De-Novo-Transkriptomassemblierung und Genentdeckung von Cistanche Deserticola Fleshy Stem-Ⅱ

Funktionelle Klassifizierung aller exprimierten Transkripte basierend auf Genontologie und KEGG-Datenbanken

Die Gene Ontology (GO)-Annotation wurde aus der UniProt-Annotations- und Identitätszuordnungsdatei abgerufen. Insgesamt wurden 20.907 Transkripte, die 32,69 % der gesamten exprimierten Sequenzen ausmachten, 1.745 Funktionsbegriffen zugeordnet. Von den gesamten funktionellen GO-Begriffen machten Zuordnungen zum biologischen Prozess die Mehrheit aus (1.116, 63,95 %), gefolgt von der zellulären Komponente (329, 18,85 %) und der molekularen Funktion (300, 17,20 %). Die zugewiesenen Funktionen exprimierter Transkripte deckten ein breites Spektrum von GO-Kategorien ab, und die zehn GO-Begriffe mit den meisten annotierten Transkripten sind in Tabelle 3 aufgeführt. Wir stellen die Verteilung aller exprimierten Transkripte in drei Kategorien der Genontologie bereit (molekulare Funktion, zelluläre Komponente und). biologischer Prozess) in der Zusatzdatei (S3-Datensatz). GO-Begriffe im Zusammenhang mit Bindungsfunktionen und Transferaseaktivität waren überwiegend in der Kategorie der molekularen Funktionen vertreten. In Bezug auf die Bindungsfunktionen war die Kationenbindung (4.394 Transkripte) am häufigsten vertreten, gefolgt von der Nukleotid-/Nukleosidbindung (durchschnittlich 3.404 Transkripte) und der Proteinbindung (2.422 Transkripte). In der Transferase-Aktivitätsgruppe sind es am meisten diejenigen mit übertragenden phosphorhaltigen Gruppen (2.256 Transkripte, 65,77 %). In der Kategorie der zellulären Komponenten befanden sich die Transkripte eher intrazellulär (durchschnittlich 10.581 Transkripte), während in der Kategorie der biologischen Prozesse die Transkripte stärker am Stoffwechselprozess des Biopolymers beteiligt waren (durchschnittlich 6.683 Transkripte), gefolgt von der Regulierung des zellulären Prozesses (4.841 Transkripte). ), Genexpression (4.678 Transkripte) und Transport (3.512 Transkripte).

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR VORBEUGUNG DER ALZHEIMER-KRANKHEIT PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Um Gene zu ermitteln, die an der Biosynthese von Lignin und PhG beteiligt sind, wurden 21.358 nicht-redundante potenzielle Proteinsequenzen anhand von Gensequenzen von 13 Pflanzenorganismen in der KEGG-Datenbank durchsucht und sie mit mindestens 5 Treffern 275 KEGG-Pfaden zugeordnet. Die zehn wichtigsten Pfade mit den meisten ausgerichteten Sequenzen sind in Tabelle 4 aufgeführt. Die meisten Pfade waren an primären Stoffwechselprozessen beteiligt, wie dem Aminosäure- oder Proteinstoffwechsel (ko01230, ko04141 und ko04120), dem Kohlenhydratstoffwechsel (ko01200 und ko00500) und dem Nukleotid- oder Proteinstoffwechsel Nukleosidstoffwechsel (ko03018, ko00230 und ko00240). Darüber hinaus gibt es 27 sekundäre Stoffwechselwege (Abb. 2), wie z. B. die Biosynthese des Terpenoid-Rückgrats, die Biosynthese von Phenylpropanoiden, die Biosynthese von Carotinoiden, die Biosynthese von Isochinolin-Alkaloiden sowie die Biosynthese von Tropan-, Piperidin- und Pyridin-Alkaloiden. Diese Ergebnisse liefern einen weiteren Hinweis darauf, dass aktive Stoffwechselprozesse im Gange warenC. deserticolaStammgewebe. Alle exprimierten Transkripte im Zusammenhang mit KEGG-Pfaden wurden in der Zusatzdatei (S4-Datensatz) aufgeführt. Obwohl es einige deutlich veränderte Signalwege zwischen C. deserticola und anderen Pflanzen wie Reis gibt (S5-Datensatz), besteht unser Hauptziel in dieser Studie darin, das gesamte Transkriptomprofil des C. deserticola-Stamms aufzudecken und die damit verbundenen Pfade der PhGs-Biosynthese abzubilden die für die Anleitung des Anbaus nützlich sein könnten.

