Cyclopentanon übt Anti-Melanogenese- und Anti-Falten-Aktivitäten bei B16F10-Melanomen aus
Mar 26, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Hee Jin Jung 1, A Kyoung Lee 1,2, Yeo Jin Park 1,2, Sanggwon Lee 1,2, Dongwan Kang 1,2, Young Suk Jung 1,2, Hae Young Chung 1,2 und Hyung Ryong Moon 1, 2,*
Abstrakt:Die Exposition gegenüber ultravioletter (UV) Strahlung ist die Hauptursache für extrinsische Hautalterung, die zu Hyperpigmentierung und Faltenbildung der Haut führt. In dieser Studie untersuchten wir die aufhellende Wirkung von (2E,5E)-2,5-bis(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene)cyclopentanon (BHCP) auf das B16F10-Melanom und seine Anti- Faltenaktivität auf Hs27-Fibroblastenzellen. Es wurde festgestellt, dass BHCP Tyrosinase wirksam hemmt, mit Werten der 50-prozentigen Hemmkonzentration (IC50) von 1,10 μM und 8,18 μM Formycophenolat (L-Tyrosin) und Diphenolase (L-DOPA), und die Enzymkinetikstudie ergab, dass BHCP ein kompetitiver Tyrosinase-Inhibitor ist . Darüber hinaus hemmte BHCP signifikant den Melaningehalt und die Aktivität der zellulären Tyrosinase und regulierte die Spiegel des Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktors (MITF), die phosphorylierten Spiegel des cAMP-Response-Element-Bindungsproteins (CREB) und die Tyrosinase in Melanozyten-stimulierendem Hormon (-MSH)-induziert herunter B16F10-Melanomzellen. Darüber hinaus hemmte BHCP die Phosphorylierung von p65 und die Expression von Matrix-Metalloproteinasen (MMP-1, MMP-9, MMP-12 und MMP-13) in Hs27-Fibroblasten mit UV-Strahlung stimuliert. Daher zeigen unsere Ergebnisse, dass BHCP ein guter Kandidat für die Entwicklung von Therapeutika für Krankheiten sein könnte, die mit Hyperpigmentierung und Faltenbildung einhergehen.
Schlüsselwörter: (2E,5E)-2,5-Bis(3-hydroxy-4-methoxybenzyliden)cyclopentanon (BHCP); Tyrosinase-Inhibitor; Anti-Melanogenese; Anti-Falten
Cistanche istAnti-Falten.
1. Einleitung
Die Hautalterung ist ein komplexer und fortschreitender Prozess, der zu funktionellen und ästhetischen Veränderungen der Haut führt, für den sowohl intrinsische als auch extrinsische Faktoren verantwortlich sind [1]. Extrinsische Hautalterung wird durch umweltbedingte Aggressoren wie ultraviolette (UV) Strahlung, Stress oder Rauchen verursacht. Sie wird jedoch hauptsächlich durch wiederholte Einwirkung von UV-Strahlung durch die Sonne verursacht, was als Lichtalterung bezeichnet wird. Photoaging der Haut ist durch grobe und tiefe Falten, Dicke, Rauheit, Dyspigmentierung und histologische Veränderungen gekennzeichnet [2–4].
Tyrosinase (EC 1.14.18.1), die auch als Polyphenoloxidase bekannt ist, ist eines der multifunktionalen kupferhaltigen Enzyme, die an der Melaninsynthese beteiligt sind und in der Natur weit verbreitet sind [5]. Tyrosinase ist typischerweise in einer Mehrzahl von Mikroorganismen, Pflanzen, und Tiere. In Pflanzen wirkt Tyrosinase durch die Oxidation von Monophenolen zu Diphenolen (Mycophenolat-Aktivität) und ist an der Oxidation von o-Diphenolen zu o-Chinonen (Diphenolase-Aktivität) beteiligt, gefolgt von der Oxidation von Chinonen zu dunkelbraunen Pigmenten [6].
