression der vier Regulatoren Basierend auf der bioinformatischen Analyse der Expression dieser vier Regulatoren analysierten wir die mRNA- und Proteinexpressionsniveaus. Im Vergleich zu normalen Zellen waren die Expressionsniveaus dieser 4 Gene in den beiden ccRCC-Zelllinien in unterschiedlichem Maße hochreguliert (Abb. 5A). Entsprechend zeigten die Proteinexpressionsmuster von AIM2, NOD2 und GZMB aus der HPA-Datenbank, dass die Regulatoren auch in ccRCC-Gewebe im Vergleich zu normalem Gewebe überexprimiert wurden (Abb. 5B).

Vier Pyroptose-Regulator-Expressionsmuster bei mehreren Krebsarten

Eine weitere Untersuchung des Expressionsmusters dieser vier Pyroptose-Regulatoren bei Pankrebs zeigte, dass vier Pyroptose-Regulatoren bei mehreren Krebsarten unterschiedlich exprimiert wurden (Abb. 6A). AIM2 wurde bei mehreren Krebsarten, einschließlich Blase, Brust, Speiseröhre, Niere und Leber, unterschiedlich exprimiert , Lunge, Magen und Endometrium sowie CASP5, NOD2 und GZMB (Abb. 6A). Weitere Analysen ergaben, dass AIM2 am positivsten mit HNSC in Beziehung stand, während CASP5 in negativer Beziehung zu COAD stand (Abb. 6B). Und AIM2 und GZMB waren die beiden Gene mit der signifikantesten positiven Assoziation (Korrelationskoeffizient =0.59, Abb. 6C).

Während der Krebsprogression können Tumorzellen allmählich einen differenzierten Phänotyp verlieren und Vorläufer- und stammzellähnliche Merkmale erwerben[11]. Im Allgemeinen können die RNAss und die DNAss verwendet werden, um die Stammhaftigkeit von Krebsstammzellen zu beurteilen [12]. Daher wurde die Korrelation zwischen Pyroptose-Regulatoren und Tumorstammstärke, gemessen durch RNAss und DNAss, untersucht. Die vier Regulatoren waren bei den meisten Pankrebsen signifikant positiv oder negativ mit RNAss und DNAss korreliert (Fig. 6D). Bemerkenswerterweise waren AIM2 und GZMB in KIRC positiv bzw. negativ mit RNAs assoziiert, während NOD2 negativ mit DNAss assoziiert war (Zusatzdatei 3: Abbildung S3).

Assoziation der vier Pyroptose-Regulatoren mit der Tumor-Immun-Mikroumgebung bei Pan-Krebs

Basierend auf der wichtigen regulatorischen Wirkung von Pyroptose-Genen auf verschiedene Immunzelltypen wurden die vier Regulatoren in der Pan-Krebs-Mikroumgebung weiter untersucht. Außer dass AIM2 negativ mit DLBC assoziiert war und CASP5 negativ mit COAD und READ im ESTIMATE-Score und Stroma-Score assoziiert war, waren andere interessanterweise positiv mit Krebserkrankungen im Immun-Score, Stroma-Score und ESTI-MATE-Score assoziiert (Abb. 7A ). Um die Expression der vier Pyroptose-Regulatoren in verschiedenen Immunsubtypen bei Pankrebs zu untersuchen, wurden Immuninfiltrate zur Analyse in sechs Typen unterteilt, die jeweils von tumorfördernd bis tumorunterdrückend sind, einschließlich Wundheilung, IFN-y-dominant, entzündlich, Lymphozyten erschöpft, immunologisch ruhig und TGF-dominant. Interessanterweise waren die vier Pyroptose-Regulatoren alle signifikant mit Immunsubtypen verwandt, und die vier Pyroptose-Regulatoren wurden am stärksten in IFN-y-dominant exprimiert, gefolgt von TGF-dominant (Abb. 7B). In KIRC war jedoch die Expression der vier Pyroptose-Regulatoren in C2 am höchsten, ebenso wie in der Pan-Krebs-Analyse. AIM2, das die zweithöchste Expression in Immunsubtypen aufwies, war mit Cl verwandt, während NOD2, CASP5 und GZMB mit C6 verwandt waren (Abb. 2E).

Diskussion

Die chirurgische Resektion ist die erste Behandlung des Nierenzellkarzinoms in unserer klinischen Praxis. Es ist jedoch immer noch schwierig, Metastasen von Nierenzellkarzinomen zu entfernen. Metastasiertes Nierenzellkarzinom ist resistent gegen Strahlentherapie und systemische Therapie, einschließlich Hormontherapie, und Chemotherapie [13]. Eine klinische Studie mit Nivolumab, einem Anti-PD-L1-Immun-Checkpoint-Inhibitor, zur Behandlung von metastasiertem ccRCC (CheckMate-025) hat gezeigt, dass Nivolumab ein signifikant besseres OS, eine bessere Risikoquote, ORR und Gesamtansprechrate aufweist [ 14]. Diese Studien zeigen, dass die Anwendung der Immuntherapie bei der Behandlung von ccRCC große Aussichten hat. Eine eingehende Analyse der Heterogenität der ccRCC TIME kann helfen, ein präzises und individualisiertes Immuntherapiemanagement bereitzustellen, um den Behandlungseffekt und die Qualität der Überlebensprognose des Patienten zu verbessern. Hier wurden ccRCC-Patienten in zwei unabhängige molekulare Subtypen mit unterschiedlichen klinischen Merkmalen, Immungenexpression und TIME durch Konsens-Clustering für vier Hauptregulatoren der Pyroptose getrennt. Der vorliegenden Studie zufolge hatte Cluster 2 eine schlechtere Prognose als Cluster 1, aber Cluster 2 reagierte sensitiver auf eine Immuntherapie.