Kandidatengene, die für Enzyme kodieren, die an der Biosynthese von Lignin beteiligt sind

Lignin ist das zweithäufigste natürliche terrestrische Polymer im Pflanzenreich und macht bis zu einem Drittel des Materials aus, das in pflanzlichen Zellwänden vorkommt. Als wichtiger Bestandteil der Zellwände unterstützen Lignine den Wassertransport, sorgen für mechanische Unterstützung und strukturelle Integrität und schützen vor Krankheitserregern und Pflanzenfressern. Diese Rolle von Lignin ist sehr wertvoll für die Unterstützung des unterirdischen erektiven Wachstums von C. deserticola in der Wüste. In dieser Studie haben wir das vollständige Bild der Lignin-Biosynthesewege in C. deserticola präsentiert (Abb. 3), bei dem die Ligninmonomere aus Phenylalanin durch eine Reihe enzymatischer Reaktionen, einschließlich Hydroxylierung, Methylierung, Reduktion und oxidativer Polymerisationsprozess, biosynthetisiert werden. Mit der Ligninbiosynthese in Zusammenhang stehende Enzyme wurden für drei hauptsächlich synthetisierte Formen im Gefäßgewebe (p-Hydroxyl-Phenyl (H), Guaiacyl (G) und Syringyl (S)-Lignin) und 5-Hydroxyl-Guaiacyl-Lignin, das nur identifiziert wurde, nachgewiesen in COMT (Kaffeesäure 3-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.68) defizienten (z. B. Knock-down) Pflanzen.

Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL, EC 4.3.1.24) ist das erste Schlüsselenzym im Lignin-Biosyntheseweg (Abb. 3), das Phenylalanin durch nichtoxidative Desaminierung in Zimtsäure umwandelt. Insgesamt wurden 6.297 PAL-Reads sequenziert und 7 PAL-Transkripte in C. deserticola zusammengestellt (Tabelle 5). Durch den Vergleich der Sequenzähnlichkeiten haben wir herausgefunden, dass 4 von ihnen (comp28550_c1_seq1/2/3/5) mehr als 95 % Ähnlichkeit mit der bekannten mRNA-Sequenz von C. deserticola (gi|) hatten 289595227|gb|ADD12041.1|), während comp28550_c1_seq4 und comp25940_c0_seq1 77 % bzw. 82 % Ähnlichkeiten aufwiesen. Die ORF-Vorhersage ergab, dass 5 Transkripte das Potenzial hatten, Proteine ​​zu kodieren und die aromatische Aminosäure-Lyase-Domäne (PF00221.14) trugen. Unter diesen konnte nur das comp28550_c1_seq4-Transkript eine vollständige Proteinsequenz von 718 Aminosäureresten kodieren. Es wurde berichtet, dass PAL in den meisten Pflanzenarten von einer kleinen Multigenfamilie kodiert wurde, beispielsweise 4 in Arabidopsis thaliana, 5 in Populus trichocarpa, 3 in Scutellaria baicalensis und 7 in Cucumis sativus usw. Unsere phylogenetische Analyse ergab, dass es 4 gab PAL-kodierende Gene in C.

deserticola und wir nannten sie CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 bzw. CdPAL4 (S2 Abb.). 4-Cumarat-CoA-Ligase (4CL, EC 6.2.1.12) und Trans-Cinnamat-4-Monooxygenase (CYP73A, EC 1.14.13.11) sind zwei Enzyme, die für die Umwandlung von Zimtsäure in Dicumarol-CoA in zwei umgekehrten Richtungen verantwortlich sind Bestellungen. Sie befinden sich auch in Rückgraten und ihre Expressions-FPKM-Werte betragen 39,57 bzw. 51,93.

