CRISPRi-vermittelte einstellbare Kontrolle des Genexpressionsniveaus mit konstruierter Single-Guid-RNA in Escherichia coli

ABSTRAKT

Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-fach). Diese sgRNAs ermöglichten auch eine modulare Regulierung mit verschiedenen Ziel-DNA-Sequenzen. Wir haben dieses System angewendet, um den Stoffwechselfluss neu zu verteilen, um Violacein-Derivate in einem vorhersehbaren Verhältnis zu produzieren und die Lycopin-Produktion zu optimieren. Dieses System würde dazu beitragen, die Flussoptimierungsprozesse in der Stoffwechseltechnik und der synthetischen Biologie zu beschleunigen.

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EINFÜHRUNG

Das Typ II Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-assoziiertes (Cas) System ist ein RNA-gesteuertes DNA-Spaltungssystem, das aus CRISPR-RNA (crRNA), transaktivierender CRISPR-RNA (tracrRNA) und einem Cas9-Protein (1) besteht ,2). Cas9 aus Streptococcus pyogenes wird aufgrund seiner gut charakterisierten Eigenschaften häufig in der Genomtechnik eingesetzt (3,4). Der Komplex aus spCas9-Protein, tracrRNA und crRNA bindet und spaltet den Ziel-DNA-Protospacer, der zur 20 Nukleotide (nt) langen Spacersequenz der crRNA komplementär ist, in Gegenwart des 5'-NGG-3'-Protospacer-Nachbarmotivs (PAM). ) Sequenz (5,6). Um das System zu vereinfachen, kann chimäre Single Guide RNA (sgRNA) verwendet werden, bei der crRNA und tracrRNA durch einen künstlichen Linker namens Tetraloop verbunden sind (5). Es ermöglicht den Ersatz zweier separater RNAs durch ein einziges RNA-Molekül, wodurch das System besser handhabbar wird. Eines der CRISPR-basierten Systeme, CRISPR-Interferenz (CRISPRi), nutzt ein katalytisch inaktives Cas9 (dCas9), indem es bestimmte Aminosäuren aus jeder Endonukleasedomäne ersetzt (7). Durch diese Modifikation entsteht ein Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex, der die Ziel-DNA steuern und an diese binden kann und mit der RNA-Polymerase (RNAP) interferiert, um die Transkriptionsinitiierung oder -verlängerung zu hemmen (7). Im Gegensatz zu einem Knockout durch das CRISPR/Cas9-System ermöglicht CRISPR den reversiblen Knockout von Genen durch die Expression von dCas9 oder sgRNA unter einem induzierbaren Promotor, was eine größere Flexibilität bei der Genregulation ermöglicht (7). Das CRISPRi-System hat Zielgene hundertfach effektiv zum Schweigen gebracht (7,8). Die zielspezifische Genrepression ermöglicht eine Hochdurchsatz-Phänotypisierung mithilfe eines genomweiten sgRNA-Pools (9) oder leitet den Kohlenstofffluss in manipulierten Bakterien in Richtung der Zielchemikalie um (10–12). Darüber hinaus wurde Multiplex-CRISPRi in verschiedenen Wirten unter Verwendung verschiedener Methoden zur stabilen Expression mehrerer sgRNAs demonstriert, darunter lange crRNA-Arrays, Integration von Zehenschaltern und nichtrepetitive extralange sgRNA-Arrays (13–16). Diese Techniken zur gleichzeitigen Hemmung mehrerer Gene wurden verwendet, um komplexere Aufgaben zu erfüllen, beispielsweise die Reduzierung toxischer Zwischenprodukte oder die Blockierung konkurrierender Wege bei der bakteriellen Fermentation (13,16–19). Allerdings ist eine vollständige Unterdrückung für das Metabolic Engineering nicht immer wünschenswert. Die Genexpressionsniveaus sollten präzise kontrolliert werden, um eine optimale Enzymaktivität zwischen den Wachstums- und Produktionswegen zu erreichen, die intrazellulären Vorläuferkonzentrationen auszugleichen und die Anhäufung toxischer Zwischenprodukte zu vermeiden (20–22). Es wurden verschiedene Techniken entwickelt, um die Repressionseffizienz von CRISPRi zu steuern. Mehrere Faktoren wurden manipuliert, etwa die Menge an sgRNA und dCas9-Protein oder die Wahl der sgRNA. Die Steuerung der dCas9-Expression oder sowohl der dCas9- als auch der sgRNA-Expression mithilfe eines induzierbaren Promotors regulierte die Zielgenexpression um mehr als das 30--fache bzw. das 300--fache (23,24). Es wurde jedoch beobachtet, dass die Modulation der dCas9-Konzentration zu inkonsistenten Repressionseffizienzen auf verschiedenen Protospacern führen kann (23). Die begrenzte Anzahl verfügbarer induzierbarer Promotoren stellt trotz vieler Bemühungen auch eine Designherausforderung dar (25). Eine weitere Strategie ist die Insertion eines ligandenspezifischen RNA-Aptamers in die sgRNA, wobei ein kleines verwandtes Molekül den Spacer freilegen kann und so eine dosisabhängige Kontrolle von CRISPRi ermöglicht (26). Die ligandenspezifische sgRNA ist hilfreich, wenn ein geeignetes Liganden- und Aptamerpaar verfügbar ist. Auch der Abstand von der Transkriptionsstartstelle und die Ausrichtung der dCas9-Bindung beeinflussen die Effizienz von CRISPRi (7). Durch Anpassen des Abstands zwischen der sgRNA-Bindungsstelle und der Transkriptionsstartstelle kann der Weg im Metabolic Engineering optimiert werden (17,27,28). Die Hybridisierungseffizienz zwischen den Spacer- und Protospacer-Sequenzen verändert auch die Bindungseffizienz des RNP-Komplexes (29–31). Daher wurden Fehlpaarungen außerhalb der Saatregion zur Veränderung der freien Energie eingeführt, um die CRISPRi-Effizienz zu diversifizieren (31,32). Für jede neue Zielsequenz muss jedoch die sgRNA entworfen werden, und das Erreichen eines signifikanten Unterschieds in der freien Energie allein durch eine Fehlpaarung kann eine Herausforderung sein. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit einer erhöhten Off-Target-Bindung (33). Dennoch ist es immer noch darauf beschränkt, mehrere Genexpressionen modular und unabhängig von der Zielsequenz präzise zu unterdrücken. In dieser Studie haben wir ein abstimmbares CRISPRi-System entwickelt, das die Genexpression mit hoher Präzision und Vorhersagbarkeit reguliert. Durch iterative fluoreszenzbasierte Zellsortierung der sgRNA-Bibliothek, die auf Tetraloop und seine flankierende Region abzielt, erreichten wir Effizienzen der Transkriptionsrepression bis zum 45--fachen, selbst wenn die Ziel-DNA geändert wurde. Dieses System ermöglicht die vorhersehbare Umverteilung des Stoffwechselflusses ohne Manipulation des Wirtsgenoms oder der Synthesewege und stellt ein vielversprechendes Werkzeug zur Optimierung von Stoffwechselwegen dar.