Unter den intrinsischen Todesmechanismen von Zellen hat die Pyroptose zunehmende Aufmerksamkeit erhalten. Pyroptose ist eine neu erkannte Art des programmierten entzündlichen Zelltods, der über Wege aktiviert wird, die durch klassische Caspase-1-Inflammasome oder nicht-klassische Caspase-4, Caspase-5 und Caspase{{4} vermittelt werden. } [fünfzehn]. Kürzlich aufkommende Beweise haben über die wichtige Rolle der Pyroptose bei der Tumorentstehung menschlicher bösartiger Erkrankungen berichtet [16,17]. Pyroptose hemmt das Tumorwachstum bei Kolorektalkrebs, Leberkrebs und Hautkrebs, hat aber eine wechselseitige Wirkung auf Brustkrebs [18-20]. Bei ccRCC bleibt unbekannt, wie Pyroptose-assoziierte Gene interagieren und ob sie mit der Überlebenszeit des Patienten zusammenhängen. Die Expression der meisten Pyroptose-Regulationsgene ist positiv korreliert und spielt eine wichtige prognostische Rolle beim ccRCC. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Pyroptose-Regulatoren eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Tumorentstehung und der ccRCC-Entwicklung spielen könnten. In der vorliegenden Studie wurden vier Pyroptose-Regulatoren identifiziert, die bei Nierenkrebs stark exprimiert werden und eine schlechte Prognose verursachen. AIM2 ist ein zytosolischer angeborener Immunrezeptor, der doppelsträngige DNA (dsDNA) erkennt, die während zellulärer Störungen und pathogener Angriffe freigesetzt wird. Aktiviertes AIM2 aktiviert den klassischen Weg der Pyroptose durch Caspase-1 [21]. AIM2 spielt möglicherweise eine einzigartige Rolle bei verschiedenen Krebsarten [22-25], und die vorliegende Studie zeigte, dass AIM2 eine krebsfördernde Rolle bei ccRCC spielt. Caspase-5(CASP5), ähnlich wie Caspase-4 und Caspase-1l, ist ein Exekutivprotein der Caspase-1--unabhängigen Pyroptose [26]. GZMB wird von zytotoxischen Lymphozyten als molekulare Waffe zur Abwehr virusinfizierter und bösartig veränderter Wirtszellen eingesetzt[27]. Die geringe Expression von GZMB steht im Zusammenhang mit einer frühen Metastasierung bei Darmkrebs, was auf eine Infiltration von Blutgefäßen und Nerven hindeutet [28]. Interessanterweise ergab unsere Analyse, dass GZMB ein positiv korreliertes Gen bei Nierenkrebs ist. NOD2 ist ein Mustererkennungsrezeptor, der die angeborene Immunantwort des Wirts regulieren und Entzündungen, Fettleibigkeit und Fettleibigkeit verhindern kann [29]. Durch LPS induziertes extrazelluläres Histon H3 könnte während einer Sepsis über NOD2- und VSIG4/NLRP3-Wege Pyroptose verursachen [30]. Es bleibt unbekannt, wie diese Gene während der Zellpyroptose bei ccRCC miteinander interagieren.

In unserer klinischen Praxis sind Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitoren des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGFR-TKIs) zum Behandlungsstandard für mRCC geworden [31]. Sunitinib, ein Breitband-Inhibitor von Rezeptortyrosinkinasen, wurde weithin als Behandlungsstandard für die Erstlinientherapie des fortgeschrittenen ccRCC eingesetzt [32]. Allerdings sprechen nicht alle RCC-Patienten auf die Behandlung mit Sunitinib an, und die meisten Patienten entwickeln nach einigen Behandlungsmonaten eine Resistenz gegen Sunitinib. Daher ist der Schlüssel zur Auswahl von Sunitinib für die Behandlung die Auswahl von Patienten, die auf Sunitinib ansprechen. Die vorliegende Studie zeigte, dass Cluster 1 empfindlicher auf Sunitinib reagiert, während Cluster 2 empfindlicher auf Axitinib reagiert.