Die vier Arten von Ligninen wurden auf unterschiedlichen Wegen biosynthetisiert, die von drei Schlüsselenzymen kontrolliert wurden: Cinnamoyl-CoA-Reduktase (CCR, EC 1.2.1.44), Shikimat-o-Hydroxycinnamoyltransferase (HCT, EC 2.3.1.133) und Ferulat{{1{ {56}}}}Hydroxylase (F5H, EC 1,14.-.-). CCR wurde als Kontrollpunkt des Ligninwegs beschrieben [50, 51], der X-CoA (X einschließlich Dicumarol, Caffeoyl, Feruloyl, 5-Hydroxyl-Feruloyl und Sinapoyl) in Y-Aldehyd (Y einschließlich p) katalysierte -Cougar, Caffeoyl, Coniferyl, 5-Hydroxyl-Coniferyl und Snap), während HCT p-Cumaroyl-CoA zu p-Cumaroyl-Shikimisäure/p-Cumaroyl-Chinasäure katalysierte. Die beiden Enzyme regulierten wie ein Schalter die Biosynthese von P-Hydroxyl-Phenyl-Ligninen bzw. den anderen drei Arten von Ligninen. F5H war ein weiterer Zweigschalter, der Syringyllignin und 5-Hydroxylguaiacyllignin regulierte. Weitere wichtige Enzyme sind Kaffeesäure-3-O-Methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.68), Caffeoyl-CoA-O-Methyltransferase (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) und Zimtalkohol-Dehydrogenase (CAD, EC 1.1.1.195). ) wurden ebenfalls exprimiert nachgewiesen. Detaillierte Expressionsinformationen sind in Tabelle 6 aufgeführt. Diese in dieser Studie identifizierten Enzymgene werden eine wertvolle Ressource für funktionelle Genomstudien in dieser wichtigen Heilpflanze darstellen. 10 Gene, die mit dem Lignin-Biosyntheseweg in Tabelle 6 in Zusammenhang stehen, wurden für die RT-qPCR-Verifizierung ausgewählt, um unsere RNAseq-Ergebnisse zu bestätigen (Abb. 4), und ihre hohen Korrelationen (Pearson-Korrelationskoeffizient: 0,90343) zeigten eine hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit unserer Transkriptomanalyse. Der S1-Datensatz listet die in dieser Analyse verwendeten Primersequenzen auf.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR VERBESSERUNG DER SEXUELLEN FUNKTION PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Kandidatengene, die Enzyme kodieren, die an der Biosynthese von PhGs beteiligt sind

Phenylethanoidglykoside (PhGs) sind bekanntermaßen die wichtigsten Wirkstoffe in C. deserticola mit Aktivitäten zur Verbesserung der sexuellen Potenz, zum Abfangen freier Radikale und zur Anti-Aging-Wirkung. Drei chemische Komponenten von PhGs sind organische Säure, Saccharid und Phenylethanol-Aglycon (Abb. 3). Die organischen Säuren, darunter Kaffeesäure, Ferulasäure und Coumalinsäure, sind Produkte des Phenylpropanoid-Biosynthesewegs. Die Bestandteile von Sacchariden, einschließlich Glucose und Rhamnose, sind Produkte von Kohlenhydratstoffwechselwegen, wie dem Stärke- und Saccharosestoffwechsel, dem Aminozucker- und Nukleotidzuckerstoffwechsel, dem Fructose- und Mannosestoffwechsel usw. Der Biosyntheseweg des Phenylethanolanteils ist jedoch noch nicht klar. Hier haben wir basierend auf unseren Sequenzdaten zwei mögliche Biosynthesewege für Phenylethanol vorgeschlagen. Einer davon ist der berichtete Kaffeesäure- oder Ferulasäure-Weg, der auch als Zimtsäure-Weg bekannt ist und dem Lignin-Biosynthese-Grundgerüst-Weg ähnelt. Ein anderer basiert auf dem Phenylalanin-Stoffwechselweg (Abb. 3), bei dem die Umwandlung von Phenylalanin in Phenylethanol über einen bekannten „Enrlich-Weg“ erfolgte, der erstmals vor einem Jahrhundert in Hefe gefunden und in Petunienblüten, Tomaten und Rosen validiert wurde. Im Stamm von C. deserticola wurden vier Enzymgene nachgewiesen, die für Aspartat/Tyrosin-Aminotransferase, Histidin-Phosphat-Aminotransferase und primäre Aminoxidase kodieren und für die Umwandlung von Phenylalanin in Phenylethanol verantwortlich sind. Das Produkt von Phenylethanol kann durch Monooxygenase weiter oxidiert oder durch Methyltransferase in seine Derivate (Phenylethanol-Aglycon) methyliert werden, die an der PhG-Biosynthese beteiligt sind. Zusammenfassend wurden zwei mutmaßliche Biosynthesewege für Phenylethanol-Aglycon vorgeschlagenC. deserticolaaber es bedarf noch weiterer Studien.