MATERIALEN UND METHODEN

Bakterienstämme, Plasmide und Reagenzien

Die in dieser Studie verwendeten Escherichia coli-Stämme und Plasmide sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. Die in dieser Studie verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt. Klonverfahren werden in den ergänzenden Methoden beschrieben. Zielgene und ihre Ziel-DNA-Sequenzen für das CRISPR-System sind in der Ergänzungstabelle S3 aufgeführt. Mach1-T1R wurde für das allgemeine Klonen verwendet. Die Bibliothek wurde unter Verwendung von NEB 5-alpha Electrocompetent E. coli (NEB) erstellt. Routinekulturen zur Konstruktion von Plasmiden und Stämmen wurden bei 37 °C in Luria-Bertani (LB)-Brühe oder auf einer LB-Agarplatte mit geeigneten Antibiotika (34 g/ml Chloramphenicol, 5 0 g/ml Spectinomycin) durchgeführt. Die PCR wurde mit Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB) durchgeführt. Plasmide und PCR-Produkte wurden mit dem GeneAll® Exprep™ Plasmid SV Kit und dem Gel SV Kit (GeneAll Biotechnology) gereinigt. Repressionseffizienz von sgRNA-Mutanten Das Kulturmedium über Nacht wurde auf eine OD600 von 0,05 aufgefrischt und inkubiert, bis es einen Wert zwischen 0,6 und 0,8 erreichte. Das Kulturmedium wurde dann mit 20 ng/ml aTc auf eine OD600 von 0,05 verdünnt und 4 Stunden lang inkubiert. Die Fluoreszenz einer einzelnen Kolonie wurde bei 575 nm/616 nm mit einem Hidex Sense-Mikroplattenlesegerät (Hidex) gemessen und der OD600-Wert mit dem Jenway 7300-Spektrophotometer (Jenway) bestimmt. Die relative Fluoreszenz wurde als Fluoreszenzeinheiten pro OD600-Wert berechnet, wobei der Wert für PC auf 100 % eingestellt wurde.

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Screening der sgRNA-Bibliothek

Es wurde die gleiche Kulturmethode wie oben beschrieben verwendet. Das Kulturmedium wurde auf [Zelle] verdünnt.<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.

RNA-Extraktion

Die Gesamt-RNA wurde nur mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) extrahiert, wenn miRNeasy Mini Kit (Qiagen) zur sgRNA-Quantifizierung verwendet wurde, nach Behandlung mit RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) und Lagerung bei –80 °C. Während des Extraktionsprozesses wurde ein DNA-Verdau auf der Säule mit dem RNase-Free DNase Set (Qiagen) durchgeführt. Die DNA-Kontamination wurde durch PCR ohne reverse Transkription überprüft. Die Konzentration und Reinheit jeder Probe wurden mit einem NanoDrop One (Thermo Scientific) bestimmt und die Qualität mit einem DNA 5K/RNA/CZE 24 LabChip (PerkinElmer) auf einem LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer) bewertet.

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RT-qPCR-Analyse

Primer für RT-qPCR wurden entweder aus Laborbeständen bezogen oder mit dem Primer3Plus-Tool (34) entwickelt und sind in der Ergänzungstabelle S4 aufgeführt. Das CysG-Gen wurde als Referenzgen (35) für alle RT-qPCR-Experimente verwendet. Eine Standardkurve wurde durch 10-fache Verdünnung einer Vorlage von 107 Kopien/l auf 10−1 Kopien/l erstellt. Die Quantifizierungsgrenze wurde durch Anpassen der Kopienzahl und der positiven Amplifikationsrate an eine Sigmoidfunktion und Berechnen des 95 % positiven Kopienzahlwerts bestimmt. Der lineare Dynamikbereich wurde als die niedrigste Kopienzahl definiert, bei der die zurückberechnete Cq-Variation weniger als 35 % beträgt. Cq-Werte über 30 oder solche, die in der Nicht-Template-Kontrolle nicht verstärkt wurden, wurden validiert. Standardkurvendaten sind in der Ergänzungstabelle S5 und der Ergänzungsabbildung S1 verfügbar. Insgesamt wurden 2,5 ng Gesamt-RNA in einer 10-l-RT-qPCR-Reaktion mit dem Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB) verwendet. Die RT-PCR wurde dreifach auf dem StepOnePlus™ RealTime PCR System (Applied Biosystems) mit den folgenden Schritten durchgeführt: (i) Reverse Transkription bei 55 °C für 10 Minuten, gefolgt von Denaturierung bei 95 °C für 1 Minute; (ii) 40 thermische Zyklen bei 95◦C für 10 s und 60◦C für 1 Minute; (iii) Schmelzkurvenanalyse bei 95◦C für 15 s und 60◦C für 1 Minute, gefolgt von einem Anstieg von 60◦C auf 95◦C mit einer Geschwindigkeit von 0,3◦C/min. Die relative Quantifizierung der RNA wurde mit der Delta-DeltaCt-Methode (36) bestimmt und mit der StepOnePlus™ Software (Applied Biosystems) analysiert.

