Schwachstellenstelle auf dem SARS-CoV-2-Spike induziert breit schützende Antikörper gegen antigenisch unterschiedliche Omicron-Subvarianten
Nov 30, 2023
Die schnelle Entwicklung der Omicron-Varianten des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) hat die Notwendigkeit hervorgehoben, Antikörper mit breiten neutralisierenden Fähigkeiten zu identifizieren, um künftige monoklonale Therapien und Impfstrategien zu unterstützen. Hier haben wir S728-1157 identifiziert, einen weitgehend neutralisierenden Antikörper (bnAb), der auf die Rezeptorbindungsstelle (RBS) abzielt und von einer Person stammt, die zuvor vor der Ausbreitung von WT SARS-CoV-2 infiziert war besorgniserregende Varianten (VOCs). S728-1157 zeigte eine breite Kreuzneutralisierung aller dominanten Varianten, einschließlich D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu und Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB). Darüber hinaus schützte S728-1157 Hamster vor In-vivo-Herausforderungen mit WT-, Delta- und BA.1-Viren. Die Strukturanalyse zeigte, dass dieser Antikörper zusätzlich zu den üblichen Motiven in CDR-H1/ CDR-H2 von Klasse-1/RBS-A-Antikörpern. Wichtig ist, dass dieses Epitop im offenen Zustand und im Präfusionszustand oder in den Hexaprolin (6P)-stabilisierten Spike-Konstrukten im Vergleich zu Diprolin (2P)-Konstrukten leichter zugänglich war. Insgesamt zeigt S728-1157 ein breites therapeutisches Potenzial und könnte zielgerichtete Impfstoffdesigns gegen zukünftige SARS-CoV-2-Varianten beeinflussen.
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Einführung
Seit Beginn der Pandemie im Dezember 2019 hat das Virus des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) zu über 660 Millionen Fällen der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) und über 6,5 Millionen Fällen geführt Millionen Todesfälle weltweit. Obwohl die rasante Entwicklung und Verbreitung von Impfstoffen und Therapeutika die Auswirkungen von COVID-19 weitgehend eingedämmt haben, stellt das Auftreten besorgniserregender Varianten (VOCs) aufgrund der Möglichkeit einer weiteren Immunumgehung weiterhin eine große Bedrohung dar und erhöhte Pathogenität. Die D614G-Variante war die erste Variante, die auf den Markt kam und sich danach überall durchsetzte. Im Vergleich zu WT zeigte die D614G-Variante eher eine erhöhte Übertragbarkeit als eine erhöhte Pathogenität und es war daher unwahrscheinlich, dass sie die Wirksamkeit von Impfstoffen in klinischen Studien verringerte (1). Zwischen dem Aufkommen von D614G und Oktober 2021 haben sich weltweit vier weitere bedeutende VOCs entwickelt, darunter Alpha, Beta, Gamma und Delta. Unter diesen Varianten wurde Delta aufgrund seiner Übertragbarkeit, der erhöhten Krankheitsschwere und der teilweisen Immunumgehung zu einer ernsthaften globalen Bedrohung, wie die verringerte Fähigkeit von polyklonalem Serum und mAbs, diesen Stamm zu neutralisieren, zeigt (2–6). Kurz darauf, im November 2021, wurde die Omicron-Variante identifiziert und als neuartige VOC angekündigt. Diese Variante wies die bisher größte Anzahl an Mutationen auf und schien sich schneller zu verbreiten als frühere Stämme (7, 8). Derzeit gibt es eine breite Palette von Omicron-Unterlinien, die zu neuen COVID{21}}-Fällen führen, wobei BQ.1, BQ.1.1 und XBB.1.5 gegenüber BA.5 dominant werden und zu diesem Zeitpunkt die meisten neuen Fälle weltweit ausmachen des Schreibens. Die Omicron-Varianten können der Erkennung durch die COVID{28}}-Impfstoff-assoziierte Immunität in unterschiedlichem Ausmaß entgehen, wodurch die neutralisierende Wirksamkeit von Serumantikörpern von genesenen, vollständig mRNA-geimpften Personen und Personen, die mit dem neuen bivalenten WT/BA.5-Booster behandelt wurden, erheblich verringert wird mRNA-Impfstoff (9, 10). In ähnlicher Weise konnten sich Omicron-Varianten der Bindung mehrerer therapeutischer mAbs mit Notfallzulassung (EUA) entziehen, obwohl zuvor gezeigt wurde, dass diese gegen frühere VOCs wirksam sind (10–12). Aufgrund der geringeren Neutralisierung gegen Omicron und der anhaltenden Bedrohung durch zukünftige VOCs besteht ein dringender Bedarf, breite und wirksame neutralisierende Antikörper zu identifizieren, die vor verschiedenen, sich entwickelnden SARS-CoV-2-Linien schützen können. In dieser Studie identifizierten wir einen potenten Rezeptor-bindenden Domänen-reaktiven (RBD-reaktiven) mAb aus dem peripheren Blut einer SARS-CoV-2-rekonvaleszenten Person, der Alpha, Beta, Kappa, Delta, Mu effektiv neutralisierte. und Omicron-Varianten (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 und XBB). Dieser mAb, S728-1157, reduzierte die Viruslast von BA.1 Omicron, Delta und WT in der Lunge und Nasenschleimhaut nach einer In-vivo-Exposition bei Hamstern erheblich. S728-1157 bindet die Rezeptorbindungsstelle (RBS), die vollständig freigelegt ist, wenn sich die RBD auf dem Spike in der Aufwärtskonformation befindet. Der mAb nutzt Motive, die in CDR-H1 und CDR-H2 vorkommen und bei IGHV3-53/3-66-Klasse-1/RBS-A-Antikörpern üblich sind (13, 14), aber auch durch umfangreiche einzigartige Kontakte mit CDR -H3, um Mutationen in den VOC-Spitzen zu umgehen. Dies legt nahe, dass das rationale Design zukünftiger Impfstoffboosts, die Omicron-Varianten abdecken, so geändert werden sollte, dass ein stabilisierter Spike in der überwiegend nach oben gerichteten Konfiguration vorliegt, um Klasse-1/RBS-A-mAbs mit ähnlichen CDR-H3-Merkmalen optimal zu induzieren.
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Ergebnisse
Isolierung von RBD-reaktiven mAbs, die unterschiedliche Neutralisations- und Wirksamkeitsmuster aufweisen. Vor der Verbreitung der Omicron-Linien haben wir zuvor 43 mAbs charakterisiert, die auf verschiedene Epitope auf dem Spike-Protein abzielen, einschließlich der N-terminalen Domäne (NTD), RBD und Untereinheit 2 (S2). Keiner dieser Antikörper war in der Lage, die damals zirkulierenden SARS-CoV-2-Varianten zu neutralisieren (15). In dieser Studie wurde eine zusätzliche Gruppe RBD-reaktiver mAbs von drei Personen mit hoher Reaktion exprimiert, die starke Anti-Spike-IgG-Reaktionen zeigten, wie zuvor definiert (16) (Ergänzungstabellen 1 und 3; ergänzendes Material online zu diesem Artikel verfügbar); https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). Obwohl der Anteil der Spike-RBD-bindenden B-Zellen bei Personen mit hohem Responder im Vergleich zu Personen mit mittlerem und niedrigem Responder ähnlich war (Abbildung 1, A–C), waren die somatischen Hypermutationsraten der schweren Kette in der Gruppe mit hohem Responder signifikant höher (Abbildung 1). , D und E), was darauf hindeutet, dass diese Personen möglicherweise das höchste Potenzial zur Erzeugung wirksamer kreuzreaktiver mAbs haben (16). Diese Antikörper wurden weiter gegen RBD-Mutanten untersucht, um ihre Epitopklassifizierungen zu ermitteln (17). Unter 14 RBD-reaktiven mAbs identifizierten wir 4 mAbs der Klasse 2, 2 mAbs der Klasse 3 und 8 nicht klassifizierte mAbs, die eine geringe bis gar keine Verringerung der Bindung gegenüber den getesteten wichtigen RBD-Mutanten zeigten (Abbildung 1F). Zu beachten ist, dass Antikörper der Klassen 2, 3 und 4 ungefähr den in früheren Studien definierten RBS BD-, S309- und CR3022-Epitopen entsprechen (13, 18). RBD-mAbs der Klassen 2 und 3 erkannten weder einen multivarianten RBD-Mutanten mit K417N/E484K/L452R/N501Y-Substitutionen, einen künstlich gestalteten RBD, der Schlüsselmutationen für die Virusflucht enthält (17, 18), noch zeigten sie irgendeine Kreuzreaktivität damit RBD von SARS-CoV-1 und Middle Eastern Respiratory Syndrome (MERS)-CoV (Abbildung 1F). Funktionell neutralisierten RBD-mAbs der Klassen 2 und 3 wirksam D614G- und Delta-Varianten, die neutralisierende Aktivität war jedoch gegen Beta, Kappa und Mu begrenzter (Abbildung 1G). Keiner der getesteten Antikörper der Klasse 2 oder 3 neutralisierte eine der getesteten Omicron-Varianten.