Melanogenese ist die Umwandlung von L-Tyrosin in 3,4--Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA), wodurch L-DOPA in DOPA-Chinin umgewandelt wird [7]. Daher spielt Tyrosinase eine wichtige Rolle bei der Melaninproduktion in Melanozyten, und die Hemmung von Tyrosinase ist ein attraktives Ziel für die Verbesserung pigmentierungsbedingter Störungen und für die Entwicklung von Bleichmitteln [8,9]. Die Melaninsynthese wird durch mehrere Stimuli induziert, wie UV und Chemikalien, einschließlich Isobutylmethylxanthin (IBMX) und Alpha-Melanozyten-stimulierendes Hormon (-MSH). -MSH bindet an seinen Rezeptor Melanocortin-1-Rezeptor (MC1R) und erhöht anschließend den zytoplasmatischen zyklischen AMP(cAMP)-Spiegel. Der erhöhte cAMP-Spiegel aktiviert die Proteinkinase A (PKA), die über die Phosphorylierung des cAMP-Responseelement-bindenden Proteins (CREB) die Expression des Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktors (MITF) induziert. MITF induziert die Expression von Tyrosinase, Tyrosinase-related protein (TRP)-1 und TRP-2, was schließlich zu einer erhöhten Melaninsynthese führt [10]. MITF gilt als Schlüsseltranskriptionsfaktor der Melanogenese; Daher wurden viele Studien durchgeführt, um die Expression von MITF zu kontrollieren, um die Melanogenese zu hemmen [11].
Es ist bekannt, dass die Faltenbildung eng mit dem Abbau der extrazellulären Matrix der Haut verbunden ist, und UV-Strahlung aktiviert den Kernfaktor-κB (NF-κB), wodurch die Produktion von Kollagenfragmenten und Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) erhöht wird [2]. MMPs sind zinkabhängige Endopeptidasen, die beim Umbau der extrazellulären Matrixstruktur in der Haut wichtig sind. Daher ist der übermäßige Abbau von Kollagen und der Matrix durch UV-induzierte MMPs ein charakteristisches Merkmal lichtgeschädigter Haut, und MMPs werden als Hauptmarker für UV-induzierte Lichtalterung sowie Hautentzündungen verwendet [12].
Die Curcumin-ähnlichen Diarylheptanoid-Skelettderivate wurden einschließlich Antioxidantien, Antikrebsaktivitäten, Gerüsten, einschließlich (2E,5E)-2,5-bis(3-hydroxy-4-methoxybenzyliden)cyclopentanon, beschrieben (BHCP) (Abbildung 1),um ein breites Spektrum an entzündungshemmenden, antimelanogenetischen Wirkungen zu zeigen, insbesondere Leow et al. [19] berichteten in Bioactivities und Anti-Tyrosinase [13–18]dibenzylidene-cyclopentanone 2014, die über die Regulierung des Wnt/-catenin-Signalwegs zu den schützenden Wirkungen auf das menschliche Osteosarkom beitragen könnten. Die Anti-Melanogenese- und Anti-Falten-Wirkungen von BHCP müssen jedoch noch entdeckt werden, und die molekularen Mechanismen, die seiner Aktivität zugrunde liegen, wurden noch nicht eindeutig aufgeklärt.
Abbildung 1. Struktur von (2E,5E)-Bis(3-hydroxy-4-methoxybenzyliden)cyclopentanon (BHCP).
In der vorliegenden Studie untersuchten wir das Anti-Melanogenese- und Anti-Falten-Potenzial von BHCP und versuchten, den beteiligten Mechanismus zu identifizieren, insbesondere im Hinblick auf den Melaningehalt und die zelluläre Tyrosinase-Aktivität, die mit einem Tyrosinase-Inhibitionsassay und einer Analyse der Enzymkinetik untersucht wurden. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass BHCP eine hemmende Wirkung auf die Melanogenese und Falten ausübt, die mit der Herunterregulierung von CREB/MITF/Tyrosinase in -MSH-induzierten B16F10-Mausmelanomzellen und der Hemmung der Phosphorylierung von p65 und der MMP-Expression in UV-induzierten menschlichen Hs27-Fibroblasten verbunden ist.
Drachenkräuter cistanche
2. Ergebnisse und Diskussion
2.1. Synthese von (2E,5E)-2,5-Bis(3-hydroxy-4-methoxybenzyliden)cyclopentanon (BHCP)
Eine Lösung aus {{0}}Hydroxy-4-methoxybenzaldehyd (100 mg, 0,66 mmol, Isovanillin) und Cyclopentanon (0,03 ml, 0,33 mmol) in 1 N HCl-Essigsäure-Lösung (0,02 ml) wurde 2 h bei 25 °C gerührt. Nach eintägigem Stehen wurde die Reaktionsmischung mit kaltem Wasser in Gegenwart einer kleinen Menge Methanol behandelt, filtriert und mit kaltem Wasser gewaschen, um BHCP (65,9 mg) in einer Ausbeute von 56,9 % herzustellen. BHCP wurde durch spektroskopische Methoden identifiziert, einschließlich 1H- und 13C-NMR sowie durch Vergleich mit veröffentlichten Spektraldaten und Dünnschichtchromatographie (TLC)-Analyse [19]. Die Struktur ist in Abbildung 1 dargestellt.