RNA-Sequenzierung (RNA-seq) und Datenanalyse

1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}}.92 basierend auf FPKM (Fragmente pro Kilobase von Transkripten pro Million zugeordneter Lesevorgänge). Differenziell exprimierte Gene wurden ab einem Schwellenwert von 1,5 (log2-basiert) und 0,01 (q-Wert) erhalten.

Herstellung und Probenahme von Proviolacein und Prodeoxyviolacein

Für die Produktion von Violacein und Prodesoxyviolacein wurde die folgende Medienzusammensetzung verwendet: 10,7 g/l K2HPO4, 5,2 g/l KH2PO4, 1 g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { {17}},2 g/l Hefeextrakt und 1{{20}} g/l Glucose. Ein Kulturmedium über Nacht wurde auf eine OD600 von 0,1 aufgefrischt und kultiviert, bis die OD600 einen Wert zwischen 0,6 und 0,8 erreichte. Das Kulturmedium wurde dann auf eine OD600 von 0,1 verdünnt und mit 500 ng/ml aTc, 0,05 mM IPTG und 0,1 g/l L-Tryptophan auf ein Endvolumen von 5 ml ergänzt. 300 l Kulturmedium wurden beprobt und 5 Minuten lang bei 14 000 U/min zentrifugiert, um ein Zellpellet für die HPLC-Analyse zu erhalten, und 300 l Kulturmedium wurden für die RNA-Extraktion beprobt.

HPLC-Analyse

Für die Analyse des Biosynthesewegs von Violacein wurde das Zellpellet in einem Volumen von {{0}}Methanol resuspendiert, 5 Minuten lang beschallt, zentrifugiert und durch einen 0,22-m Nylonfilter filtriert. Die HPLC-Analyse folgte der Methode (42) mit Poroshell 120 EC-C18, 4,6 × 150 mm, 4 m Säule (Agilent). Zwei mobile Phasen, A mit 0,1 % Ameisensäure in DDW und B mit 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril, wurden bei einer Flussrate von 0,6 ml/min mit dem folgenden Gradientenprofil verwendet: 95 % A für 1,5 Minuten, Anstieg von A von 95 % auf 2 % für 4 Min., Aufrechterhaltung von 2 % A für 2 Min., A-Anstieg von 2 % auf 95 % für 30 Sek. und Aufrechterhaltung von 95 % A für 10 Min. Die Proben wurden mit einem PDA-Detektor detektiert und die HPLC-Fläche wurde bei 600 nm für Violacein und 610 nm für Prodesoxyviolacein bestimmt.

Herstellung und Probenahme von Lycopin

Für die Lycopinproduktion wurde die folgende Medienzusammensetzung verwendet: 13,56 g/l Na2HPO4,6 g/l KH2PO4,2 g NH4Cl, 1 g NaCl, 2 ml 1 M MgSO4, 0,1 ml 1 M CaCl2 und 4 g/l Glukose (22). Es wurden 27 g/ml Chloramphenicol und 50 g/ml Spectinomycin verwendet. Ein Kulturmedium über Nacht wurde auf eine OD600 von 0,1 auf ein Endvolumen von 5 ml aufgefrischt. Als die OD600 einen Wert zwischen 0,5 und 0,6 erreichte, wurde aTc bis zur Endkonzentration von 500 ng/ml zugegeben, und als die OD600 einen Wert zwischen 0,9 und 1 erreichte, wurde IPTG bis zur Endkonzentration von 0,02 mM zugesetzt. Lycopin wurde mit Aceton extrahiert, wie in Referenz (22) beschrieben. Die Lycopinkonzentration wurde aus der Absorption bei 475 nm unter Verwendung eines Jenway 7300-Spektrophotometers unter Verwendung einer Standardkurve ermittelt. Für die RNA-Extraktion wurden 300 l Kulturmedium entnommen.

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RESULTATE UND DISKUSSION

Die Auswirkungen der Mutationen in sgRNA auf die Repressionseffizienz des CRISPR-Systems

Das CRISPRi-System kann die Genexpression unterdrücken, wenn der ternäre dCas9-sgRNA-DNA-Komplex stark aneinander bindet. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Repressionseffizienz des CRISPRi-Systems durch Modulation der RNP-Komplexbildung auf ein bestimmtes Niveau verändert werden könnte. Um die Repressionseffizienz des CRISPR-Systems zu quantifizieren, haben wir ein Fluoreszenz-Berichtssystem entwickelt, das auf dem genetischen Schaltkreis basiert, bei dem dCas9 aus S. pyogenes durch Anhydrotetracyclin (aTc) induziert wird und sowohl Reportergen- (mCherry) als auch sgRNA-Varianten konstitutiv exprimiert werden (Abbildung 1A). Sobald aTc dem Medium hinzugefügt wird, blockiert der ternäre dCas9-sgRNA-DNA-Komplex die Transkription des Reportergens, und der Fluoreszenzpegel zeigt umgekehrt die Repressionseffizienz des CRISPR-Systems an. Die sgRNA enthält insgesamt 96 Nukleotide (nts). Die Spacer-Region (die ersten 20 Nts) bindet an die Ziel-DNA-Sequenz und die anderen 76 Nts tragen zur Komplexbildung und Stabilität bei. Da Fehlpaarungen in der Spacer-Region an Spezifität verlieren und Off-Target-Effekte im CRISPR-basierten System verstärken können (33,43), beträgt die maximale Länge der sgRNA, die manipuliert werden kann, 76 nts. In diesem Fall sollte eine Bibliotheksgröße von 476 (ungefähr 1045) erreicht werden, diese ist jedoch zu groß, um erstellt zu werden. Daher ist es erforderlich, die Größe der Bibliothek durch die Bestimmung spezifischer Positionen auf der sgRNA einzugrenzen. Wir untersuchten zunächst, wie sich Mutationen in der sgRNA in jeder Region auf die Repression im CRISPR-System auswirken. In einer früheren Studie wurde berichtet, dass Mutationen im Stamm-Loop 1 (sg mut01 und sg mut02) zu einer signifikanten Abnahme der Nukleaseaktivität von Cas9 führten, während Mutationen im Stamm-Loop 2 (sg mut03) oder Stamm-Loop 3 (sg mut04) hatte keinen Einfluss auf seine Aktivität (44). Eine rekonstruierte sgRNA (sg mut05), die Mutationen in der Stamm-Loop-1-Region und den Wiederholungs-, Tetraloop-, Anti-Repeat- und Stamm-Loop-2-Regionen enthielt, verringerte ebenfalls die Nukleaseaktivität (44). Im CRISPRi-System hatten jedoch alle fünf sgRNA-Varianten im Vergleich zur Wildtyp-sgRNA (sg WT) nur geringe Auswirkungen auf die Repressionseffizienz, wobei jede Variante im Vergleich zur Positivkontrolle ohne Spacer-Region ein Fluoreszenzniveau von 2–4 % aufwies ( sg PC) (Abbildung 1B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Bildung des dCas9-sgRNA-Komplexes im CRISPRi-System im Gegensatz zum CRISPR/Cas9-System weniger empfindlich auf Sequenzmodifikationen in der Stamm-Loop-1-Region reagiert. Wir stellten die Hypothese auf, dass das Entfernen von Regionen, die mit der Stabilität des Komplexes zusammenhängen, ein Ausgangspunkt für die weitere Kontrolle der Expression auf mehreren Ebenen sein kann. Zu diesem Zweck haben wir eine verkürzte sgRNA (sg trcSL1) konstruiert, der der Linker sowie Stamm-Loop 2 und Stamm-Schleife 3 fehlen. Diese verkürzte sgRNA hat eine minimale Anzahl an Komponenten und reduziert nachweislich die Nukleaseaktivität im CRISPR/ Cas9-System (5,44). Beim Test im CRISPRi-System zeigte dieser defekte Mutant im Vergleich zu sg PC ein Fluoreszenzniveau von 8 %, was darauf hindeutet, dass er auch bei verringerter Stabilität des ternären Komplexes immer noch an dCas9 binden und das interessierende Gen auf einem bestimmten Niveau unterdrücken konnte (Abbildung 1B). Die Strukturanalyse des RNP-Komplexes legt nahe, dass die Linker-, Stamm-Loop-2- und Stamm-Loop-3-Regionen der sgRNA durch ihre Wechselwirkungen mit der Nukleasedomäne von dCas9 für die Stabilisierung des Komplexes verantwortlich sind, was zu einer signifikanten Abnahme des Indel führt Effizienz im CRISPR/Cas9-System (44). Im Gegensatz dazu interagieren die Repeat: Anti-Repeat-Region und Stamm-Loop 1 der sgRNA hauptsächlich mit der Erkennungsdomäne und der PAM-interagierenden Domäne von dCas9 und haben keinen wesentlichen Einfluss auf die Indel-Effizienz im CRISPR/Cas9-System (44). Dieses Ergebnis stützt die Beobachtung, dass sg trcSL1 eine signifikante Verringerung der Nukleaseaktivität im CRISPR/Cas9-System aufwies, während es die Bindungsaffinität im CRISPRi-System nur geringfügig beeinflusste.

Abbildung 1. Systemaufbau und die Auswirkung der sgRNA-Mutation auf die Repressionseffizienz. (A) Zwei-Plasmid-System zur Quantifizierung der Repressionseffizienz. Ein Plasmid mit p15A-Ursprung enthält das dCas9-Gen unter einem aTc-induzierbaren Promotor und das mCherry-Gen unter einem konstitutiven Promotor. Das andere Plasmid mit cloDF13-Ursprung enthält Wildtyp- oder mutierte sgRNA unter einem konstitutiven Promotor. (B) Relative Fluoreszenz jeder sgRNA-Mutante (sg mut01 ∼ sg mut05 und sg trcSL1) und sg WT im Vergleich zu sg PC. +1 bis + 20 sind die Spacer-Sequenz, die an das mCherry-Gen bindet. sg PC: sgRNA ohne Spacer als Positivkontrolle, sg WT: Wildtyp-sgRNA. Fehlerbalken geben die Standardabweichung (n=3) an. Die P-Werte wurden durch einen ungepaarten T-Test bestimmt. ns: nicht signifikant, **P< 0.01

Variieren der Effizienz der komplexen Bildung für eine mehrstufige Ausdruckskontrolle

Tetraloop ist ein künstlicher Linker, der crRNA und tracrRNA im CRISPR-Cas9-System verbindet (5). Die Kristallstruktur des ternären Komplexes, bestehend aus dCas9, crRNA und tracrRNA, hat gezeigt, dass der Tetraloop und seine 5 und 3 flankierenden Regionen kaum Kontakt mit dCas9 haben (44). Gleichzeitig sind Repeat:Anti-Repeat- und Stamm-Loop-1-Regionen für den Funktionskomplex von entscheidender Bedeutung (44). Da es nicht direkt mit dCas9 interagiert, wurden der Tetraloop und seine flankierenden Regionen als potenzielle Orte für die Konstruktion von sgRNA mit zusätzlichen Komponenten untersucht, beispielsweise durch den Einbau von Aptamersequenzen, um zusätzliche Proteine ​​für die sgRNA zu rekrutieren (45,46). Es ist plausibel, dass Mutationen in dieser Region die Bindungsaffinität zwischen sgRNA und dCas9 diversifizieren könnten, ohne den Komplex vollständig zu zerstören. Eine 12--mer-Zufallsbibliothek (4 nt der Tetraloop-Region und 4 nt der 5 bzw. 3 flankierenden Regionen) wurde unter Verwendung von sg trcSL1 als Matrize konstruiert, um die Komplexbildungseffizienz zwischen sgRNA und dCas9 weiter zu senken (Abbildung 2A). ). Wir haben eine zweistufige Sortierstrategie angewendet, um verschiedene sgRNA-Mutanten zu erhalten, die die Repressionseffizienz zwischen sg WT (vollständig unterdrückender Zustand) und sg PC (nicht unterdrückender Zustand) abdecken. Wir haben die ursprüngliche Bibliothek in kleinere Bibliotheken mit unterschiedlichen Fluoreszenzintensitätsbereichen unterteilt und dann die Fluoreszenz jeder sgRNA-Variante einzeln aus der kleineren Bibliothek identifiziert. Die Fluoreszenzverteilung der durch Durchflusszytometrie erhaltenen Originalbibliothek war nahezu identisch mit der von sg PC (Abbildung 2B). Nach drei aufeinanderfolgenden Sortierschritten wies jede Bibliothek (hoch, mittel und niedrig) jedoch 63 %, 24 % bzw. 14 % mittlere Fluoreszenzwerte im Vergleich zu SG-PC auf (Abbildung 2B). Aus diesen kleineren Bibliotheken wurden 82 Kolonien isoliert, deren Fluoreszenzniveau zwischen 8 % und 104 % lag (Abbildung 2C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der mutierende Tetraloop und seine flankierende Region der sgRNA die Bindungsaffinität zwischen dCas9 und sgRNA für verschiedene Repressionseffizienzen modulieren können. Die quantitative Reverse-Transkriptions-PCR-Analyse (RT-qPCR) von 10 sgRNA-Mutanten (sg trcSL1c1 – sg trcSL1c10, Ergänzungstabelle S6) mit verschiedenen Fluoreszenzsignalen zwischen sg WT und sg PC in 82 sgRNA-Kolonien zeigte, dass die Fluoreszenzniveaus mit zunehmenden mCherry-Transkripten linear anstiegen Dies weist darauf hin, dass unser CRISPRi-System die Genexpression auf Transkriptionsebene steuert (Ergänzende Abbildung S2). Unser abstimmbares CRISPRi-System nutzt manipulierte sgRNAs, die eine bis zu {{46}fache Repressionskontrolle erreichen können, was eine Feinabstimmung der Repressionseffizienz ermöglicht, ohne die Mengen an dCas9 oder sgRNA zu verändern. Ein bemerkenswerter Vorteil unseres Systems besteht darin, dass es die Repressionseffizienz durch spezifische sgRNA-Varianten feinabstimmen kann, ohne dass es zu unbeabsichtigten Folgen kommen kann, auch wenn zusätzliches Klonen erforderlich ist. Darüber hinaus lässt die Wachstumskurve darauf schließen, dass unser System keine nennenswerte zelluläre Belastung darstellt (ergänzende Abbildung S3). Darüber hinaus zeigte RNA-Seq an drei sg trcSL1-Varianten mit unterschiedlicher Repressionseffizienz, dass die Expression von 51 bis 83 Genen verändert war, im Gegensatz zu den 262 veränderten Genen im sg WT (Ergänzende Abbildung S4). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die sg trcSL1-Varianten noch geringere Off-Target-Effekte hatten als das herkömmliche CRISPRi-System. Dies ist insbesondere bei metabolischen Engineering-Anwendungen relevant, bei denen die Optimierung von Stoffwechselwegen häufig die Manipulation mehrerer Gene erfordert. Die Möglichkeit, die Genexpression zu optimieren, ohne negative Nebenwirkungen zu verursachen, kann den Optimierungsprozess erheblich beschleunigen und die Gesamteffizienz und Produktivität des Systems verbessern.

Abbildung 2. Struktur der sgRNA-Bibliothek und Screening der Bibliothek. (A) sgRNA-Gerüst, das in dieser Studie verwendet wird. 12-mer, das Tetraloop und seine flankierende Sequenz enthält, wird zufällig aus sg trcSL1 mutiert, um eine sgRNA-Bibliothek zu erhalten. (B) Fluoreszenzverteilung aus der Durchflusszytometrie vor (links) und nach (rechts) Sortierung. Jede Verteilung enthält 100 000 Zellen. (C) Fluoreszenz einzelner Kolonien, die aus (B) erhalten wurden. Fehlerbalken geben die Standardabweichung (n=2) an.

Auswirkungen der Menge an dCas9 und sgRNA auf die Repressionseffizienz

Da die Modulation der Menge an dCas9 oder sgRNA die Repressionseffizienz des CRISPRi-Systems verändern könnte (23,24), ist es wichtig, den Einfluss von dCas9 und der sgRNA-Menge auf die Repressionseffizienz zu untersuchen. Wir haben die Leistung unseres Systems unter verschiedenen Bedingungen getestet, indem wir die Mengen an dCas9 und sgRNA mithilfe von zehn sgRNA-Mutanten (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10) verändert haben. Für die dCas9-Expression wurden drei verschiedene Konzentrationen (20, 100 und 500 ng/ml) des Induktors verwendet. Im Vergleich zum dCas9-mRNA-Spiegel bei Verwendung von 20 ng/ml Induktor war er um das 15--fache (100 ng/ml) und das 22--fache (500 ng/ml) weiter erhöht (Ergänzende Abbildung S5A). ). Es bestehen Bedenken hinsichtlich einer Überexpression von dCas9, da ein hoher dCas9-Spiegel für Zellen toxisch sein könnte (47,48) oder manchmal auch nicht (49). Allerdings verringerte sich die Wachstumsrate um weniger als 10 %, wenn bis zu 500 ng/ml aTc verwendet wurden, wie aus den Wachstumskurven bei verschiedenen Induktorkonzentrationen hervorgeht (ergänzende Abbildung S6). Dies legt nahe, dass die Menge an dCas9 unter den getesteten Bedingungen keine toxische Wirkung auf E. coli hatte. Die Repressionseffizienz änderte sich geringfügig, wenn die unterschiedliche Menge an dCas9 exprimiert wurde (Abbildung 3A). Es stimmte mit einer früheren Studie überein, dass das CRISPRi-System die maximale Repressionseffizienz bei [aTc] erreichte.< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.

Abbildung 3. Charakterisierung und Modularität des abstimmbaren CRISPRi-Systems. (A) Relative Fluoreszenz unter verschiedenen aTc-Konzentrationen (20, 100 und 500 ng/ml). (B) Relative Fluoreszenz unter verschiedenen Promotoren (J23100 und UPJ23119). (C) Relative Fluoreszenz unter verschiedenen Protospacern. Die x-Achse zeigt die relative Fluoreszenz von mCherry und die y-Achse zeigt die relative Fluoreszenz von lacI33-mCherry (rot) und araC33-mCherry (blau). 33 bp zusätzlicher Sequenzen von lacI und araC wurden am 5--Ende von mCherry (56) hinzugefügt. (D) Freie Energie von 12-mer und die relative Fluoreszenz. Gestrichelte Linien zeigen ein 95 %-Vorhersageintervall und durchgezogene Linien zeigen eine Regressionslinie an. Der dG-Wert von sg trcSL1c2 konnte mit mFold nicht ermittelt werden und wurde daher von der Analyse ausgeschlossen. (A–D) Alle Fehlerbalken geben die Standardabweichung (n=3) an.

Modularität des abstimmbaren CRISPRi-Systems

Unser Ansatz, der spezifische sgRNA-Varianten verwendet, um ein bestimmtes Expressionsniveau für eine Ziel-DNA aufrechtzuerhalten, hat das Potenzial, als modulares System eingesetzt zu werden. Um die Machbarkeit des abstimmbaren CRISPRi-Systems für die Ausrichtung auf verschiedene Protospacer zu demonstrieren, haben wir zwei Fusionsgene (lacI{{0}}mCherry und araC33-mCherry) konstruiert, indem wir 33 bps Sequenzen aus lacI und araC hinzugefügt haben bis zum 5 -Ende von mCherry (56). Das Genom von E. coli BL21(DE3) (GenBank: CP001509.3) enthält zwei Kopien der Protospacer-Sequenz für lacI33- mCherry und eine Kopie für araC33-mCherry. Diese chromosomalen Sequenzen haben jedoch keine PAM-Sequenzen und können daher nicht vom dCas9-sgRNA-Komplex angegriffen werden (43). Als die siRNAs so konzipiert wurden, dass sie auf jeden Protospacer abzielen, wurde die Repressionseffizienz für alle Protospacer von lacI33, araC33 und mCherry konsistent beibehalten (Abbildung 3C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass unser abstimmbares CRISPRi-System die Genexpression unabhängig von der Protospacer-Sequenz auf einem bestimmten Niveau wirksam regulieren kann. Eine mögliche Erklärung für den beobachteten Zusammenhang zwischen der RNP-Komplexbildung und der Repressionseffizienz ist die Änderung der freien Energie bei der Komplexbildung. Der künstliche Tetraloop-Linker und seine flankierende Region enthalten zwei A:U- und G:C-Watson-Crick-Basenpaare und ein A:G-Nicht-Watson-Crick-Basenpaar (44). Da die Bindung von crRNA und tracrRNA für die Komplexbildung entscheidend ist, würden Mutationen, die auf Tetraloop abzielen, die Bindungsaffinität zwischen dCas9 und sgRNA beeinflussen. Diese Affinität kann aus der Differenz der freien Energie zwischen den begrenzten und unbeschränkten Zuständen berechnet werden. Allerdings ist die Berechnung der freien Energie begrenzter Zustände eine Herausforderung (57). Wir gingen davon aus, dass sich die Gesamtstruktur und Stabilität des gebundenen Zustands nicht ändert, da aus der Bibliothek sortierte sgRNAs seine Funktion nicht vollständig störten. Darüber hinaus haben der Tetraloop und seine flankierende Region kaum Kontakt mit dCas9 (44). Daher würde die Bindungsaffinität zwischen dCas9 und sgRNA hauptsächlich von der Stabilität der Sekundärstruktur des Tetraloops und seiner flankierenden Sequenz beeinflusst. Basierend auf dieser Idee haben wir die freie Energie des Tetraloops und seiner flankierenden Sequenzen mithilfe von Mold (58) berechnet. Der Unterschied in der freien Faltungsenergie aufgrund der Mutationen wird als Unterschied zwischen der freien Energie der mutierten und der Wildtyp-Sequenz definiert. Sie könnte direkt aus der freien Faltungsenergie von Mutanten berechnet werden, da die Faltungsenergie der Wildtyp-Sequenz konstant bei –4,3 kcal/mol liegt. Mit zunehmender freier Faltungsenergie nahm das Fluoreszenzsignal zu (Abbildung 3D). Die Repressionseffizienz war am höchsten, wenn die Faltungsenergie der Tetraloop-haltigen Region nahe oder unter 0 kcal/mol lag und nahm linear ab, wenn die Faltungsenergie 0 kcal/mol überstieg. Diese Beobachtung legt nahe, dass die Effizienz der Komplexbildung zwischen dCas9 und sgRNA durch die Sekundärstruktur der Tetraloop-Region bestimmt wird, was zur Erklärung der Modularität unseres Systems beiträgt. Die Repressionseffizienz von weiteren 85 sgRNAs mit unterschiedlichen 12-mer-Sequenzen aus der Bibliothek wurde gemessen, um diese Beziehung weiter zu validieren. Es zeigte auch die bei sg trcSL1-Varianten beobachtete Korrelation (Abbildung 3D und Ergänzungstabelle S7), was darauf hindeutet, dass der Tetraloop-Linker eine entscheidende Rolle bei der Bildung des RNP-Komplexes spielt und dass Mutationen in dieser Region die Effizienz des CRISPR-Systems beeinflussen können. Darüber hinaus zeigt dieser Zusammenhang die Möglichkeit des computergestützten Designs von sgRNA-Varianten mit gewünschter Repressionseffizienz.

Anwendung eines abstimmbaren CRISPRi-Systems zur Flussumverteilung im Biosyntheseweg von Violacein in E. coli

Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-fach) im Vergleich zu anderen Genen, wenn anhand der Standardkurven berechnet. Im Gegensatz dazu blieb die Expression anderer unregulierter Enzyme im Violacein-Weg (vioA, vioB und vioE) unverändert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass unser System gezielt auf die Expression einzelner Gene abzielen und diese modulieren kann, ohne andere Gene im Signalweg zu beeinträchtigen. Eine direkte Quantifizierung von PV und PDV war aufgrund fehlender kommerziell verfügbarer Standards für die HPLC-Analyse nicht möglich. Daher haben wir die Titer in willkürlichen Einheiten mithilfe der HPLC-Peakfläche gemessen. Der Titer des Produkts erreichte 8 Stunden nach der Induktion ein Maximum und nahm dann allmählich ab (ergänzende Abbildung S8), möglicherweise aufgrund der Umwandlung des Produkts in andere Nebenprodukte, wie z. B. Chromoviridane, durch einen unbekannten Mechanismus (42, 64). Die beobachteten kleineren Peaks im HPLC-Spektrum deuteten auf das Vorhandensein zusätzlicher kleinerer Nebenprodukte hin. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass der Logarithmus des Titers jedes Produkts in willkürlichen Einheiten durch lineare Kombinationen der Promotorstärke jedes am Violacein-Biosyntheseweg beteiligten Gens vorhergesagt werden konnte (42). Dieses logarithmisch-lineare Regressionsmodell war auch in unserem System gültig und erhöhte vioD-Transkripte waren mit einer erhöhten PV-Produktion verbunden (Abbildung 4B). Es ist bekannt, dass die Entwicklung des Promotors oder der 5 -UTR jedes Gens, das am Violacein-Biosyntheseweg beteiligt ist, eine Umverteilung des Flusses und eine Optimierung des Wegs ermöglichte (65,66). Unser System könnte als alternative Methode zur Veranschaulichung der Transkriptionskontrolle dienen, ohne die am Signalweg beteiligten Promotoren zu manipulieren, indem synthetische sgRNAs verwendet werden, die kurz sind und mit einstufigen Methoden zusammengesetzt werden können. Das Screening durch das abstimmbare CRISPRi-System ermöglicht es, den Signalweg mit einem vorhersehbaren Fluss umzuleiten, bevor Wirtsstämme oder Genkassetten direkt manipuliert werden, was den Prozess möglicherweise beschleunigt.

Anwendung des abstimmbaren CRISPRi-Systems zum Ausgleich des Kohlenstoffflusses in Lycopin produzierenden E. coli

Die effiziente Produktion wertvoller Verbindungen im Metabolic Engineering erfordert den Ausgleich des Kohlenstoffflusses. Der Methylerythritol-4-phosphat (MEP)-Weg ist ein Stoffwechselweg, der einfache Vorläufer wie Pyruvat und Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) verwendet, um Isoprenoid-Bausteine, Dimethylallylpyrophosphat und Isopentenylpyrophosphat (67,68) herzustellen. . Diese Moleküle synthetisieren Geranylpyrophosphat, das in Farnesylpyrophosphat (FPP) umgewandelt wird (67,68). Lycopin, ein hochgeschätztes Carotinoid mit starken antioxidativen Eigenschaften und vielfältigen Anwendungen in verschiedenen Branchen (69), wird aus FPP über eine Reihe enzymatischer Reaktionen von crtE, crtB und crtI synthetisiert (Abbildung 4C) (22,70). Der GAP-Vorläufer ist nicht nur für den MEP-Weg, sondern auch für den Glykolyse-Weg essentiell (22). Es wurde gezeigt, dass eine verringerte Expression des GapA-Gens, das die Glycerinaldehyd--3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) im Glykolyseweg kodiert, die Lycopinproduktion durch Vergrößerung des GAP-Pools steigert (22). Daher haben wir GapA mit fünf Varianten ins Visier genommen, darunter drei sg trcSL1-Varianten (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5 und sg trcSL1c6), die unterschiedliche Repressionseffizienzen zeigten, sg PC und sg WT. GapA ist jedoch ein essentielles Gen, das nicht vollständig ausgeschaltet werden kann (71,72). Versuche, GapA mit herkömmlichem CRISPRi unter Verwendung von sg WT zu unterdrücken, waren selbst mit der geringen Leckage von dcas9 unter dem Tet-Promotor erfolglos (73). Andererseits wurde eine mehrstufige Unterdrückung der GapA-Genexpression mithilfe des abstimmbaren CRISPRi-Systems ohne Wachstumsdefekt erreicht und führte mit sg trcSL1c6 zu einem 2,{26}fachen Anstieg der Lycopinproduktion im Vergleich zu einem Stamm, der das GapA-Gen vollständig exprimierte nach 15 h Kultivierung (Abbildung 4D und ergänzende Abbildung S9). Es wurde berichtet, dass nur 10 % der natürlichen Expression des GapA-Gens zu einem erhöhten GAP-Pool führen, ohne dass es zu einer signifikanten Veränderung der nachgeschalteten Metaboliten im Glykolyseweg kommt, wie z. B. 2-Phosphoglycerat und 3-Phosphoglycerat ( 22). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass einstellbares CRISPRi die Genexpression auf mehreren Ebenen ohne Chromosomenmanipulation präzise unterdrücken kann.

Abbildung 4. Anwendung des abstimmbaren CRISPRi-Systems für den Biosyntheseweg von Violacein. (A) Violacein-Biosyntheseweg und die Plasmidkonstruktion. Fünf Gene (vioA, vioB, vioC, vioD und vioE), die für die Produktion von Violacein verantwortlich sind, wurden in ein dCas9-exprimierendes Plasmid kloniert. Es werden vier Hauptprodukte (Violacein, Proviolacein, Desoxyviolacein und Prodesoxyviolacein) hergestellt. sg WT für vioC und fünf sg trcSL1-Varianten (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 und sg trcSL1c9) für vioD, die unterschiedliche Repressionseffizienzen zeigten, wurden in das andere Plasmid kloniert. Trp: L-Tryptophan, V: Violacein, PV: Proviolacein, PDV: Prodesoxyviolacein, DV: Desoxyviolacein, PDVA: Protodesoxyviolaceinsäure, PVA: Protoviolaceinsäure. (B) Zusammenhang zwischen vioD-Transkripten, mCherry-Fluoreszenz und dem Titer von PDV und PV. Die x-Achse gibt die relative vioD-RNA an, die aus RT-qPCR erhalten wurde, die y-Achse links zeigt die relative mCherry-Fluoreszenz aus Abbildung 3 und die y-Achse rechts gibt das Verhältnis der HPLC-Fläche an. Proben mit dem höchsten vioD-RNA-Wert wurden zur Normalisierung auf 100 % gesetzt. (C) Lycopin-Biosyntheseweg und die Plasmidkonstruktion. Drei Gene (crtE, crtB, crtI), die für die Produktion von Lycopin verantwortlich sind, wurden in ein dCas9-exprimierendes Plasmid kloniert. GapA wurde mit sg trcSL1-Varianten (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6) gezielt und sg PC wurde in das andere Plasmid kloniert. Glc: Glucose, GAP: Glycerinaldehyd-3-phosphat, 1,3-BPG: 1,3-Bisphosphoglycerat, DMAPP: Dimethylallylpyrophosphat, IPP: Isopentenylpyrophosphat, FPP: Farnesylpyrophosphat. (D) Zusammenhang zwischen GapA-Transkripten, mCherry-Fluoreszenz und Lycopinproduktion. Die x-Achse gibt die relative Gap-RNA an, die aus RT-qPCR erhalten wurde, die y-Achse links zeigt die relative mCherry-Fluoreszenz aus Abbildung 3 und die y-Achse rechts gibt den Lycopin-Titer an. (B, D) Alle Fehlerbalken geben die Standardabweichung (n=3) an.

ABSCHLUSS

Wir haben ein abstimmbares CRISPRi-System entwickelt, das die Genexpression präzise auf dem gewünschten Niveau steuern kann. Durch die Mutation des Tetraloops und seiner flankierenden Region könnten synthetische sgRNAs, die auf verschiedene Protospacer-Sequenzen abzielen, das Gen auf einem bestimmten Niveau regulieren. Wir haben dieses System erfolgreich angewendet, um den interessierenden Stoffwechselfluss im Violacein-Biosyntheseweg umzuleiten und Indolderivate in einem vorhersehbaren Verhältnis herzustellen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Verwendung von abstimmbarem CRISPRi zu einer zweifachen Steigerung der Lycopinproduktion führte, was die Vielseitigkeit unseres Systems zur Verbesserung der Produktion anderer wertvoller Verbindungen unterstreicht. Dieses System würde die Flussoptimierungsprozesse beschleunigen, bevor die genetischen Informationen des Wirts dauerhaft manipuliert werden, beispielsweise der Promotor oder die 5-UTR-Sequenzen.

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

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