Diskussionen

In den letzten Jahren hat sich die Pflanzengenomik durch den Einsatz von Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation rasant weiterentwickelt, während sich nur wenige Forschungsarbeiten auf die Genomik von Wüstenheilpflanzen konzentrierten. Es ist dringend notwendig, genomische oder transkriptomische Untersuchungen durchzuführen, um seine Anpassung an Dürre- und Salzumgebungen und den Biosyntheseweg der wichtigsten bioaktiven Komponenten zu verstehen. Die De-novo-Transkriptomentdeckung einiger Heilpflanzen,

wie Panax ginseng, Ginkgo biloba und Glycyrrhiza uralensis wurden aufgrund ihrer langen Leselänge erstmals mit der Roche 454-Plattform genutzt. Aufgrund der effektiven Assemblierungsfähigkeit mit kurzen Lesevorgängen, insbesondere den vorteilhaften Paired-End-Lesevorgängen, wurden die Illumina-basierte Transkriptomsequenzierung und -assemblierung auch in großem Umfang für Modell- und Nichtmodellorganismen eingesetzt. In der vorliegenden Studie haben wir etwa 8G von 101 bp Paired-End-Reads generiert und längere Unigene-Sequenzen mit einer durchschnittlichen Länge von 725 bp produziert. Umfangreiche stammspezifische Transkriptomdaten könnten nützliche Referenzdaten liefern und zur Untersuchung des Sekundärstoffwechsels bioaktiver Komponenten von C. deserticola verwendet werden. 81,62 % der gesamten Rohlesevorgänge haben vor der Zusammenstellung strenge Qualitätsfilter (einschließlich Adapterkürzung und Verwerfen von Lesevorgängen geringer Qualität) durchlaufen, was auf die hohe Qualität unserer Sequenzierungsdaten schließen lässt, und 82,08 % der qualitativ hochwertigen Lesevorgänge waren für die Zusammenstellung nützlich. Andere Lesevorgänge, die nicht für die Assemblierung verwendet werden konnten, können auf Sequenzierungsfehler, Assemblierungsparameter usw. zurückzuführen sein. Diese ungenutzten Lesevorgänge hoher Qualität blieben hilfreich bei der Verbesserung der De-novo-Assemblierung in Kombination mit längeren Lesevorgängen von einer anderen Plattform (z. B. Roche 454) in der Zukunft.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR VERBESSERUNG DER SEXUELLEN FUNKTION PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Eine große Anzahl zusammengestellter Transkripte (30.098) zeigte hohe Sequenzähnlichkeiten zu bekannten Genen in öffentlichen Datenbanken, was darauf hindeutet, dass unsere auf Illumina basierenden Paired-End-Daten einen erheblichen Teil der Transkripte von C. deserticola abdeckten. Transkripte ohne BLAST-Treffer können auf nicht translatierte 3'- oder 5'-Regionen, nicht-kodierende RNA oder neue Gensequenzen von C. deserticola zurückzuführen sein. Die exprimierten Transkripte wurden einem breiten Spektrum von GO-Kategorien und KEGG-Wegen zugeordnet (Tabellen 3 und 4), wobei viele Transkripte sekundären Stoffwechselwegen zugeordnet wurden. Wie wir wissen, kann Phenylpropanoid als induzierbare antimikrobielle Verbindung mit großem Nutzen für einen Untergrundlebensstil fungieren [1] und neben seinem medizinischen Nutzen auch als Signalmolekül bei Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroben fungieren [68, 69]. Terpenoid wird für die Biosynthese bioaktiver Komponenten (wie 6- Desoxycatalpol) verwendet [70]. Wir fanden heraus, dass Gene, die am Biosyntheseweg des Phenylpropanoid- und Terpenoid-Rückgrats beteiligt sind, in C. deserticola sehr häufig vorkommen. Noch wichtiger ist, dass die Entdeckung gut dargestellter Wege der Lignin-Biosynthese (Abb. 3) auf den aktiven Stoffwechselprozess von Lignin im Stamm von C. deserticola hinweist. Alle bekannten Enzymgene, die an der Biosynthese von Lignin beteiligt sind (Abb. 3), wurden exprimiert, und vier Schlüsselenzyme, darunter PAL, CCR, HCT und F5H, wiesen im Vergleich dazu eine geringere Expressionshäufigkeit auf (FPKM 26,47, 3,89, 3,4 bzw. 3,83). andere Enzymgene (Tabelle 6). Ob die Expressionsänderung dieser drei Gene die Ligninproduktion in C. deserticola beeinflussen könnte oder nicht, ist eine weitere Untersuchung wert. PAL ist ein Schlüsselenzym der Ligninbiosynthese und auch an der Biosynthese von Phenylpropanoid, Resveratrol, Flavonoid und Cumarin beteiligt [71–74]. Wir entdeckten vier verschiedene PAL-Gene im Genom von C. deserticola (S2-Abb.), was damit übereinstimmt, dass PAL von einer kleinen Multigenfamilie kodiert wurde [39, 43, 45–49] und weiter bewiesen, dass es möglicherweise eine wichtige Rolle beim metabolischen Kohlenstofffluss spielt .