Im Gegensatz dazu band die Mehrheit der nicht klassifizierten mAbs an die RBD-Multivariante und reagierte kreuzreagiert mit dem SARS-CoV-1 RBD (Abbildung 1F). Unter diesen identifizierten wir 3 mAbs, S451-1140, S626-161 und S728-1157, die eine hohe Neutralisierungskraft gegen D614G zeigten und Beta, Delta, Kappa, Mu und kreuzneutralisierten Omicron BA.1 mit einer Hemmkonzentration von 99 % (IC99) im Bereich von 20–2.500 ng/ml (Abbildung 1G). Angesichts der breiten Neutralisierungswirkung dieser 3 mAbs führten wir zusätzlich zur Plaque-Assay-Plattform auch die Neutralisierungsaktivität gegen authentische BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5- und XBB-Viren mittels Focus Reduction Neutralization Test (FRNT) (Abbildung 1G). Von diesen zeigte S728-1157 hohe neutralisierende Aktivitäten gegenüber der Gruppe der Omicron-Varianten, einschließlich BA.1, BA.2, BA.4 und BA.5, mit einem IC99 von bis zu 100 ng/ml, gemessen durch a Plaque-Assay. Ein ähnliches Szenario wurde mit FRNT beobachtet, wo S728-1157 seine hohe Neutralisierungsaktivität gegen BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 und XBB mit einem IC50 im Bereich von 8–300 ng beibehielt /ml (Abbildung 1G). S451-1140 neutralisierte BA.1, BA.2, BA.2.75 und BL.1 wirksam, nicht jedoch BA.4 und BA.5, wie in beiden Neutralisationstestplattformen beobachtet. Andererseits zeigte S626-161 keine neutralisierende Aktivität gegen Omicron-Varianten über die BA.1-Variante hinaus (Abbildung 1G). Obwohl S626-161 eine geringere Neutralisierungskraft gegen die getesteten VOCs hatte als die anderen beiden Antikörper, war es der einzige mAb, der nicht nur eine Kreuzreaktivität mit SARS CoV-1 RBD zeigte, sondern auch in der Lage war, Fledermäuse zu neutralisieren Coronaviren WIV-1 und RsSHC014 (Abbildung 1, F und G). Diese Daten legen nahe, dass S626-161 ein konserviertes Epitop erkennt, das von diesen Arbovirus-Linien gemeinsam genutzt wird, in BA.2 und späteren Stämmen jedoch fehlt. Darüber hinaus verfügt S626-161 im Vergleich zu S728-1157 und S451-1140 über einen längeren CDR-H3, der wie beschrieben eine verbesserte Fähigkeit zur Erkennung eines hochkonservierten Teils von Resten bieten könnte, die von Arboviren gemeinsam genutzt werden in einer früheren Studie (19) (Ergänzende Abbildung 1). Beim Vergleich der variablen Gene der schweren (IGHV) und leichten Immunglobulinkette (IGLV oder IGKV) dieser 3 mAbs mit der verfügbaren SARS-CoV-2 neutralisierenden mAbs-Datenbank (13, 15, 20–27) fanden wir diese schwere Kette variable Gene, die von S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV3-23) und S626-161 (IGHV4-39) genutzt werden Es wurde bereits berichtet, dass sie mehrere wirksam neutralisierende SARS-CoV-2-Antikörper kodieren, die auf die RBD abzielen (21, 22, 28, 29). Allerdings wies nur S728-1157 einzigartige variable Genpaarungen der schweren und leichten Kette auf, die nicht in der Datenbank angegeben wurden (Ergänzungstabelle 3), was darauf hinweist, dass es sich nicht um einen öffentlichen Klonotyp handelt.
Abbildung 1. Charakterisierung von RBD-reaktiven mAbs, die aus COVID-19-rekonvaleszenten Personen isoliert wurden
Diese 3 mAbs (S451-1140, S626-161 und S728-1157) wurden weiter charakterisiert, um ihre Bindungsbreite gegen SARSCoV-2 VOCs zu bestimmen (Abbildung 2, A und B) . Der präfusionsstabilisierte Spike, der 2-Prolin-Substitutionen in der S2-Untereinheit (2P; Diprolin) enthält, hat sich im Vergleich zum WT-Spike als überlegenes Immunogen erwiesen und ist die Grundlage mehrerer aktueller SARS-CoV-2 Impfstoffe, einschließlich mRNA-basierter Impfstoffe (30, 31). Kürzlich wurde berichtet, dass das mit 6 Prolinen (6P; Hexaprolin) stabilisierte Spike-Protein die Expression steigert und sogar stabiler ist als das ursprüngliche Diprolin-Konstrukt; Daher wurde die Verwendung in der nächsten Generation von COVID-19-Impfstoffen vorgeschlagen (32, 33). Um festzustellen, ob es Antigenitätsunterschiede zwischen den Diprolin- und Hexaprolin-Spike-Konstrukten gibt, wurden beide Immunogene in unser Testpanel einbezogen. Bei der ELISA-Messung stellten wir fest, dass 3 mAbs das 6P-WT-Spike-Antigen im Vergleich zum WT-2P-Spike stärker banden (Abbildung 2, A und B). Alle 3 mAbs zeigten eine vergleichbare Bindung an die Spikes von Alpha-, Beta-, Gamma- und Delta-Viren im Vergleich zu der von WT-2P (Abbildung 2, A und B). Allerdings waren die Bindungsreaktivitäten dieser 3 mAbs gegenüber einer Reihe von Antigenen der Omicron-Familie erheblich verringert (Abbildung 2, B und C). Die S451-1140-Bindung reagierte empfindlich auf Mutationen, die in BA.1 und BA.2 gefunden wurden, was zu einer starken Abnahme der Bindung und einer 31-fachen Abnahme der Neutralisierung gegen diese Varianten im Vergleich zu WT-2 führte. P-Antigen bzw. D614G-Virus (Abbildung 2B). Der Sarbecovirus-kreuzneutralisierende mAb, S626-161, zeigte ebenfalls eine um das 1,2-- bis 3,5--fache verringerte Bindung an das Spike-BA.1-Antigen, was für eine {{45} }fache Verringerung der Neutralisationsaktivität gegen BA.1 (Abbildung 1G und Abbildung 2, B und C). Für den stärksten breit neutralisierenden Antikörper (bnAb), S728-1157, war die Bindung an Omicron-Antigene im Vergleich zu weniger stark reduziert (im Bereich von 1,1- bis 4,4-fach). WT-2P stieg an und blieb in der neutralisierenden Aktivität unbeeinflusst (Abbildung 1G und Abbildung 2, B und C). Die erhebliche Abnahme der Omicron-neutralisierenden mAb-Bindung an den BA.1-Spike könnte auf Veränderungen in seiner Mobilität zurückzuführen sein und mit der dichten Packung der Omicron-3-RBD-Down-Strukturen und der Bevorzugung von 1- zusammenhängen. wie in einer früheren Studie berichtet (34). Die 2P- und 6P-Stabilisierungsmutationen haben auch unterschiedliche Auswirkungen auf Omicron-Varianten, bei denen alle 3 mAbs eine über 2,{67}fach erhöhte Bindung an Spike BA.1-6P im Vergleich zu BA.{69}}P zeigten Version, erhöhte jedoch die Bindung an Spike-BA.2- und BA.4/5 6P-Versionen im Vergleich zu ihren 2P-Versionen nur geringfügig um 1,2 × bis 1,4 ×, was auf eine etwas bessere Zugänglichkeit von Omicron-neutralisierenden mAbs für die Hexapolversionen hindeutet. insbesondere für das Spike-BA.1-Konstrukt. Zusätzlich zum ELISA wurde Biolayer-Interferometrie (BLI) verwendet, um die Bindungsrate und Gleichgewichtskonstanten (kon, koff und KD) dieser 3 mAbs an eine Reihe von Spike-Antigenen zu quantifizieren (ergänzende Abbildung 2). Die Erkennungsraten der Fragment-Antigen-Bindung (Fab) an Hexaprolin-Spikes waren im Vergleich zu Diprolin-Spikes 1,{83}} bis 3,{85}}fach schneller (ergänzende Abbildung 2, B und C), was dies zeigt Die Antikörper banden schneller an das 6P-Konstrukt als an das 2P-Konstrukt. Dies wäre zu erwarten gewesen, wenn die Epitope auf der RBD im offenen Zustand auf dem Hexaprolin-Spike besser zugänglich gewesen wären. Mit Ausnahme von S626- 161 dissoziierten Fabs langsamer vom Hexaprolin-Spike (hatten einen niedrigeren Koff) als der Diprolin-Spike, sodass die Gesamt-KD zeigte, dass S728-1157 und S451-1140 daran banden der Hexaprolin-Spike mit größerer Affinität (Ergänzende Abbildung 2, B und C). Der Anstieg der Bindung an den Hexaprolin-Spike war bei intaktem IgG durch das 1:2-Interaktionsmodell noch deutlicher, wie durch S728-1157- und S451- 1140-mAbs gezeigt, was mit der Exposition mehrerer Epitope bei 6P-Stabilisierung übereinstimmt verbesserte Avidität (ergänzende Abbildung 2, A und C). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die angestrebten Epitope auf dem 6P-stabilisierten Spike vergleichsweise leichter zugänglich sein könnten, wenn sich die RBD im offenen Zustand befindet. Als nächstes wurden Strukturanalysen durchgeführt, um diese Vermutung zu überprüfen.
Abbildung 2. Bindungsbreite von Omicron-neutralisierenden mAbs
Strukturanalyse breit neutralisierender mAbs. Als erste Annäherung an die gebundenen Epitope wurde ein ELISA-Kompetitionstest verwendet, um zu bestimmen, ob diese drei weitgehend neutralisierenden mAbs irgendeine Überlappung mit unserem aktuellen Panel von mAbs hatten, einer Sammlung von mAbs mit bekannten Epitopspezifitäten aus früheren Studien (15, 25, 35). und zwei weitere mAbs, die sich derzeit im klinischen Einsatz befinden, LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) und REGN10933 (Regeneron) (37). Die Bindungsstellen von S451-1140 und S728-1157 überlappten teilweise mit CC12.3 (23, 25), einem neutralisierenden Antikörper der Klasse 1, und den meisten Antikörpern der Klasse 2, einschließlich LY-CoV555 und REGN10933, jedoch nicht mit Antikörpern der Klassen 3 und 4 (Abbildung 3A). S626-161 teilte eine bemerkenswerte Überlappung in der Bindungsregion mit Klasse-1-CC12.3, mehreren Klasse-4-Antikörpern, einschließlich CR3022, und anderen nicht klassifizierten Antikörpern, während es eine teilweise Überlappung mit mehreren Klasse-2- und einem einzelnen Klasse-3-Antikörper aufwies (Abbildung 3A). Analog ergab ein Konkurrenz-BLI-Assay, dass S451-1140 und S728-1157 stark miteinander um die Bindung an Spike WT-6P konkurrierten, während S626-161 dies nicht tat (Ergänzende Abbildung). 3). Insgesamt legen diese Daten nahe, dass S451-1140 und S728-1157 ähnliche Epitope erkennen, die sich von S626-161 unterscheiden.
Abbildung 3. Mechanismus der breiten Neutralisierung von S728-1157
Der Antikörper S728-1157 wurde von IGHV3-66 kodiert und besaß eine kurze komplementaritätsbestimmende Region 3 (CDR-H3). Insbesondere mAbs, die das RBS im Bindungsmodus 1 binden (d. h. RBS-A oder Klasse-1-Stelle), typisiert durch CC12.1, CC12.3, B38 und C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39), neigen dazu, IGHV3-53 oder 3-66 zu verwenden und reagieren empfindlich auf VOC-Mutationen (40). Allerdings unterscheidet sich die CDR-H3-Region von S728-1157 stark von anderen Antikörpern dieser Klasse, was möglicherweise für ihre breitere Aktivität verantwortlich ist. Um die strukturelle Grundlage der breiten Neutralisierung durch S728-1157 an diesem Epitop zu verstehen, haben wir eine Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)-Struktur (Abbildung 3B) von IgG S728-1157 im Komplex mit Spike-WT{ aufgelöst. {31}}P-Mut7, eine Version von Spike WT-6P, die eine Interprotomer-Disulfidbindung an C705 und C883 besitzt, mit einer globalen Auflösung von etwa 3,3 Å (ergänzende Abbildung 4E). Mithilfe von Symmetrieerweiterungs-, fokussierten Klassifizierungs- und Verfeinerungsmethoden erreichten wir eine lokale Auflösung an der RBD-Fv-Grenzfläche von etwa 4 Å (Ergänzungsabbildung 4E und Ergänzungstabelle 8). Eine Kristallstruktur von S728-1157 Fab wurde mit einer Auflösung von 3,1 Å bestimmt und zur Erstellung des Atommodells an der RBD-Fv-Grenzfläche verwendet. Unsere Strukturen bestätigen, dass S728-1157 das RBS-A-Epitop (oder Klasse 1) in der RBD-up-Konformation gebunden hat (Abbildung 3B und ergänzende Abbildung 4E), ähnlich wie andere IGHV3-53/{{55} } Antikörper (Abbildung 3C). Die sterische Blockade der Bindungsstelle des Angiotensin-Converting-Enzyms 2 (ACE2) durch S728-1157 erklärt seine hohe Neutralisierungskraft gegen SARS-CoV-2. Das 32NY33-Motiv und das 53SGGS56-Motiv (23) in S728-1157 CDR-H1 und -H2 interagieren mit dem RBD auf fast die gleiche Weise wie CC12.3 (Ergänzende Abbildung 4, B und C). Im Vergleich zu VH 98DF99 in CC12.3 bildet VH 98DY99 in S728-1157 CDR-H3 jedoch umfangreichere Wechselwirkungen, einschließlich sowohl hydrophober als auch polarer Wechselwirkungen, mit dem RBD, was für die breite Neutralisierung gegen VOCs verantwortlich sein könnte (Abbildung 3D und ergänzende Tabellen 6 und 7). Das Diglycin VH 100GG101 in S728- 1157 CDR-H3 ermöglicht möglicherweise auch eine umfassendere Bindung im Vergleich zu VH Y100 in CC12.3, wahrscheinlich aufgrund der Flexibilität der Glycinreste, die zu einer anderen Konformation der Spitze des CDR führt -H3-Schleife und eine relative Verschiebung der Reste bei 98DY99.
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Obwohl die Omicron-VOCs umfangreiche Mutationen in der RBD aufweisen, interagieren die meisten dieser Reste nicht mit S728-1157, da weiterhin eine Bindung beobachtet wird (ergänzende Abbildung 4A). Aus unserem Spike-WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157-Modell geht hervor, dass Y505 bis VL Q31 und E484 bis VH Y99 Wasserstoffbrückenbindungen bilden (Ergänzungsabbildung 4D und Ergänzungstabelle 6). ), die möglicherweise durch die Omicron-Mutationen Y505H und E484A gestört werden. Allerdings würde eine Y505H-Mutation immer noch eine Wasserstoffbindung mit VL Q31 ermöglichen, und eine E484A-Mutation würde eine weitere hydrophobe Seitenkette in der Nähe der hydrophoben Reste VL Y99, F456 und Y489 hinzufügen. Diese Kontakte erklären möglicherweise teilweise den Mechanismus, der es S728-1157 ermöglicht, die neutralisierende Aktivität gegenüber dem Spike-BA.1-Antigen beizubehalten, wenn auch reduziert (Abbildung 1G und Abbildung 2B). Das BA.1-Antigen wiederum steht möglicherweise im Zusammenhang mit den Omicron-Mutationen, die die Konformationslandschaft des Spike-Proteins verändern (34). Allerdings sind mehrere somatisch mutierte Reste, nämlich VH L27, L28, R31, F58 und VL V28 und Q31, in S728-1157 an der Interaktion mit SARS-CoV-2 RBD beteiligt (Ergänzende Abbildung 1 und Ergänzungstabelle 7), was möglicherweise auch zu seiner breiten Reaktivität im Vergleich zu CC12.3 beiträgt. Insgesamt haben unsere Strukturstudien die Grundlage einer breiten Neutralisierung von S728-1157 aufgezeigt, die die meisten Mutationen in den VOCs von SARS-CoV-2 aufnehmen kann.
Abbildung 4. Schutzwirkung von bnAbs gegen SARS-CoV-2-Infektionen bei Hamstern.
S728-1157 reduziert die Replikation von SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta und WT SARS-CoV-2 bei syrischen Hamstern. Um die Schutzwirkung unserer weitgehend neutralisierenden mAbs zu bewerten, verwendeten wir ein Goldhamster-Infektionsmodell, das häufig für SARS-CoV verwendet wird-2. Hamster erhielten 5 mg/kg unserer Test-mAbs oder eine Isotypkontrolle, die auf ein irrelevantes Antigen (Ebolavirus-Glykoprotein) abzielte, über eine intraperitoneale Injektion einen Tag nach der Infektion mit SARS-CoV-2-Viren. Lungen- und Nasengewebe wurden 4 Tage nach der Infektion entnommen (Abbildung 4A). Die therapeutische Verabreichung von S728-1157 führte zu verringerten Titern der Varianten WT, BA.1 Omicron und Delta sowohl in den Nasenmuscheln als auch in der Lunge infizierter Hamster (Abbildung 4, B–D). Interessanterweise war die Wirkung von S728-1157 in der Lunge dramatisch und reduzierte die Viruslast von WT und BA.1 Omicron um etwa 104PFU, wobei die Virustiter der Variante BA.1 Omicron vollständig aufgehoben wurden (Abbildung 4C). Im Gegensatz zur In-vitro-Neutralisation (Abbildung 1G) reduzierte S451-1140 die Virusreplikation von BA.1 Omicron in der Lunge und den Nasenmuscheln nicht, was auf eine Diskrepanz zwischen der In-vitro-Neutralisation und dem In-vivo-Schutz für diesen Klon hindeutet (Abbildung 4E). . Im Vergleich dazu führte die Verabreichung von S626-161 zu einer geringfügig signifikanten Verringerung der Lungenvirustiter nach der WT- und BA.1-Provokation (Abbildung 4, F und G). Diese Daten unterstreichen, dass zur genauen Definition allgemein schützender mAbs die Bewertung der Schutzwirksamkeit parallel zur Neutralisierungsaktivität erforderlich ist. In Zukunft wird es interessant sein zu untersuchen, inwieweit die Schutzkapazität von S728-1157 Fc-abhängig ist. Insgesamt stellt S728-1157 einen vielversprechenden mAb mit breiter Neutralisierungswirksamkeit gegen SARS-CoV-2-Varianten dar, der in der Lage ist, die WT-, Delta- und BA.1-Replikation in vivo drastisch zu reduzieren.
Eine SARS-CoV-2-Infektion löst selten starke S728-1157-ähnliche kreuzneutralisierende mAbs aus. Angesichts der Kreuzneutralisierung und des prophylaktischen Potenzials von S728-1157 wollten wir untersuchen, ob S728–1157-ähnliche Antikörper häufig bei polyklonalen Reaktionen bei SARS-CoV-2-Patienten induziert werden. Um dies zu beurteilen, führten wir Konkurrenz-ELISAs mit Rekonvaleszenzserum durch, um Anti-RBD-Antikörpertiter nachzuweisen, die um die Bindung mit S728-1157 konkurrieren könnten (Abbildung 5A). Die Probanden wurden basierend auf dem Ausmaß der Antikörperreaktionen in drei Gruppen eingeteilt, wie zuvor definiert (15, 16). Obwohl Personen mit hohem und mittlerem Ansprechen im Vergleich zu Personen mit niedrigem Ansprechen höhere Titer an S728-1157-kompetitiven Serumantikörpern aufwiesen (Abbildung 5B), waren die Titer in allen Gruppen recht niedrig, was darauf hindeutet, dass es ungewöhnlich ist, hohe Konzentrationen an S{{ 18}}-ähnliche Antikörper im polyklonalen Serum nach einer WT-SARS-CoV-2-Infektion. Zusätzlich zu S728-1157 haben wir die Konkurrenz von Rekonvaleszenzserum mit anderen mAbs getestet, darunter S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 und CC12.3. Ähnlich wie bei S728-1157 beobachteten wir im polyklonalen Serum der meisten Rekonvaleszenten relativ niedrige Antikörpertiter, die mit S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 und CC12.3 konkurrieren Individuen (Abbildung 5, C–F und H). Nichtsdestotrotz hatten Menschen mit hohem Ansprechen tendenziell deutlich höhere Titer gegen die neutralisierenden mAbs als Menschen mit niedrigem Ansprechen (Abbildung 5, B–F und H). Im Gegensatz dazu waren Antikörper, die auf die CR3022-Epitopstelle abzielten, bei rekonvaleszenten Personen stärker ausgeprägt, was auf eine Anreicherung von RBD-Antikörpern der Klasse 4 im polyklonalen Serum schließen lässt (Abbildung 5G). Bemerkenswerterweise gab es keinen signifikanten Unterschied in den CR3022-Titern zwischen den drei Respondergruppen, was darauf hindeutet, dass während der WT-SARS-CoV-2-Infektion bei den meisten Personen durchweg Antikörper an der CR3022--Stelle induziert wurden. Interessanterweise wurde S728-1157 im Vergleich zu CC12.3 im Serum von Patienten mit hohem Ansprechverhalten in einer um das 4--fache geringeren Menge nachgewiesen. Obwohl Antikörper der Klasse 1 häufig durch natürliche Infektionen und Impfungen induziert werden (14, 20, 28, 29, 41–43), deuten unsere Daten darauf hin, dass S728–1157-ähnliche Antikörper, die eine Untergruppe dieser Klasse darstellen, vergleichsweise selten sind.
Darüber hinaus untersuchten wir den Unterschied in der Reaktivität gegenüber 2P gegenüber 6P-stabilisiertem Spike in den Seren unserer Genesungskohorte (Abbildung 5, I–K). Wir fanden heraus, dass alle 3 Respondergruppen Anti-Spike-reaktive Antikörper gegen 6P-stabilisierte Spike-WT in größerem Ausmaß aufbauten als gegen 2P-stabilisierte Spike-WT, und zwar um den Faktor 6–11 (Abbildung 5J), was darauf hindeutet, dass die Hauptantigenepitope wurden auf 6P-stabilisiertem Antigen besser dargestellt oder stabilisiert. Unter Verwendung derselben Proben hatten Personen mit hohem und mittlerem Ansprechen auch um das 4- bis 5-Fache niedrigere Titer an Anti-Spike-Antikörpern gegen BA.1-2P als gegen BA.1-6P (Abbildung 5K). Bemerkenswert ist, dass bei Low-Respondern eine geringere Änderung der Bindungsreaktivität gegen Spike BA.1 Omicron-2P und 6P (2-fache Reduzierung) im Vergleich zu WT-2P und 6P Spike ({ {28}}fache Reduktion) (Abbildung 5, J und K), was darauf hindeutet, dass Serumantikörper gegen BA.1 Omicron-reaktive Epitope bei Probanden mit niedrigem Ansprechen möglicherweise eingeschränkter sind. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass es sowohl bei WT- als auch bei Omicron-Viren zu einer verbesserten polyklonalen Bindung kommt, die durch eine natürliche Infektion an 6P-stabilisierte Spikes induziert wird.
S728–1157–ähnliche Antikörper werden optimal im Rahmen der Hybridimmunität induziert. Primäre SARS-CoV-2-Infektionen ohne Impfung sind im aktuellen globalen Umfeld selten geworden, und mehrere Studien haben berichtet, dass die SARS-CoV-2-Immunität bei Personen mit spezifischen Impf-/Infektionsvorgeschichten unterschiedlich ist. Daher versuchten wir als Nächstes zu untersuchen, welche häufigen Expositionen, abgesehen von der WT-Infektion mit SARS-CoV-2 der Vorfahren, allein S728–1157-ähnliche Antikörper im Plasma von monovalenten mRNA-basierten Impflingen mit und ohne Vorbehandlung wirksam induzieren würden Infektion. Die erforderlichen Bioproben haben wir aus der Studienkohorte „Protection Associated with Rapid Immunity to SARS-CoV-2“ (PARIS) erhalten, die das Gesundheitspersonal seit Beginn der Pandemie in Längsrichtung beobachtet (44). Wir haben Plasmaproben von vollständig immunisierten (2 × geimpften) Studienteilnehmern mit und ohne Infektion sowie von geboosterten Teilnehmern (3 × geimpft) mit und ohne Infektion ausgewählt. Darüber hinaus haben wir auch Proben von Studienteilnehmern einbezogen, die den bivalenten mRNA-Impfstoff (Vorfahren WA1/2020 plus Omicron BA.5) erhalten hatten (Abbildung 6A und Ergänzungstabelle 2). Die Durchbruchsinfektionen bei Teilnehmern, die Auffrischungsimpfungen erhalten hatten, ereigneten sich zu einer Zeit, als die Omicron-Linien alle anderen SARS-CoV-2-Linien im Großraum New York verdrängt hatten. Wir fanden heraus, dass doppelt geimpfte Personen unter den fünf getesteten Probengruppen die niedrigsten Titer an S728-1157-kompetitiven Serumantikörpern aufwiesen (Abbildung 6B). Bemerkenswerterweise ähnelten diese Werte denen unserer rekonvaleszenten, ungeimpften Kohorte (alle Responder; Abbildung 5B). Im Vergleich dazu zeigten Personen mit einer Vorgeschichte natürlicher Infektionen, einschließlich rekonvaleszenter Personen mit 2 von 3 Impfdosen, und Personen, die eine Durchbruchinfektion erlitten hatten und eine bivalente Auffrischungsimpfung erhielten, im Vergleich zu Nichtinfizierten signifikant höhere Werte der S728-1157-Auslösung aber geimpfte Personen (Abbildung 6B). Obwohl die nichtinfizierte 3--Dosisgruppe im Vergleich zur 2--Dosisgruppe nur einen nicht signifikanten Anstieg aufwies, zeigte die paarweise Aufschlüsselung nach Impfstofftyp, dass homologe dritte Dosen von BNT162b2 und mRNA-1273 die S{{ 38}}wie neutralisierende Antikörpertiter um 2,72 × bzw. 2,85 × (Abbildung 6, C und D). Zu beachten ist, dass unter den Teilnehmern mit insgesamt 3 Kontakten mit Spike auf irgendeine Weise die S728-1157-ähnlichen Antikörpertiter bei rekonvaleszenten Doppelgeimpften im Vergleich zu infektionsnaiven Dreifachgeimpften dreimal höher waren, was darauf hindeutet, dass SARS-CoV{{ Eine 51}}-Infektion induziert diesen Klonotyp optimaler. Unter den Hybridimmunitätsgruppen stellten wir fest, dass die Mehrheit der geboosterten Personen mit Durchbruch, die die bivalente Auffrischimpfungsdosis erhielten, im Vergleich zu vor Omicron-Rekonvaleszenten geimpften Gruppen nur geringfügig höhere S728-1157-Antikörpertiter aufwiesen, was darauf hindeutet, dass die S{{53 }} Der Titer näherte sich wahrscheinlich nach 3 Expositionen einem Plateau. Wir untersuchten auch die Titer polyklonaler Antikörper, die zusätzlich zu S728-1157 mit CC12.3 und CR3022 konkurrierten. Alle Personen zeigten relativ hohe Titer an CC12.3-- und CR{61}}-ähnlichen Antikörpern, unabhängig von der Anzahl und Art der Expositionen (ergänzende Abbildung 5), im Gegensatz zu dem, was wir für S728-1157- beobachteten wie Antikörper. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass sowohl eine SARS-CoV-2-Infektion als auch eine mRNA-Impfung zur Induktion von S728-1157--ähnlichen Antikörpern beitragen, wobei Infektionen bei geimpften Personen eine dominantere Rolle spielen.
Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem
Schließlich stellten wir beim Vergleich der Reaktionen gegen 2P- und 6P-stabilisierte Spikes in der mRNA-Impfkohorte fest, dass die meisten Gruppen ähnliche Mengen an Antikörpern gegen beide Konstrukte hervorriefen. Die Ausnahme hiervon bildete die nicht infizierte dreifach geimpfte Gruppe, die im Vergleich zum 6P-stabilisierten Spike eine statistisch höhere, wenn auch nur leicht erhöhte Reaktivität gegenüber dem 2P zeigte (Abbildung 6E). Diese Daten legen nahe, dass im Gegensatz zur natürlichen Infektion (Abbildung 5, J und K) die Impfung allein eine polyklonale Reaktion hervorruft, die im Einklang mit dem Spike{{12 }}P-Formulierung aktueller Impfstoffe. Letztendlich stützen diese Ergebnisse die Idee, dass die 6P-Stabilisierung künftiger SARS-CoV-2-Impfstoffe von großem Nutzen bei der Induktion breit schützender Antikörperklonotypen wie S728-1157 sein könnte.
Abbildung 5. Konkurrenz von Antikörpern im Rekonvaleszenzserum mit weitgehend neutralisierenden RBD-reaktiven mAbs und Vergleich der Antikörperreaktion im Serum gegen 6P- und 2P-stabilisierte Spikes
Abbildung 6. mRNA-geimpfte Serumantikörperkonkurrenz mit S728-1157 neutralisierenden RBD-reaktiven mAbs und Vergleich der Serumantikörperantwort gegen 6P- und 2P-stabilisierte Spikes.
Diskussion
In dieser Studie identifizieren wir einen potenten bnAb, der aus einer Gedächtnis-B-Zelle einer Person isoliert wurde, die sich während der ersten Welle der COVID-19-Pandemie von einer SARS-CoV-2-Infektion erholt hatte. Dieser bnAb, S728- 1157, behielt eine erhebliche Bindungsreaktivität bei und hatte eine konsistente neutralisierende Aktivität gegen alle getesteten SARS-CoV-2 VOC, einschließlich Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 und XBB und konnte die Titer infektiöser Viren nach einer Delta- und BA.1-Infektion bei Hamstern erheblich reduzieren.
Wir fanden heraus, dass Rekonvaleszenzserum aus unserer Kohorte geringe Konzentrationen an Antikörpern enthielt, die mit S728-1157 (einem Klasse-1-/RBS-A-Antikörper) und Klasse-2-Epitop-mAbs konkurrieren. Dies deutet darauf hin, dass S728-1157 im Vergleich zu anderen Antikörpern, die auf Epitope der Klasse 1 abzielen, etwas einzigartig ist und selten im RBD-spezifischen Speicher-B-Zellpool induziert wird. Stattdessen schien unsere natürliche Infektionskohorte Antikörper zu induzieren, die auf das CR3022-Epitop (Klasse 4) abzielten. Antikörper dieser Spezifität sind häufig kreuzreaktiv, neutralisieren jedoch weniger stark als auf RBS gerichtete Antikörper (14, 17). Diese Daten ergänzen unsere früheren Ergebnisse, die zeigen, dass eine große Menge an Antikörpern der Klasse 3/S309 in Rekonvaleszenzseren zur Neutralisierungsaktivität gegen Alpha- und Gamma-Varianten beitragen kann, wohingegen ein Mangel an Antikörpern der Klasse 2 für eine verringerte Neutralisierungsfähigkeit gegen Delta verantwortlich sein könnte (15). . Ungeachtet dessen wird berichtet, dass die Breite der Aktivität der meisten dieser auf RBS gerichteten Antikörper (RBS-A/Klasse 1, RBS-B, C/Klasse 2 und RBS-D, S309/Klasse 3) gegen Omicron-Varianten äußerst begrenzt ist (11, 40, 45).
Die größte Herausforderung für die Zukunft wird darin bestehen, herauszufinden, wie die Bildung weitgehend kreuzreaktiver Antikörper gegen konservierte RBS-Epitope verbessert werden kann. In diesem Zusammenhang haben wir hier beobachtet, dass Personen mit Hybridimmunität deutlich höhere Titer an S728-1157--ähnlichen Antikörpern aufwiesen als geimpfte Personen ohne vorherige Infektion. Wichtig ist, dass dieses Phänomen auch dann beobachtet wurde, wenn die Anzahl der Expositionen kontrolliert wurde (d. h. bei rekonvaleszenten doppelt geimpften Personen im Vergleich zu nicht infizierten dreifach geimpften Personen), was darauf hindeutet, dass ein Element der infektionsbedingten Immunität (oder eine Impfstoffformulierung, die diese Art von Immunität nachahmen kann) ist wichtig für die Auslösung dieses Klonotyps. Dies steht im Einklang mit experimentellen Erkenntnissen, die belegen, dass Personen mit Hybridimmunität breitere Antikörper-Reaktivitätsprofile aufweisen als Personen, die nur eine durch Impfung oder Primärinfektion hervorgerufene Immunantwort aufweisen (9).
Die hierin gezeigten Strukturen veranschaulichten, dass S728-1157 das RBS-A/Klasse-1-Epitop in der Up-Konformation RBD band. Dieses Epitop scheint auf 6P-stabilisierten Spikes, von denen berichtet wurde, dass sie im Upstate 2 RBDs aufweisen, leichter zugänglich zu sein als auf 2P-Spikes, die nur 1 (30, 33, 46, 47) aufweisen und gegen die unsere Antikörper wirken Spezifisch für Spikes in der Up-Konformation zeigen verbesserte Bindung. S728-1157 wurde nach einer natürlichen Infektion isoliert; In solchen Kontexten ist die Wahrscheinlichkeit, S728-1157-ähnliche Klone zu induzieren, wahrscheinlich höher, da die RBD in der Lage sein muss, eine Up-Konformation anzunehmen, auch vorübergehend, um an ACE2 zu binden und dadurch dieses Epitop freizulegen. Im Gegensatz zu den meisten IGHV3-53/3-66 RBS-A/Klasse-1-Antikörpern kann S728-1157 Schlüsselmutationen in VOC-Spitzen unter Verwendung umfangreicher Wechselwirkungen zwischen CDR-H3 und dem RBD (29, 48–50). S728-1157 verwendet im Vergleich zu anderen weniger breiten Antikörpern wie CC12.3 (IGKV3-20) auch eine andere leichte Kette (IGLV3-9), was sich auf die gesamten Bindungsinteraktionen auswirken kann; Unsere Analyse zeigt jedoch, dass zwischen der S728-1157-Leichtkette und dem RBD im Vergleich zu CC12.3 weniger Wasserstoffbrückenbindungen bestehen (Ergänzungstabelle 7). Obwohl die meisten CDR-H3-Kontaktreste, die für die VOC-Kreuzreaktivität in dieser Wechselwirkung entscheidend sind, keimbahnkodiert sind und nicht durch somatische Mutationen eingeführt werden, sind es mehrere somatisch mutierte Reste in Gerüstregionen oder CDR-H1, CDR-H2 und CDR-L1 an der Interaktion mit SARS-CoV-2 RBD beteiligt. Einerseits deutet dies darauf hin, dass Gedächtnis-B-Zellen, die für Antikörper der IGHV3-53/66-Klasse kodieren, durch weitere Affinitätsreifung einen ähnlichen Grad an Kreuzreaktivität erlangen könnten. Andererseits deutet dies auch auf die Möglichkeit hin, auf die Keimbahn gerichtete Immunogene zu entwickeln, die auf S728-1157-ähnliche naive B-Zellen abzielen. Während es schwierig sein kann, Impfstoffe zu entwickeln, die spezifisch S728-1157-ähnliche Antikörper mit ausgewählten CDR-H3s hervorrufen können, die in der Lage sind, die VOC-Mutationen zu überwinden, ist es ermutigend, dass eine IGHV-Genrestriktion bei anderen potenten SARS-CoV{ {58}} Studien zu neutralisierenden mAbs (13, 15, 20–27). Alternativ könnte dies auch durch eine iterative Immunisierung mit optimierten RBD-Immunogenen möglich sein, wie bereits für andere Krankheitserreger berichtet wurde (51–55).
Obwohl viele Mutationen in der RBS-A/Klasse-1-Antigenstelle (18) beobachtet wurden, sind im Hinblick auf das S728-1157-Epitop 13 von insgesamt 15 RBD-Kontaktresten und 2 von 3 CDR-H{{9} }gebundene RBD-Kontaktrückstände bleiben in Omicron und allen anderen VOCs erhalten. Dies deutet darauf hin, dass die RBD-Region, in der sich das S728-1157-Epitop befindet, möglicherweise Reste enthält, die für seine dynamische Funktion und virale Fitness entscheidend sind, und daher gegenüber Mutationen und Antigendrift weniger tolerant wäre als die umgebenden RBS-A/Klasse-1-Stellenreste. Wenn dies der Fall ist, sollte die Tendenz, dass dieses bestimmte Epitop bei der Entwicklung viraler Varianten verloren geht, verringert werden, wodurch die Charakterisierung von S728-1157 und ähnlichen Antikörpern und Epitopen für Varianten-resistente Impfstoffe oder die Entwicklung von mAb-Therapie wichtig wird. Zusammenfassend identifiziert unsere Studie bnAbs, die das Immunogendesign für variantensichere Coronavirus-Impfstoffe der nächsten Generation beeinflussen oder als mAb-Therapeutika dienen können, die gegen die Entwicklung von SARS CoV-2 resistent sind. Insbesondere im Hinblick auf die kombinierte Wirksamkeit und Breite scheint S728-1157 der bislang beste isolierte Antikörper seiner Klasse zu sein. Da dieser Antikörper bei 6P-Stabilisierung leichter bindet, wird vorhergesagt, dass er bevorzugt durch 6P-stabilisierte rekombinante Spike-Proteine oder das gesamte Virus induziert wird, was darauf hindeutet, dass die Hexaprolin-Modifikation zukünftigen Impfstoffkonstrukten zugute kommen könnte, um optimal vor zukünftigem SARS-CoV zu schützen -2-Varianten und andere Arboviren.
Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem
Methoden
Isolierung monoklonaler Antikörper. PBMCs wurden aus Leukoreduktionsfiltern isoliert und wie zuvor beschrieben eingefroren (24). B-Zellen wurden über FACS aus PBMCs angereichert. Die Zellen wurden mit CD19, CD3 und an Oligo-Fluorophor konjugierten Antigensonden gefärbt; Die interessierenden Zellen wurden als CD3– CD19+ Antigen+ identifiziert. Alle mAbs wurden aus oligomarkierten, nach Antigenködern sortierten Zellen erzeugt, die wie zuvor beschrieben durch Einzelzell-RNA-Seq identifiziert wurden (15, 24). Die in dieser Studie generierten Daten zu einzelnen B-Zellen wurden bei Gene Expression Omnibus hinterlegt: GSE171703 und GSM5231088–GSM5231123.
Antigenspezifische B-Zellen wurden ausgewählt, um mAbs basierend auf der von JMP Pro 15 analysierten Antigen-Sondenintensität zu erzeugen. Gene für die schwere und leichte Antikörperkette wurden von Integrated DNA Technologies (IDT) synthetisiert und in menschliches IgG1 und menschliche κ- oder λ-Leichtkette kloniert Expressionsvektoren durch Gibson-Assemblierung, wie zuvor beschrieben (56). Die schweren und leichten Ketten des entsprechenden mAb wurden vorübergehend in HEK293T-Zellen (ATCC) cotransfiziert. Nach 18-stündiger Transfektion wurden die transfizierten Zellen mit proteinfreiem Hybridommediumüberstand (PFHM-II, Gibco) ergänzt. Der Überstand, der sekretierten mAb enthielt, wurde am Tag 4 geerntet und unter Verwendung von Protein-A-Agarose-Kügelchen (Thermo Fisher Scientific) wie zuvor beschrieben gereinigt (56). Sequenzen der schweren und leichten Ketten der gut charakterisierten Antikörper wurden aus der Protein Data Bank (PDB), LY-CoV555 (PDB-ID: 7KMG), CR3022 (PDB-ID: 6W7Y) und REGN1{{ abgeleitet. 125}}933 (PDB-ID: 6XDG) und wurden wie oben beschrieben synthetisiert. Der CC12.3-mAb (PDB-ID: 6XC4) wurde von Meng Yuan am Scripps Research Institute (San Diego, Kalifornien, USA) bereitgestellt. Expression rekombinanter Spike-Proteine. Der rekombinante D614G SARS-CoV-2-Spike in voller Länge (FL), BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, Y505A und Y505F), Kombinations-RBD-Mutante (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 RBD und MERS-CoV RBD wurden intern generiert. Kurz gesagt, die rekombinanten Antigene wurden unter Verwendung von Expi293F-Zellen (Thermo Fisher Scientific) exprimiert. Das interessierende Gen wurde in einen Säugetier-Expressionsvektor (hausintern modifiziertes AbVec) kloniert und mit dem ExpiFectamine 293-Kit (Thermo Fisher Scientific) gemäß dem Protokoll des Herstellers transfiziert. Der Überstand wurde am Tag 4 nach der Transfektion geerntet und mit Ni-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA)-Agarose (Qiagen) inkubiert. Die Reinigung wurde unter Verwendung einer Schwerkraftflusssäule durchgeführt und mit imidazolhaltigem Puffer wie zuvor beschrieben eluiert (57, 58). Das Eluat wurde gepuffert und mit PBS unter Verwendung einer Amicon-Zentrifugeneinheit (Millipore) ausgetauscht. Die rekombinanten FL-Spikes wurden durch 2P-Mutationen der Varianten B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 und BA.4 Omicron stabilisiert und waren Hergestellt im Sather Laboratory des Seattle Children's Research Institute. Die K417V-, N439K- und E484K-RBDs sowie die rekombinanten FL-Spike-WT-2P und 6P wurden im Krammer-Labor an der Icahn School of Medicine am Mount Sinai hergestellt. Das SARS-CoV-2-6P-Mut7 und das Spike BA.1-6P wurden wie in einer früheren Studie beschrieben (59) entworfen und hergestellt. Die Proteinsequenzen und Ressourcen für jedes Antigen sind in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführt. ELISA. Rekombinante SARS-CoV-2-Spike/RBD-Proteine wurden auf Mikrotiterplatten mit hoher Proteinbindung (Costar) mit 2 μg/ml in PBS bei 50 μl/Vertiefung beschichtet und über Nacht bei 4 °C aufbewahrt. Die Platten wurden mit PBS mit 0,05 % Tween 20 (PBS-T) gewaschen und mit 150 μl PBS mit 20 % FBS 1 Stunde lang bei 37 °C blockiert. Monoklonale Antikörper wurden seriell {{107}fach verdünnt, beginnend mit 10 ug/ml in PBS, und in den Vertiefungen 1 Stunde lang bei 37 Grad inkubiert. Anschließend wurden die Platten gewaschen und mit HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Human-IgG-Antikörper (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098, 1:1,000) 1 Stunde lang bei 37 Grad inkubiert. Nach dem Waschen wurden 100 μl Super AquaBlue ELISA-Substrat (eBioscience) pro Vertiefung hinzugefügt. Die Absorption wurde bei 405 nm mit einem Mikroplatten-Spektrophotometer (Bio-Rad) gemessen. Die Tests wurden unter Verwendung des Kontrollantikörpers S144-509 (15) mit bekannten Bindungseigenschaften in jeder Platte standardisiert und die Platten wurden entwickelt, bis die Absorption der Kontrolle eine OD von 3,0 erreichte. Alle mAbs wurden doppelt getestet und jedes Experiment wurde zweimal durchgeführt.
Serum-ELISA. Mikrotiterplatten mit hoher Proteinbindung wurden über Nacht bei 4 Grad mit rekombinanten SARS-CoV-2-Spike-Antigenen in einer Konzentration von 2 µg/ml in PBS beschichtet. Die Platten wurden mit PBS 0.05 % Tween gewaschen und mit 200 μL PBS 0.1 % Tween + 3 % blockiert. Magermilchpulver 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) rühren. Plasmaproben wurden vor der Durchführung des serologischen Experiments eine Stunde lang bei 56 Grad hitzeinaktiviert. Das Plasma wurde seriell um das 2-fache in PBS 0,1 % Tween + 1 % Magermilchpulver verdünnt. Die Platten wurden mit Serumverdünnungen 2 Stunden lang bei RT inkubiert. Der HRP-konjugierte Ziegen-Anti-Human-Ig-Sekundärantikörper, verdünnt im Verhältnis 1:3, 000 mit PBS 0,1 % Tween + 1 % Magermilchpulver, wurde zum Nachweis der Bindung von Antikörpern verwendet. Nach einer Stunde Inkubation wurden die Platten 10 Minuten lang mit 100 μl SigmaFast OPD-Lösung (Sigma-Aldrich) entwickelt. Anschließend wurden 50 μl 3M HCl verwendet, um die Entwicklungsreaktion zu stoppen. Die Absorption wurde bei 490 nm mit einem Mikroplatten-Spektrophotometer (Bio-Rad) gemessen. Die Endpunkttiter wurden aus der sigmoidalen 4PL-Standardkurve (wobei x die logarithmische Konzentration ist) für jede Probe extrapoliert. Die Nachweisgrenze (LOD) ist definiert als die mittlere + 3 SD des OD-Signals, das mit Plasma von Prä-SARS-CoV-2-Personen aufgezeichnet wurde. Alle Berechnungen wurden in der GraphPad Prism-Software (Version 9.0) durchgeführt.
Wettbewerb ELISA. Um die Ziel-Epitop-Klassifizierung von RBD-reaktiven mAbs zu bestimmen, wurden Konkurrenz-ELISAs unter Verwendung anderer mAbs mit bekannten Epitop-Bindungseigenschaften als Kompetitor-mAbs durchgeführt. Mitbewerber-mAbs wurden mit EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (Thermo Fisher Scientific) 2 Stunden lang bei RT biotinyliert. Das überschüssige Biotin biotinylierter mAbs wurde mit Zeba-Spin-Entsalzungssäulen (Thermo Fisher Scientific) mit einem Molekulargewichts-Cutoff (MWCO) von 7k entfernt. Die Platten wurden über Nacht bei 4 °C mit 2 μg/ml RBD-Antigen beschichtet. Die Platten wurden mit PBS – 20 % FBS für 2 Stunden bei RT blockiert und die 2-fache Verdünnung der mAbs einer unbestimmten Klasse oder eines unbestimmten Serums wurde hinzugefügt, beginnend bei 20 ug/ml mAbs und eine 1:10-Verdünnung des Serums. Nach 2-stündiger Antikörper-Inkubation bei RT wurde der biotinylierte Konkurrenz-mAb in einer Konzentration zugegeben, die doppelt so hoch war wie seine Dissoziationskonstante (KD), und weitere 2 Stunden bei RT zusammen mit dem zuvor zugegebenen mAb oder Serum inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und mit 100 μl HRP-konjugiertem Streptavidin (Southern Biotech) in einer Verdünnung von 1:1000 1 Stunde lang bei 37 Grad inkubiert. Die Platten wurden mit dem Super AquaBlue ELISA-Substrat (eBioscience) entwickelt. Um die Tests zu normalisieren, wurde der biotinylierte konkurrierende mAb in eine Vertiefung ohne konkurrierende mAbs oder Serum als Kontrolle gegeben. Die Daten wurden aufgezeichnet, als die Absorption der Kontrollvertiefung eine OD von 1,0–1,5 erreichte. Die prozentuale Konkurrenz zwischen mAbs wurde dann berechnet, indem die beobachtete OD einer Probe durch die von der Positivkontrolle erreichte OD geteilt, dieser Wert von 1 abgezogen und mit 100 multipliziert wurde. Für Serum wurden die ODs log10-transformiert und durch nichtlineare Regression analysiert, um die 50 zu bestimmen %-Hemmkonzentrationswerte (IC50) mit der GraphPad Prism-Software (Version 9.0). Die Daten wurden in Log1P umgewandelt und in einem Diagramm dargestellt, das die reziproke Serumverdünnung des IC50 der Serumverdünnung darstellt, die eine 50-prozentige Konkurrenz mit dem interessierenden Konkurrenz-mAb erreichen kann. Alle mAbs wurden doppelt getestet, jedes Experiment wurde zweimal unabhängig durchgeführt und die Werte aus zwei unabhängigen Experimenten wurden gemittelt.
Plaque-Assays. Plaque-Assays wurden mit Viren der SARS-CoV-2-Variante auf Vero E6/TMPRSS2-Zellen (Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB)) durchgeführt (Ergänzungstabelle 5). Die Zellen wurden kultiviert, um eine Konfluenz von 90% zu erreichen, bevor sie trypsiniert und mit einer Dichte von 3 × 104 Zellen/Well in Platten mit 96-Well ausgesät wurden. Am folgenden Tag wurden 102 PFUs der SARS-CoV-Variante -2 mit {{12}fach verdünnten mAbs eine Stunde lang inkubiert. Das Antikörper-Virus-Gemisch wurde mit Vero E6/TMPRSS2-Zellen 3 Tage lang bei 37 Grad inkubiert. Die Platten wurden mit 20 % Methanol fixiert und dann mit Kristallviolettlösung gefärbt. Die vollständigen Hemmkonzentrationen (IC99) wurden mithilfe des Logarithmus (Inhibitor) gegenüber der normalisierten Reaktion (variable Steigung) berechnet, der in GraphPad Prism (Version 9.0) durchgeführt wurde. Alle mAbs wurden doppelt getestet und jedes Experiment wurde zweimal durchgeführt. Fokusreduktions-Neutralisationstest. Als zusätzliche Plattform neben dem Plaque-Assay wurden Fokusreduktions-Neutralisationstests (FRNTs) zur Bestimmung der Neutralisationsaktivitäten eingesetzt. Serienverdünnungen des Serums, beginnend bei einer Endkonzentration von 1:20, wurden mit 103 fokusbildenden Viruseinheiten pro Vertiefung gemischt und 1 Stunde lang bei 37 Grad inkubiert. Als Kontrolle diente eine gepoolte präpandemische Serumprobe. Das Antikörper-Virus-Gemisch wurde auf Vero E6/TMPRSS2-Zellen (JCRB) in 96-Well-Platten geimpft und 1 Stunde lang bei 37 Grad inkubiert. In jede Vertiefung wurde ein gleiches Volumen Methylcelluloselösung gegeben. Die Zellen wurden 16 Stunden lang bei 37 Grad inkubiert und anschließend mit Formalin fixiert. Nachdem das Formalin entfernt worden war, wurden die Zellen mit einem Maus-mAb gegen SARS-CoV-1/2-Nukleoprotein [Klon 1C7C7 (Sigma-Aldrich)] immungefärbt, gefolgt von einem HRP-markierten Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin (Sigma-Aldrich) Aldrich; A8924). Die infizierten Zellen wurden mit TrueBlue Substrate (SeraCare Life Sciences) gefärbt und anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wurden die Fokuszahlen mithilfe eines ImmunoSpot S6-Analysegeräts, der ImmunoCapture-Software und der BioSpot-Software (Cellular Technology) quantifiziert. Der IC50 wurde aus dem interpolierten Wert des Protokolls (Inhibitor) gegenüber der normalisierten Reaktion unter Verwendung einer nichtlinearen Regression mit variabler Steigung (4 Parameter) berechnet, die in GraphPad Prism (Version 9.0) durchgeführt wurde.
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