Das Verständnis der Expression von Pyroptose-Regulatoren bei ccRCC vor der Behandlung kann dazu beitragen, optimiertere, gezieltere Behandlungsoptionen zum Nutzen der Patienten zu entwickeln. Einige Studien haben gezeigt, dass die effektive proinflammatorische Wirkung der Pyroptose mit der Regulierung der Mikroumgebung des Tumorimmunsystems zusammenhängt [33]. Die potenzielle Rolle der Pyroptose in der Immunmikroumgebung von ccRCC ist jedoch noch schwer zu fassen. Basierend auf den Expressionseigenschaften von Pyroptose-Regulatoren zeigte die vorliegende Studie, dass Patienten in verschiedenen Clustern unterschiedliche Korrelationen mit verschiedenen Immuninfiltrationen aufweisen. In Cluster 1 wurden höhere infiltrierte Niveaus von B-Zellen, naiven T-Zellen, CD4-Gedächtnisruhe, NK-Zellen, Monozyten, M0-Makrophagen und M2-Makrophagen beobachtet. Andererseits war Cluster 2 in Bezug auf CD8 plus höher T-Zellen, Tregs und follikuläre T-Helferzellen. Tregs können eine Vielzahl von immunsuppressiven Zytokinen sezernieren, was zur Immunflucht von Tumorzellen führt. Studien haben gezeigt, dass Tregs die Proliferation von Effektor-T-Zellen wirksam hemmen und eine hohe CD8＋-T-Zell-Infiltration ein ungünstiger Prognosefaktor für ccRCC ist [34,35]. Die schlechte Prognose von Cluster 2 und die Schlussfolgerungen dieser beiden Schlussfolgerungen stimmen miteinander überein. Cluster 2 ist positiv korreliert mit acht heißen ICIs (SIGLEC15, TIGIT, PD-L1, T IM3, PD-1, CTLA4, L AG3 und PD-L2). Basierend auf diesen Erkenntnissen können die schlechten Überlebensergebnisse von Cluster 2 durch das verringerte Niveau der Anti-Tumor-Immunität verursacht werden, und Cluster 2 könnte bei der Immuntherapie vorteilhafter sein. Die Ergebnisse von GSEA weisen darauf hin, dass Cluster 2 mit einer Vielzahl von immunregulatorischen Signalwegen in Verbindung steht. Wichtig ist, dass der JAK-STAT-Signalweg mit der Karzinogenese und Immuninfiltration von ccRCC zusammenhängt. Daher spekulierten wir, dass Pyroptose die Zusammensetzung der Mikroumgebung des Tumorimmunsystems regulieren könnte. Unsere Studie legt nahe, dass ccRCC mit hoher Expression dieser 4 Gene möglicherweise empfindlicher auf eine Immuntherapie reagieren.

Das Expressionsniveau der vier Regulatoren nahm mit zunehmendem Krankheitsstadium und pathologischem Grad zu, und es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen der Expression der vier Regulatoren und dem Patientenalter, was mit der schlechteren Prognose von Cluster 2 übereinstimmte.

Da die Pyroptose an vielen biologischen Prozessen beteiligt ist, haben wir untersucht, ob diese vier Pyroptose-Regulatoren in Cluster 2 auch bei anderen Krebsarten eine wichtige Rolle spielen. Anschließend wurde eine Gesamtkrebsanalyse durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten, dass diese vier Pyroptose-Regulatoren bei mehreren Krebsarten eng mit dem Stroma-Score, dem Immun-Score und dem ESTIMATE-Score verbunden waren. Diese Ergebnisse zeigten, dass diese vier Pyroptose-Regulatoren potenzielle Ziele für eine Vielzahl von Krebs-Immuntherapien sind und nicht auf ccRCC beschränkt sind.

In Zukunft sind weitere zuverlässige Verifizierungsanalysen in einer größeren Kohorte erforderlich. Darüber hinaus sind zusätzliche In-vitro- und In-vivo-Experimente erforderlich, um den Regulationsmechanismus zwischen Pyroptose-Regulatoren und der Mikroumgebung des Tumorimmunsystems aufzuklären.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend analysierte diese Studie systematisch das Expressionsprofil von Pyroptose-Regulatoren in ccRCC und seine Korrelation mit Immun-Checkpoints und die Rolle in der Tumor-Immun-Mikroumgebung. Die Expression von Pyroptose-Regulatoren steht in signifikantem Zusammenhang mit Immun-Checkpoints wie PD-L1 und CTLA4. Durch die konsequente Häufung von Pyroptose-Regulatoren wurden auch zwei unabhängige Subtypen etabliert. Zwischen den beiden Subtypen wurden Tumorheterogenität und Unterschiede in der Immuncheckpoint-Expression und der tumorimmunen Mikroumgebung beobachtet, was die Risikostratifizierung und präzise Behandlung von ccRCC-Patienten unterstützen wird. Eine einstufige Pan-Krebs-Analyse zeigte, dass diese Pyroptose-Regulatoren bei vielen Krebsarten eng mit dem Stroma-Score, dem Immun-Score und dem ESTIMATE-Score zusammenhängen. Wichtig ist, dass zukünftige klinische Studien und Grundlagenforschung dazu beitragen werden, Ziele für die Verbesserung der Wirksamkeit der Krebsimmuntherapie zu bestimmen.