BHCP: gelbes amorphes Pulver (CHCl3); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 9,25 (s, 2H, 2 × OH), 7,28 (s, 2H, 2 × VinylicH), 7,14 (d, 2H , J=2.0 Hz, 2 × 2-H), 7.11 (dd, 2H, J=8.5, 2.0 Hz, 2×6- H), 7,01 (d, 2H, J=8,5 Hz, 2 × 5-H), 3,81 (s, 6H, 2 × OMe), 3,01 (s, 4H, 2 × CH2) ; 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 195,5, 149,9, 147,2, 136,0, 133,1, 129,1, 124,3, 117,5, 112,8, 56,3, 26,6; ESI-MS: m/z 351 (M – H) –.
2.2. Hemmwirkung von BHCP auf die Pilz-Tyrosinase-Aktivität
Wie in Tabelle 1 gezeigt, hemmte BHCP Tyrosinase mit IC50-Werten von 1,10 ± 0,12 μM und 8,18 ± 0,44 μM, während Kojisäure (Positivkontrolle) IC50-Werte von 18,68 ± 1,40 μM und 33,89 ± 1,16 aufwies μM für Monophenolase bzw. Diphenolase. In unserer früheren Studie zu synthetischen potenziellen Inhibitoren der Tyrosinase fanden wir durch molekulare Modellierungsstudien den Mechanismus, bei dem die 3--Hydroxy- und 4--Methoxygruppen von Benzyliden große Bindungstendenzen zum aktiven Zentrum der Tyrosinase aufwiesen [20]. Aus diesem Studienergebnis ging hervor, dass seine funktionellen Gruppen (3-Hydroxy- und 4-Methoxygruppen) mit einem signifikanten Anstieg der tyrosinasehemmenden Aktivität verbunden waren.
Tabelle 1. Tyrosinase-Hemmaktivität und enzymkinetische Analyse von BHCP.
Darüber hinaus wurde der Mechanismus, der für die Tyrosinase-Hemmung durch BHCP verantwortlich ist, in der vorliegenden Studie durch enzymkinetische Analyse untersucht (Tabelle 1 und 2 ). Lineweaver-Burk-Plots wurden unter Verwendung der Daten aus den kinetischen Studien gezeichnet, und die Inhibitionskonstante (Ki) wurde aus den Dixon-Plots erhalten. Die doppelt reziproken Lineweaver-Burk-Diagramme zeigten eine kompetitive Hemmung. Wie in Abbildung 2a–c gezeigt, wirkte BHCP als kompetitiver Inhibitor sowohl von L-Tyrosin als auch von L-DOPA. Darüber hinaus sind Abschnitte auf der x-Achse von Dixon-Diagrammen häufig verwendet, um die Arten von Enzyminhibitionskonstanten (Ki) für einen Enzym-Inhibitor-Komplex zu bestimmen [21,22], wobei der Wert der x-Achse den Wert von –Ki angibt. Wie in Abbildung 2b–d dargestellt, betrugen die Ki-Werte von BHCP 1,7 μM und 10,5 μM als Substrate für L-Tyrosin bzw. L-DOPA. Da der Ki-Wert die zur Bildung eines Enzym-Inhibitor-Komplexes erforderliche Konzentration darstellt, weist ein niedrigerer Ki-Wert auf eine wirksamere Hemmung der Tyrosinase hin.
Abbildung 2. Lineweaver-Burk- (a,c) und Dixon-Diagramme (b,d) für die Hemmung des Tyrosinase-Enzyms durch BHCP.
2.3. Auswirkungen von BHCP auf die Zelllebensfähigkeit von B16F10-Melanom- und Hs27-Fibroblastenzellen
Vor der Bestimmung, ob BHCP irgendwelche Anti-Melanogenese- und Anti-Falten-Aktivitäten ausübte, untersuchten wir die Zytotoxizität von BHCP auf B16F10-Zellen und Hs27-Zellen durch Behandlung mit verschiedenen BHCP-Konzentrationen für verschiedene Zeitintervalle, und die Zelllebensfähigkeit wurde mit dem EZ-Cytox-Assay gemessen. Wie in Abbildung 3a, b gezeigt, reduzierten bis zu 10 μM BHCP für 48 h weder das Überleben der B16F10-Zellen noch der Hs27-Zellen. Anschließend wurden weitere In-vitro-Studien zur Anti-Melanogenese- und Anti-Falten-Aktivität von BHCP mit 1, 5 und 10 μM durchgeführt.
Figur 3.Zelllebensfähigkeit von BHCP auf B16F10-Melanom (a) und Hs27-Fibroblastenzellen (b).
2.4. Hemmung von BHCP gegen Melaningehalt und zelluläre Tyrosinaseaktivität in B16F10-Melanomzellen
Um zu bestimmen, ob BHCP ein inhibitorisches Potenzial auf den Melaningehalt von -MSH-induzierten B16F10-Zellen ausübt, wurden Zellen mit den angegebenen unterschiedlichen Konzentrationen (1, 5 und 10 μM) von BHCP oder Kojisäure (5 mM) für 24 h vorbehandelt und dann stimuliert mit -MSH für 48 h. Wie in Abbildung 4a gezeigt, nahm der Melaningehalt in den mit BHCP in Gegenwart von -MSH behandelten Zellen konzentrationsabhängig ab und zeigte 113 Prozent bei 1 μM, 106 Prozent bei 5 μM und 102 Prozent bei 10 μM im Vergleich zu Kontrollgruppe nur mit -MSH behandelt (186 Prozent). Interessanterweise hemmte BHCP (1 μM) den Melaningehalt stärker als Kojisäure (5 mM). Außerdem wurde ein zellulärer Tyrosinase-Aktivitätsassay durchgeführt, um die inhibitorische Wirkung von BHCP auf B16F10-Zellen zu messen. Wie in Abbildung 4b gezeigt, nahm BHCP konzentrationsabhängig mit der Tyrosinaseaktivität um 120 Prozent bei 1 μM, 116 Prozent bei 5 μM und 105 Prozent bei 10 μM ab, verglichen mit der Kontrollgruppe, die nur mit -MSH behandelt wurde (181 Prozent). Die hemmende Wirkung von BHCP war viel stärker als die von Kojisäure; die Hemmung von BHCP bei 1 μM war der von Kojisäure bei 5 mM (131 Prozent) überlegen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass BHCP eine aufhellende Wirkung hat, indem es die Melanin-Biosynthese und die intrazelluläre Tyrosinase-Synthese in B16F10-Melanozyten hemmt.
Abbildung 4. Hemmung des Melaningehalts (a) und der zellulären Tyrosinaseaktivität (b) von BHCP auf B16F10-Melanomzellen.
2.5. Wirkungen von BHCP auf die Expression von MITF/Tyrosinase und phosphoryliertem CREB in B16F10-Zellen
MITF, ein spezifischer Transkriptionsfaktor, spielt eine entscheidende Rolle bei der effektiven Aktivierung der melanogenen Gene, einschließlich Tyrosinase, die den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Melaninbiosynthese katalysieren: TRP-1 und TRP-2. Die Expression von MITF könnte durch die Phosphorylierung von CREB erhöht werden [23]. CREB ist ein wichtiger MITF-Promotor [24,25], und die Phosphorylierung von CREB in Melanozyten erhöht die MITF-Expression durch Bindung an das CREB (c-AMP-Response-Element-bindendes Protein) in Melanozyten [26]. Um die molekularen Wege aufzuklären, die für die antimelanogene Wirkung von BHCP auf B16F10-Zellen verantwortlich sind, untersuchten wir die Proteinspiegel von Schlüsselmolekülen, einschließlich CREB und MITF, die eine wichtige Rolle bei der Melanogenese spielen, durch Western-Blot-Analyse. Die Zellen wurden mit BHCP oder Kojisäure behandelt und dann für 48 h mit -MSH stimuliert. Das Zeitintervall für die Messungen folgte der in früheren Studien beschriebenen Methodik [27]. Wie in Fig. 5 gezeigt, stiegen die Tyrosinase- und MITF-Spiegel mit -MSH, aber BHCP verringerte diese Proteinspiegel. Darüber hinaus wurde die Phosphorylierung von CREB durch BHCP signifikant unterdrückt. Es ist bekannt, dass die Regulierung der -MSH-induzierten CREB-Phosphorylierung potenziell wichtig für die Regulierung der Pigmentierung ist [28]. Diese Ergebnisse zeigen, dass die antimelanogenen Wirkungen von BHCP aus der Herunterregulierung von MITF und Tyrosinase über die Herunterregulierung von phosphoryliertem CREB resultieren. Die vorliegende Studie legt nahe, dass die Aufklärung des Hemmmechanismus von BHCP auf Tyrosinase und Melanogenese entscheidend ist und in Zukunft weiter untersucht werden muss. Obwohl die B16F10-Melanom-Zelllinie im Allgemeinen besser geeignet ist, um Signalmechanismen in vitro zu untersuchen, stammt die B16F10-Zelllinie von einem Nagetier-Melanom. Daher sind weitere Studien an menschlichen Melanozyten erforderlich, um die Ergebnisse zu bestätigen.
Abbildung 5.Wirkungen von BHCP auf die Expressionsniveaus der Phosphorylierung von CREB, MITF und Tyrosinsein -MSH-stimulierte B16F10-Melanomzellen.
2.6. Wirkung von BHCP auf UV-induzierte NF-κB p-p65-Aktivierung in Hs27-Zellen
Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von BHCP auf die UV-induzierte Expression von Entzündungsmediatoren unter Verwendung von Hs27-Fibroblasten. Es wurde bereits früher berichtet, dass die Phosphorylierung von p65 (Ser536) für seine Fähigkeit, Gene zu transaktivieren, wesentlich ist [29]. Daher wurden die Proteinspiegel von p-p65 (Ser536) und p65 in der Kernfraktion durch Western-Blotting untersucht. Wie in 6a , b gezeigt, erhöhte UV in Hs27-Zellen die Proteinspiegel von p-p65 (Ser536) im Zellkern, während die Behandlung mit BHCP die Proteinspiegel von p-p65 (Ser536) im Zellkern verringerte. Dementsprechend wurde die Gesamtmenge an p65 im Zytoplasma durch UV verringert und durch BHCP wiederhergestellt (Abbildung 6c,d). Obwohl die Proteinexpressionsniveaus von p65 im Zytoplasma verringert und im Kern nach UV-Induktion erhöht waren, kehrte die Vorbehandlung mit BHCP diese Trends in dosisabhängiger Weise um. Somit legen diese Ergebnisse nahe, dass die Hemmung von p-p65 durch BHCP zu den schützenden Wirkungen auf Hautpigmentierung und Kollagenzerstörung gegen UV beitragen könnte.
Abbildung 6. Wirkungen von BHCP auf die Expressionsniveaus von p-p65 (Ser536) in UV-induzierten menschlichen Hs27-Fibroblastenzellen.
2.7. Wirkung von BHCP auf die Expression von MMPs in Hs27-Zellen
MMPs spielen eine wichtige Rolle bei der Hautalterung. UV-Bestrahlung verändert das Bindegewebe der Haut, indem sie die Expression von MMPs hochreguliert [30,31]. MMP-1 ist ein kollagenabbauendes Enzym, das den Abbau von Kollagen beschleunigt, das aus Typ-I-Prokollagen synthetisiert wird. MMP-9 ist ein Gelatine abbauendes Enzym, das durch MMP-1 geschnittene Kollagenfasern abbaut und so die Faltenbildung und den Elastizitätsverlust erhöht. Um die Anti-Falten-Wirkung von BHCP gegen UV-Induktion zu untersuchen, bestimmten wir die Spiegel von MMP-1- und MMP-9-Protein durch Western-Blotting. Darüber hinaus zeigten UV-induzierte Zellen einen signifikant erhöhten MMP-13-Spiegel, der anstelle von MMP-1 den Abbau von Typ-I- und III-Kollagen einleitet [32]. Wir untersuchten den Anstieg von MMPs (MMP1, MMP9, MMP12 und MMP13) nach Behandlung von UV-induzierten Hs27-Zellen mit BHCP bei 1 und 10 μM. Wie in Abbildung 7 gezeigt, stiegen die MMP-1-, MMP-9-, MMP-12- und MMP-13-Expression nach UV-Induktion an; die BHCP-Behandlung verringerte jedoch die Expression in einer Dosis -abhängige Weise. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass BHCP zur Verhinderung der Faltenbildung beitragen könnte, indem es die abnormale Produktion von MMPs reduziert, die durch UV-Exposition induziert wird. Diese Ergebnisse implizieren, dass BHCP die MMP-Expression in Hs27-Fibroblasten hemmt, um die Kollagenzersetzung und damit die Faltenbildung zu verhindern. Daher zeigt BHCP das Potential zur Verwendung als vorbeugendes und behandelndes Medikament von Hauterkrankungen.
Cistanche Stamm Vorteile
3. Material und Methoden
3.1. Chemikalien und Instrumente
Pilztyrosinase (EC 1.14.18.1), -MSH, L-Tyrosin, 3,4--Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA), Dimethylsulfoxid (DMSO) und Kojisäure wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM), fötales Rinderserum, Streptomycin und Amphotericin wurden von Gibco Life Technologies Inc. (Carlsbad, CA, USA) bezogen. Antikörper gegen MITF, CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), p65, Tyrosinase, MMP-1, MMP-9, MMP-12, MMP-13, TFIIB und -Actin wurden von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) gekauft. Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen wurden von der Millipore Corporation (Bedford, MA, USA) bezogen. Steriles Plastikgeschirr für Gewebekulturen wurde von SPL Labware (Seoul, Korea) bezogen. Die UV-Lichtquelle wurde von der Crosslinker 800-Serie (UVP, CA, USA) mit 6 Lampen (8 Watt/Lampe) bereitgestellt. Dünnschichtchromatographie und Silicagel 60 (Mesh 230–400) wurden auf SilicagelF{{27} durchgeführt. } vorbeschichtete Platten von Merck Millipore (Darmstadt, Deutschland). NMR-Spektren wurden unter Verwendung eines Varian Unity INOVA 400 (400 MHz für 1H, 100 MHz für 13C) und Varian Unity AS 500 (500 MHz für 1H) Instrumente aufgezeichnet. Chemische Verschiebungswerte (δ) werden unter Bezugnahme auf das jeweilige Restlösungsmittel oder deuterierte Peaks (δH 2,50 und δC 39,51 für DMSO) angegeben. Massenspektrometriedaten mit niedriger Auflösung wurden mit einem Expression CMS-Massenspektrometer (Advion, Ithaca, NY, USA) erhalten.
3.2. Pilz-Tyrosinase-Hemmtest
Pilz-Tyrosinase-Hemmaktivität wurde unter Verwendung sowohl von L-Tyrosin als auch von L-DOPA als Substrate bestimmt, basierend auf dem von Jung et al. [23]. Kurz gesagt, 190 μl Tyrosinase-Enzym (1000 U verdünnt mit Pilz-Tyrosinase-Puffer, einschließlich 1 mM L-Tyrosin- und L-DOPA-Lösung) wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von Verbindungen (Endkonzentration im Bereich von 1 bis 20 μM, darin gelöst) zugegeben 100 % DMSO) in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte geben, um ein Endvolumen von 200 μl bereitzustellen. Die Platte wurde 30 min lang bei 37 °C inkubiert. Die Tyrosinase-Aktivität wurde durch Messung der Extinktion bei 492 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts (TECAN, Salzburg, Österreich) quantifiziert, und die prozentuale Hemmung (Prozent) wurde aus der folgenden Gleichung erhalten:
prozentuale Hemmung=(Ac − As)/Ac × 100 (1)
wobei Ac die Extinktion der Kontrolle und As die Extinktion der Probe ist. Die IC50-Werte wurden aus den log-linearen Kurven und ihren Gleichungen berechnet. Gezeigt werden Durchschnittsergebnisse für drei Bestimmungen. Kojisäure wurde als positive Kontrolle verwendet.
3.3. Kinetische Analyse der Tyrosinase-Hemmung
Zur Bestimmung der kinetischen Mechanismen wurden zwei kinetische Methoden (Lineweaver-Burk- und Dixon-Plots) komplementär verwendet [21,22,33]. Für die doppelt reziproken Lineweaver-Burk-Plots (ein Plot von 1/Enzymgeschwindigkeit (1/V) gegen 1/Substratkonzentration (1/[S])) wurde der Inhibitionstyp unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von L-Tyrosin bestimmt (1, 2, und 4 mM) und L-DOPA (0,5, 1 und 2 mM) als Substrate in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von BHCP. Die Konzentrationen von BHCP waren wie folgt: 0, 0,5, 1,{{20}} und 2,0 μM für L-Tyrosin; und 0, 2,5, 5 und 10 μM für L-DOPA. Der Dixon-Plot ist ein graphisches Verfahren (Auftragung von 1/Enzymgeschwindigkeit (1/V) gegen Inhibitorkonzentration (I)) zur Bestimmung der Art der Enzymhemmung und wurde zur Bestimmung der Dissoziationskonstante oder Ki für den Enzym-Inhibitor-Komplex verwendet. Dixon-Diagramme (einzelne reziproke Diagramme) der Hemmung wurden in Gegenwart von L-Tyrosin-Substrat bei 1, 2 und 4 mM und {{40}}, 0 erhalten.5, 1.{ {47}} und 2,0 μM für BHCP; und L-DOPA-Substrat bei {{50}},5, 1,0 und 2,0 mM und 0, 2,5, 5,0 und 10,0 μM für BHCP.
Cistanche-Pflanzeist ein Tyrosinase-Hemmer.
3.4. Zelllinien und Zellkultur
Murine B16F10-Melanomzellen wurden von der Korean Cell Line Bank erhalten. Die menschliche Hautfibroblastenzelllinie Hs27 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) bezogen. Diese Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin, in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C gehalten. Dermale Fibroblasten auf einer 100-mm-Schale wurden mit BHCP behandelt und 50 mJ/cm2 UV in serumfreiem DMEM (UV-Lichtquelle, UVP) ausgesetzt. Die Hs27-Zellen wurden bis zu einer Konfluenz von 70–80 % in einer Platte mit 100 mm Durchmesser kultiviert und zwischen Passage Nummer 5 und 15 verwendet.
3.5. Zelllebensfähigkeitsassay
Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem EZ-Cytox-Kit-Assay bewertet. Kurz gesagt, B16F10-Zellen und Hs27-Fibroblasten wurden in einer 96--Well-Platte mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen/Well ausgesät und bei 37 °C für 24 h inkubiert. Die Zellen wurden mit frischem, serumfreiem DMEM gefüttert, das unterschiedliche Konzentrationen (0, 1, 2, 5 und 10 μM) von BHCP enthielt, und für 24 und 48 h inkubiert. Anschließend wurden 10 μl EZ-Cytox-Lösung in jede Vertiefung geladen und die Zellen für 2–4 h inkubiert. Die Extinktionsmessung der Zellen in Abwesenheit jeglicher Behandlung wurde als 100 % Zellüberleben angesehen. Jede Behandlung wurde dreifach durchgeführt und jedes Experiment wurde dreimal wiederholt.
3.6. Bestimmung des Melaningehalts-Assay
Die Wirkung von BHCP auf die -MSH-induzierte Melanogenese in B16F10-Zellen basierte auf einer zuvor verwendeten Methode mit leichten Modifikationen [34]. Kurz gesagt, B16F10-Zellen (5 × 10 4 Zellen/Vertiefung) in Platten mit 6- Vertiefungen wurden bis zu einer Konfluenz von 70–80 Prozent wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann mit unterschiedlichen Konzentrationen von BHCP (1, 5 und 10 &mgr;M) oder Kojisäure (5 mM) für 24 h behandelt und dann mit -MSH (5 &mgr;M) für 48 h stimuliert. Nach der Behandlung wurden die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS, gelöst in 90 μl 1 M NaOH-Lösung einschließlich DMSO (5 Prozent) bei 60 °C für 1 h gewaschen, und die Extinktion wurde bei 405 nm mit einem Mikroplatten-Spektrophotometer (TECAN, Salzburg) gemessen , Österreich). Um die Melaninmenge im Experiment zu messen, wurde die Hemmungsrate in den Behandlungsgruppen aus der Extinktion der bekannten Konzentrationen an synthetischem Melanin berechnet, die auf die Gesamtproteinmenge korrigiert wurden, die im Überstand der Zelllysate vorhanden war. Die Extinktion von unbehandelten Zellen wurde dreifach gemessen.
3.7. Zellulärer Tyrosinase-Aktivitätsassay
Der zelluläre Tyrosinase-Aktivitätsassay wurde durchgeführt, indem die Oxidationsrate von L-DOPA gemessen wurde [35]. B16F10-Zellen mit einer Dichte von 5 × 104/Zellen wurden in Schalen mit 6- Vertiefungen platziert und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden dann mit verschiedenen Konzentrationen von BHCP (1, 5 und 10 &mgr;M) oder Kojisäure (5 mM) für 24 h behandelt und dann mit -MSH (5 &mgr;M) für 48 h stimuliert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und in einer Lösung lysiert, die 100 &mgr;l 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,5), 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 1 Prozent Triton X-100 enthielt. Dann wurden die Zellen für 30 min in eine Tiefkühlmaschine (–80 ◦C) gegeben. Nach dem Auftauen der Zellen wurden die Zellextrakte durch 30-minütige Zentrifugation bei 12 000 U/min bei 4 ◦C gereinigt. Insgesamt 80 ul des Überstands und 20 ul L-DOPA (2 mg/ml) wurden zu einer 96--Well-Platte gegeben, und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 492 nm wurde alle 10 min während 1 h bei 37 °C gemessen C mit einem ELISA-Plattenlesegerät (TECAN, Salzburg, Österreich).
3.8. Herstellung von zytosolischen und nuklearen Extrakten von Hs27-Zellen
Die Hs27-Zellen wurden mit eiskaltem PBS gewaschen und geerntet. Ein Puffer, der 10 mM Tris (pH 8,0), 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1 % NP-40 und Protease-Inhibitoren enthielt, wurde für die Extraktion der zytosolischen Fraktionen von verwendet Zentrifugation bei 12,000 rpm bei 4 ◦C für 15 min, und Kernfraktionen wurden aus Pellets unter Verwendung eines Puffers extrahiert, der 10 mM Tris, 50 mM KCl, 100 mM NaCl und Proteaseinhibitoren enthielt, 30 min auf Eis inkubiert, und dann bei 13,000× g für 30 min bei 4 ◦C zentrifugiert, um Kernfraktionen zu erhalten.
3.9. Western-Blotting
Lysatproben wurden 1 0 Minute lang in Gelladepuffer (125 mM Tris-HCl, 4 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 0 % 2-Mercaptoethanol und 0,2 % Bromphenol) gekocht blau; pH 6,8) im Volumenverhältnis 1:1. Die Gesamtproteinäquivalente für jede Probe wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) unter Verwendung von Acrylamidgelen gemäß dem von Laemmli [36] beschriebenen Verfahren getrennt und unter Verwendung des Nasstransfersystems bei 80 V für 2 h auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden sofort in einen Blockierungspuffer (5 % fettfreie Milch) in 10 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl und 0,1 % Tween -20 gegeben. Die Blots wurden blockiert, um eine unspezifische Bindung bei 25 °C für 2 h zu verhindern. Anschließend wurden die Membranen mit einem spezifischen primären Antikörper bei 4 °C über Nacht inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit einem Meerrettichperoxidase-konjugierten sekundären Antikörper bei 25 °C für 1 h . Die Antikörpermarkierung wurde durch verstärkte Chemilumineszenz gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Die Proteinquantifizierung wurde unter Verwendung des Davinch-Chemi TM. Chemiluminescence Imaging System CAS-400SM (Core Bio, Seoul, Korea) durchgeführt. Zur Bestimmung des Molekulargewichts wurden vorgefärbte Proteinmarker verwendet.
3.10. Statistische Analyse
Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Daten wurden durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) für die Unterschiede zwischen den Behandlungen analysiert, gefolgt vom Post-hoc-Test von Bonferroni. Ein Wert von p < 0,05="" wurde="" als="" statistisch="" signifikant="">
4. Schlussfolgerung
Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse der vorliegenden Studie, dass BHCP über die Hemmung der Tyrosinase, die ein Schlüsselenzym für die Melaninbiosynthese in -MSH-induzierten B16F10-Melanozyten ist, eine hautaufhellende Wirkung hat. Darüber hinaus verringerte BHCP die Expression von MMP-Proteinspiegeln in UV-induzierten Fibroblasten, von denen erwartet wird, dass sie eine Anti-Falten-Wirkung haben. Weitere Forschung ist erforderlich, um die aufhellende und Anti-Falten-Wirkung von BHCP durch Tierversuche und klinische Studien zu bestätigen. Schließlich wurde festgestellt, dass BHCP sowohl aufhellende als auch Anti-Falten-Wirkungen hat, was auf sein Potenzial für die Entwicklung von therapeutischen Mitteln für Krankheiten hinweist, die mit Hyperpigmentierung und Faltenbildung verbunden sind.