PhG ist der Hauptwirkstoff in C. deserticola. Gene, die an der Biosynthese von Phenylethanol beteiligt sind, sind wichtig für die Qualität von C. deserticola. Wir haben zwei verschiedene Biosynthesewege von Phenylethanol und 17 Enzymgene abgeleitet, die an der PhG-Biosynthese im C. deserticola-Stamm beteiligt sind. Die möglichen Post-Kaffee-/Ferulasäure-Prozesse (Abb. 3) wurden erstmals auch auf der Grundlage einer Strukturformel von Zwischenprodukten und katalytischen Eigenschaften entsprechender Enzyme abgeleitet, bei denen die Kaffee-/Ferulasäure zunächst zu Phenylpyruvat-Derivaten oxidiert würde; dann wurde die Carboxylgruppe durch Decarboxylasen entzogen; Schließlich wurde die Aldehydgruppe durch Dehydrogenase wieder in eine Alkoholgruppe umgewandelt. Dies ist die erste Anwendung der Paired-End-Sequenzierungstechnologie von Illumina, um das gesamte Transkriptom von C. deserticola zu untersuchen und RNA-seq-Reads ohne Referenzgenom zusammenzustellen. Diese Studie wird in Zukunft nützliche Ressourcen und Gensequenzen für die funktionelle Genomik- und Proteomikforschung an C. deserticola liefern.

Schlussfolgerungen

In dieser Studie haben wir das Transkriptom des C. deserticola-Stamms auf der Grundlage von Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten profiliert, Gene identifiziert, die an Biosynthesewegen von Lignin beteiligt sind, und auch erstmals den potenziellen Biosyntheseweg von PhGs abgeleitet, was das Verständnis sicherlich beschleunigen wird der unklaren physiologischen Prozesse und des großen medizinischen Werts auf molekularer Ebene. Bisher ist dies der erste Versuch, das gesamte Transkriptom des C. deserticola-Stamms de novo zusammenzusetzen und den Biosyntheseweg medizinischer Komponenten mithilfe von Illumina-basierten Sequenzierungsdatensätzen zu ermitteln. Unsere Studie könnte die Entwicklung natürlicher Arzneimittel und die Auswahl von Sorten mit medizinischen Eigenschaften fördern.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR VERBESSERUNG DER SEXUELLEN FUNKTION PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %