Nachweis eines erhöhten Tetrahydrobiopterinspiegels in Serumproben von ME/CFS-Patienten mit orthostatischer Intoleranz: Eine Pilotstudie

Abstrakt:Myalgische Enzephalomyelitis oder chronisches Müdigkeitssyndrom (ME/CFS) ist eine chronische Multisystemerkrankung, die durch schwere Muskelermüdung, Schmerzen, Schwindel und Gehirnnebel gekennzeichnet ist. Viele Patienten mit ME/CFS leiden unter orthostatischer Intoleranz (OI), die durch häufiges Schwindelgefühl, Benommenheit und Ohnmachtsgefühle bei aufrechter Körperhaltung gekennzeichnet ist. Trotz intensiver Forschung ist der molekulare Mechanismus dieser schwächenden Erkrankung immer noch unbekannt. OI äußert sich häufig in kardiovaskulären Veränderungen, wie z. B. verminderter Hirndurchblutung, vermindertem Blutdruck und verminderter Herzfrequenz. Die Bioverfügbarkeit von Tetrahydrobiopterin (BH4), einem essentiellen Cofaktor des endothelialen Stickoxidsynthase (eNOS)-Enzyms, ist eng mit der kardiovaskulären Gesundheit und dem Kreislauf verbunden. Um die Rolle von BH4 bei ME/CFS zu untersuchen, wurden Serumproben von CFS-Patienten (n=32), CFS-Patienten nur mit OI (n=10; CFS + OI) und CFS-Patienten mit sowohl OI als auch Small-Fiber-Polyneuropathie (n=12; CFS + OI + SFN) wurden einem BH4-ELISA unterzogen. Interessanterweise zeigten unsere Ergebnisse, dass die BH4-Expression bei CFS-, CFS + OI- und CFS + OI + SFN-Patienten im Vergleich zu alters-/geschlechtsangepassten Kontrollpersonen signifikant hoch ist. Schließlich deutete ein ROS-Produktionstest in kultivierten Mikrogliazellen, gefolgt von Pearson-Korrelationsstatistiken, darauf hin, dass der erhöhte BH4-Wert in Serumproben von CFS + OI-Patienten mit der Reaktion auf oxidativen Stress zusammenhängen könnte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Regulierung des BH4-Metabolismus ein vielversprechendes Ziel für das Verständnis des molekularen Mechanismus von CFS und CFS mit OI sein könnte.

Cistanche kann als Anti-Müdigkeits- und Ausdauerverstärker wirken, und experimentelle Studien haben gezeigt, dass das Abkochen von Cistanche tubulosa die Leberhepatozyten und Endothelzellen, die bei schwimmenden Mäusen unter Belastung geschädigt wurden, wirksam schützen, die Expression von NOS3 hochregulieren und das Leberglykogen fördern kann Synthese und übt so eine Anti-Ermüdungswirkung aus. Phenylethanoidglykosid-reicher Cistanche tubulosa-Extrakt könnte die Kreatinkinase-, Laktatdehydrogenase- und Laktatspiegel im Serum erheblich senken und den Hämoglobin- (HB) und Glukosespiegel bei ICR-Mäusen erhöhen. Dies könnte eine Anti-Müdigkeitsrolle spielen, indem es die Muskelschädigung verringert und Verzögerung der Milchsäureanreicherung zur Energiespeicherung bei Mäusen. Die zusammengesetzten Cistanche Tubulosa-Tabletten verlängerten die Schwimmzeit unter Belastung erheblich, erhöhten die Glykogenreserve in der Leber und senkten den Harnstoffspiegel im Serum nach dem Training bei Mäusen, was ihre Anti-Ermüdungswirkung zeigte. Das Abkochen von Cistanchis kann die Ausdauer verbessern und die Beseitigung von Müdigkeit bei trainierenden Mäusen beschleunigen. Außerdem kann es den Anstieg der Serumkreatinkinase nach Belastungsübungen verringern und die Ultrastruktur der Skelettmuskulatur von Mäusen nach dem Training normal halten, was darauf hinweist, dass es die Wirkung hat zur Verbesserung der körperlichen Stärke und zur Bekämpfung von Müdigkeit. Cistanchis verlängerte auch die Überlebenszeit von mit Nitrit vergifteten Mäusen erheblich und erhöhte die Toleranz gegenüber Hypoxie und Müdigkeit.

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Schlüsselwörter:ME/CFS; Tetrahydrobiopterin; orthostatische Intoleranz; Small-Fiber-Polyneuropathie; endotheliale NOS; reaktive Sauerstoffspezies

1. Einleitung

Myalgische Enzephalomyelitis/Chronisches Erschöpfungssyndrom (ME/CFS) ist eine chronische Multisystemerkrankung, die durch schwächende Muskelermüdung, Schmerzen, Schwindel und Gehirnnebel gekennzeichnet ist [1,2]. Eine Untergruppe von ME/CFS-Patienten weist eine schwere orthostatische Hypotonie auf [3], die durch einen erheblichen Blutdruckabfall gekennzeichnet ist, der Schwindel und Ohnmacht im aufrechten Stehen verursacht [4]. Dieser Zustand wird oft als orthostatische Intoleranz (OI) bezeichnet. Eine Untergruppe von OI-Patienten erfüllt auch die diagnostischen Kriterien für eine Small-Fiber-Polyneuropathie [5,6], die mithilfe der Kongorot-Färbung für Amyloidose in Hautbiopsieproben diagnostiziert wird [7]. Trotz intensiver Forschung ist der molekulare Mechanismus von OI nicht bekannt.

BH4 ist ein wichtiger Cofaktor des Aminosäurestoffwechsels [8]. Aminosäuren wie Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan werden durch die Wirkung von Hydroxylase-Enzymen in wichtige zelluläre Zwischenprodukte umgewandelt. BH4 dient als essentieller Cofaktor aller dieser Hydroxylase-Enzyme [9–11]. Dementsprechend ist die Bioverfügbarkeit von BH4 entscheidend für die Synthese von Neurotransmittern wie Dopamin und Serotonin [10]. Neben diesen Hydroxylase-Enzymen reguliert BH4 auch die Funktion von Stickoxid-Synthase-Enzymen und kontrolliert die Produktion von Stickoxid (NO) im Endothel [12]. Die endotheliale Produktion von NO verstärkt die gefäßerweiternde Reaktion, senkt den Blutdruck und unterstützt die Muskelentspannung [13,14]. Andererseits entkoppelt sich BH4 bei Vorhandensein von oxidativem Stress von der eNOS-induzierten NO-Produktion [15] und verstärkt direkt die mitochondriale Stressreaktion im Herzgewebe [16] und im Skelettmuskel [17]. Daher ist die Regulierung des BH4-Stoffwechsels von entscheidender Bedeutung für die Herz-Kreislauf-Funktion und die Kreislaufgesundheit. Da OI-Patienten Berichten zufolge kardiovaskuläre Anomalien aufweisen, sind wir daran interessiert, zu untersuchen, ob OI-Patienten einen veränderten BH4-Metabolismus aufweisen. Bisher gab es keine Studie, die die Rolle des BH4-Stoffwechsels bei CFS untersuchte. Darüber hinaus untersucht unsere Studie auch, ob CFS-Patienten mit OI eine veränderte BH4-Biosynthese aufweisen.

In die Studie wurden Serumproben von 66 Probanden mit n=32 CFS und n=34 Kontrollen einbezogen. Ein doppelblinder quantitativer ELISA wurde durchgeführt, um die BH4-Spiegel zwischen gesunden Kontrollpersonen und CFS-Patienten zu vergleichen. Interessanterweise beobachteten wir, dass es bei CFS-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen zu einer starken Hochregulierung von BH4 kam. Beim Vergleich des BH4-Spiegels zwischen CFS-Patienten mit OI (n=10) und alters-/geschlechtsangepassten Kontrollpersonen (n=10) stellten wir auch fest, dass CFS-Patienten mit OI einen signifikant höheren BH4-Spiegel aufwiesen BH4 im Serum. Insgesamt hebt unser aktuelles Manuskript hervor, dass die Erhöhung des Serum-BH4 bei CFS-Patienten eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von OI spielen könnte.

2. Ergebnisse

In die Studie einbezogene Probanden: Um den BH4-Spiegel in Serumproben zu quantifizieren, wurden insgesamt 66 menschliche Probanden in die Studie einbezogen. Tabelle 1 fasst Alter, Geschlecht, ethnische Zugehörigkeit und Vorerkrankungen dieser Probanden zusammen. Vier Probanden aus der Kontrollgruppe hatten krebsbedingte Komplikationen und wurden daher von der endgültigen Analyse ausgeschlossen. Das Mindest-, Durchschnitts- und Höchstalter der Kontrollgruppe beträgt 18, 64,5 bzw. 82 Jahre. Für die CFS-Gruppe sind diese Werte 26, 59 und 76 Jahre. Ein Häufigkeitsverteilungsdiagramm des Alters in beiden Gruppen zeigte eine ähnliche Schiefe und ein anschließender Bland-Altman-Analysetest ergab, dass der Durchschnitt der Unterschiede nahe Null lag, was darauf hindeutet, dass keine Verzerrung hinsichtlich des Alters vorliegt. Die Kontrollgruppe bestand zu 44 % aus Männern und 56 % aus Frauen, während die CFS-Gruppe aus 41 % Männern und 59 % Frauen bestand. Alle Patienten waren Kaukasier und lebten in der geografischen Region Nordnevada und Kalifornien.

Die ME/CFS-Patientenpopulation wurde auf Grundlage der Canadian 2003- und Fakuda-Kriterien für ME/CFS rekrutiert. Sie erfüllten auch die diagnostischen Kriterien für SCID (der neue Name von ME/CFS, der vom Institute of Medicine eingeführt wurde). Die Kontrollen wurden alters- und geschlechtsspezifisch auf CFS-Probanden abgestimmt, die zusammen mit Patienten in die Klinik für Innere Medizin von Dr. Peterson eingeladen wurden.

CFS + OI- und CFS + OI_SFN-Untergruppen wurden anhand diagnostischer Testaufzeichnungen (Überprüfung der Krankenakte abgeschlossen) und klinischer Korrelation ermittelt. Beispielsweise stellten sich Menschen mit OI in der Praxis mit einem modifizierten positiven NASA-Lean-Test vor (der den OI anzeigte) und alle erhielten eine intravenöse Volumenexpansionstherapie (Kochsalzlösung). Bei SFN-Patienten wurden Biopsieproben entnommen. Für die eingeschlossenen CFS + OI + SFN-Probanden wurde der Bericht des Mass General Hospital aufgezeichnet, in dem eine Kongorot-Färbung zur Zählung der Neuritendichte im seitlichen Knöchelmuskelgewebe durchgeführt wurde.

Der BH4-Spiegel ist in den Serumproben von ME/CFS-Patienten hoch: Insgesamt wurden 32 CFS- und 34 Kontrollpersonen in die Studie einbezogen (Tabelle 1), um den BH4-Serumspiegel mittels kompetitivem ELISA zu messen. Die Standardkurve des BH4-ELISA war eine Exponentialkurve mit negativer Steigung, die aus sechs steigenden Konzentrationen von BH4-Standards (5, 10, 25, 50, 10{{52) abgeleitet wurde }} und 150 ng/ml). Die Steigung und der Achsenabschnitt der Standardkurve wurden verwendet, um die absoluten BH4-Werte anhand des OD-Werts zu messen. Eine serielle Verdünnung von Serumproben mit anschließendem BH4-ELISA-Assay ergab, dass eine 1:2-Verdünnung des Serums im Vergleich zu Leer- oder Hintergrundproben die kontrastreichsten Ergebnisse lieferte. Daher wurden alle Serumproben einer 1:2-Verdünnung unterzogen. Interessanterweise wurde eine doppelblinde ELISA-Analyse gefolgt von einem nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Test [* p < 0,05 (=0.033); U=304.5] ergab, dass die BH4-Spiegel bei n=32 CFS-Patienten im Vergleich zu n=28 Kontrollpersonen signifikant höher waren (Abbildung 1A). Vier Probanden (n=4) in der Kontrollgruppe wurden aufgrund ihrer bereits bestehenden Krebserkrankungen ausgeschlossen. Da die Probanden unabhängig von Alter und Geschlecht zufällig einbezogen wurden, wollten wir als Nächstes die Korrelation des BH4-Spiegels mit dem Alter und Geschlecht der Probanden analysieren. Dementsprechend ergab eine nichtparametrische Spearman-Korrelationsanalyse (Abbildung 1B), dass es keine Korrelation zwischen dem BH4-Spiegel und dem Alter der Probanden gab (Spearman r=−0,1657; p=0,1835). Als nächstes verglichen wir den BH4-Spiegel zwischen männlichen und weiblichen Probanden (Abbildung 1C). Um die Signifikanz zwischen männlich und weiblich (Effektor Nr. 1 ist das Geschlecht) sowie zwischen Kontrolle und CFS (Effektor Nr. 2 ist der Gesundheitszustand) zu beurteilen, wurde eine Zwei-Wege-ANOVA-Analyse durchgeführt. Dementsprechend zeigten männliche und weibliche Probanden keinen signifikanten Unterschied in den BH4-Spiegeln (p > 0,05; =0,3496). Es gab jedoch unabhängig vom Geschlechtsunterschied einen signifikanten Unterschied im BH4 zwischen Kontroll- und CFS-Probanden (p < 0,05; =0,0375).

Da die aktuelle Kohorte streng auf das gleiche geografische Gebiet, die gleiche ethnische Zugehörigkeit und die gleiche Arztpraxis beschränkt ist, wäre eine paarweise Vergleichsanalyse von BH4 zwischen Fällen und Kontrollen, die Alter und Geschlecht entsprechen, aussagekräftiger. Insgesamt wurden 15 Paare verglichen (Abbildung 1D). Ein nichtparametrischer Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed-Rang-Test ergab, dass CFS-Patienten einen signifikant höheren BH4 hatten (** p<0.01; =0.0015) than age- and gender-matched controls. Collectively, our results suggest that the BH4 level is significantly higher in CFS patients compared to healthy control subjects, irrespective of age and gender differences.

CFS patients with OI have upregulated levels of BH4 in serum: Next, we wanted to analyze BH4 levels between control (n = 10) and CFS patients with OI (n = 10). An unpaired t-test revealed that CFS + OI patients had significantly higher BH4 [t1,18 = 2.499; * p < 0.05 (=0.0223)] levels compared to control subjects (Figure 2A). Table 2 displays that all controls were carefully matched with CFS + OI subjects in terms of age and gender. Moreover, a Kolmogorov–Smirnov normality distribution analysis followed by a Q-Q (quantile-quantile) plot (Figure 2B) indicated that all data points were normally distributed [p >Alpha ({{0}}.05)]. Da alle CFS- und Kontrollproben nach Alter und Geschlecht abgeglichen wurden, wurde eine paarweise Vergleichsanalyse durchgeführt. Der anschließende gepaarte t-Test (t1,9=3.834; ** p < 0.01=0.004) zeigte, dass CFS + OI-Serumproben im Vergleich zu Kontrollserumproben einen signifikant höheren BH4-Wert aufwiesen (Abbildung 2C). ). Ein kumulativer Säulenstatistiktest (Abbildung 2D) ergab außerdem, dass 7 von 10 CFS + OI-Patienten signifikant höhere BH4-Werte als den Median aufwiesen (=99,63 ng/ml). Andererseits hatten nur 2 von 10 Kontrollpersonen einen höheren BH4-Wert als der Medianwert. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass CFS + OI-Patienten im Vergleich zu Kontrollpersonen einen signifikant höheren BH4 aufwiesen.

Eine Untergruppe von CFS-Patienten (n=12) hat sowohl OI als auch SFN. Ein Vergleich der BH4-Spiegel (Abbildung 3A) zwischen gesunden Kontrollpersonen und CFS + OI + SFN-Patienten ergab, dass CFS + OI + SFN-Patienten einen signifikant höheren BH4-Spiegel aufwiesen [t1,22=2.371; * P<0.05 (=0.0269)]. Table 3 shows that the cohort of 24 serum samples (n = 12 Control + n = 12 CFS + OI + SFN) was carefully selected based on age and gender. Subsequently, a Q-Q plot demonstrated all data points from both groups were normally distributed (Figure 3B). Since all subjects were matched in terms of age and gender, a paired analysis of control and CFS + OI + SFN subjects was performed. Accordingly, a significant difference in BH4  expression (* p < 0.05) was observed between these two groups (Figure 3C). A cumulative statistical analysis (Figure 3D) further indicated that n = 6 CFS + OI + SFN patients and n = 3 controls have higher BH4 levels than the median (=81.83 ng/mL) suggesting that the BH4  level is strongly elevated in serum samples of CFS + OI + SFN subjects.

Beim Vergleich der BH4-Spiegel zwischen CFS-Monopatienten und CFS + OI-Patienten stellten wir fest, dass Serumproben von CFS + OI-Patienten (n=14) höhere BH4-Spiegel aufwiesen (Abbildung 4A) als die von Kontrollpersonen (n {{ 6}}). Die QQ-Plot-Analyse zeigt, dass die Datenverteilung in beiden Gruppen normal ist (Abbildung 4B), was darauf hindeutet, dass der parametrische Test zum Vergleich von Mittelwerten eingesetzt werden kann. Dementsprechend ergab ein ungepaarter t-Test zur Analyse der Signifikanz des Mittelwerts zwischen Gruppen einen starken Unterschied [t1,22=2.592; * p < 0.05 (=0.0166)]. Die Spaltenstatistiken der ausgewählten Kohorte (n=22) zeigten, dass 9 von 14 CFS + OI-Patienten höhere BH4-Spiegel im Serum aufwiesen, verglichen mit einem Median von 119,7 ng/ml (Abbildung 4C). Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass CFS-Patienten mit OI erhöhte BH4-Spiegel im Serum aufweisen. Insgesamt identifiziert unser aktuelles Manuskript BH4 als potenziellen durch Blut übertragenen Biomarker für CFS + OI- und CFS + OI + SFN-Patienten.

Erhöhte BH4-Spiegel könnten mit erhöhtem oxidativem Stress verbunden sein: Um die funktionelle Bedeutung von erhöhtem BH4 im Serum zu verstehen, untersuchten wir die ROS-induzierende Fähigkeit von Serumproben von CFS-Patienten mit OI (n=10). DCFDA-infundierte Mikrogliazellen wurden 90 Minuten lang mit 1:2 verdünnten Serumproben von 10 CFS + OI und 10 alters-/geschlechtsangepassten Kontrollen behandelt, gefolgt von der Messung der ROS-Produktion mit einem Fluoreszenzplattenlesegerät (Beispiel: Em { {12}} nm/535 nm), wie im Abschnitt Materialien und Methode beschrieben. Wie wir zuvor berichtet haben [18], zeigte eine Histogrammanalyse, dass die ROS-Produktionskapazitäten der CFS + OI-Serumproben signifikant höher waren als die der Kontrollserumproben (Abbildung 5A) [t1,18=2.541; p < 0,05 (=0,0205)]. Da alle Datenpunkte in beiden Gruppen normalverteilt waren (Abbildung 5B), führten wir einen parametrischen Test durch, um die Signifikanz des Mittelwerts zwischen den Gruppen zu untersuchen. Interessanterweise ergab eine Pearson-Korrelationsstatistikanalyse in dieser Kohorte, dass eine mäßig positive Korrelation zwischen den BH4-Spiegeln und der ROS-Produktion bestand, was darauf hindeutet, dass erhöhte BH4-Spiegel in CFS + OI-Serumproben mit einer erhöhten oxidativen Reaktion verbunden sein könnten (Abbildung 5C).

Insgesamt hebt unser aktuelles Manuskript hervor, dass CFS-Patienten mit erhöhten BH4-Spiegeln im Serum verbunden sind und dass eine Hochregulierung bei CFS-Patienten mit OI signifikanter beobachtet wurde. Darüber hinaus könnte der erhöhte BH4-Wert mit der Reaktion auf oxidativen Stress verbunden sein, was eine mögliche Rolle des BH4-Metabolismus bei der Pathogenese von CFS und CFS mit OI verdeutlicht (Abbildung 5D).

3. Diskussion

Die Biosynthese von Tetrahydrobiopterin (BH4) ist ein streng regulierter Stoffwechselprozess im Gesundheitsbereich und seine abnormale Expression ist mit einer Reihe von Krankheiten verbunden. Sein Mangel führt zu einem metabolischen Defizit des Aminosäurestoffwechsels [19,20], einer Beeinträchtigung der Dopaminregulation [21] und einer Beeinträchtigung des Blutflusses [22,23] und ist mit Bluthochdruck, Diabetes, Arteriosklerose, Alterung usw. verbunden andere Stoffwechselstörungen. Andererseits beeinträchtigt eine hochregulierte BH4-Biosynthese die mitochondriale Energieproduktion [24], induziert oxidativen Stress [25] und verstärkt die Beeinträchtigung der Autophagie [26]. Ein erhöhter BH4-Wert ist auch mit einer Senkung des Blutdrucks verbunden [27], indem er über die Aktivierung endothelialer NOS eine gefäßerweiternde Reaktion auslöst [28]. Daher könnte eine hochregulierte Biosynthese von BH4 direkt die Senkung des Blutdrucks oder der Hypotonie fördern. Eine Studie legt nahe, dass der Mangel an BH4 die LPS-induzierte Hypotonie bei Mäusen abschwächt [23]. Bisher wurde die Rolle des BH4-Metabolismus bei CFS-Patienten, insbesondere bei CFS-Patienten mit OI, nicht erforscht. Daher bestand unser Ziel darin, die Serum-BH4-Expression in dieser Patientenpopulation zu beurteilen. Überraschenderweise ergab unsere ELISA-Analyse, dass Serumproben von CFS-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen gleichen Alters und Geschlechts signifikant höhere BH4-Werte aufwiesen. Dementsprechend zeigten Spearman-Korrelationsstatistiken, dass es keine signifikante Korrelation der BH4-Hochregulierung hinsichtlich Alter und Geschlecht gab, was die Möglichkeit einer alters- oder geschlechtsbedingten Beeinträchtigung der BH4-Biosynthese bei diesen Patienten zunichte machte.

Als nächstes beobachteten wir, dass die Serumproben von CFS + OI-Patienten im Vergleich zu den Serumproben alters- und geschlechtsangepasster Kontrollen ebenfalls einen starken Anstieg von BH4 aufwiesen. Unsere kumulativen Säulenstatistiken ergaben, dass 7 von 10 CFS + OI-Patienten bemerkenswert hohe BH4-Spiegel aufwiesen, was darauf hindeutet, dass der Serumanstieg von BH4 mit der Pathogenese von OI zusammenhängen könnte. Das Ergebnis wurde weiter bestätigt, als eine Untergruppe von CFS + OI-Patienten mit Small-Fiber-Polyneuropathie (SFN) im Vergleich zu den alters- und geschlechtsangepassten Kontrollen auch eine hohe BH4-Expression in ihren Serumproben aufwies. Interessanterweise zeigte ein Vergleich der Serum-BH4-Spiegel zwischen reinen CFS-Patienten und CFS-Patienten mit OI, dass es bei OI-Patienten signifikant erhöhte BH4-Spiegel gab.

Wie trägt ein erhöhter BH4-Wert zur Pathogenese von ME/CFS bei? Es gibt mehrere Wege, über die ein erhöhter BH4-Wert direkt zur Pathogenese von ME/CFS beitragen könnte (Abbildung 5D). Erstens wird berichtet, dass die Hochregulierung von BH4 über die Hemmung der Komplexe I und IV der Elektronentransportkette zu einer mitochondrialen Beeinträchtigung des Energiestoffwechsels führt, was zu einer Verringerung des mitochondrialen Membranpotentials, der Freisetzung von Cytochrom C und Apoptose führt [24]. Es wird auch berichtet, dass die Exposition gegenüber BH4 oxidativen Stress verursacht [29]. Obwohl BH4 physiologisch gesehen die endotheliale NO-Produktion durch eNOS-Aktivierung unterstützt, entkoppelt die Oxidation von BH4 durch Superoxid es von eNOS, was oxidativen Stress auf das Herzgewebe ausübt und die kardiovaskuläre Gesundheit beeinträchtigt (Abbildung 5C). Zur Untermauerung zeigten unsere Ergebnisse, dass die erhöhten BH4-Spiegel in CFS + OI-Serumproben eine positive Korrelation mit den ROS-induzierenden Fähigkeiten hatten. Darüber hinaus aktiviert BH4 auch Säugetierziele der Rapamycin-Komplex1-Kinase (mTORC1), um die Autophagie zu beeinträchtigen. Zuvor haben wir berichtet, dass die Aktivierung von mTORC1 und die daraus resultierende Beeinträchtigung der Autophagie möglicherweise mit der Pathogenese von ME/CFS verbunden sind. Es wurde berichtet, dass sowohl mTORC1-abhängige Autophagiestörungen [18] als auch mitochondriale Defizite im Energiestoffwechsel [30] zur Pathogenese von ME/CFS beitragen. Daher könnte ein Anstieg des BH4-Spiegels in Serumproben von ME/CFS-Patienten oxidativen Stress auslösen und die eNOS-Entkopplung verstärken, gefolgt von kardiovaskulärem Stress, Hypotonie, mitochondrialer Toxizität und Autophagie-Beeinträchtigung bei CFS-Patienten.

4. Materialien und Methoden

Probengewinnung: Probengewinnung, Deidentifizierung und Lagerungsplan wurden bereits besprochen [18]. Kurz gesagt: Blutproben und Fragebogendaten wurden unter der Aufsicht von Dr. Daniel Peterson (Sierra Internal Medicine, Incline Village, NV, USA) (Western IRB) #20201812 gesammelt. Blutproben wurden zentrifugiert und Serumproben wurden aliquotiert und dann sofort bei –80 °C eingefroren. Jede Probe erhielt eine eindeutige Identifikationsnummer und wurde gemäß dem vom IRB genehmigten Protokoll sowohl in einem Notizbuch als auch in Microsoft Excel mit Datum und Unterschrift aufgezeichnet. Die Proben wurden dann über Nacht auf Trockeneis an unsere Forschungseinrichtung in Wisconsin geliefert. Nach Erhalt wurden die Proben sofort verarbeitet und untersucht. Fragebogen und nicht identifizierte klinische Daten werden in einer sicheren Redcap-Serverdatenbank mit eingeschränktem Zugriff gespeichert, die vom Forschungspersonal und Clinical Fellow bei Sierra Internal Medicine verwaltet wird. Patientenakten wurden gemäß den von Sierra Internal Medicine festgelegten Datenschutzrichtlinien geführt. Untergruppen von ME/CFS-Patienten in der OI- und der OI + SFN-Gruppe wurden mittels blinder Diagrammprüfung ermittelt und die Analyse nach dem Labor durch den klinischen PI bestätigt. Die vier Krebspatienten wurden blind in diese Analyse einbezogen und dienten als krankheitspositive Kontrolle.

Zu den diagnostischen Kriterien für OI gehörten relevante Befunde (Ergebnisse des Cardiac Tilt Table) aus der Überprüfung der klinischen Diagramme. Darüber hinaus führte der klinische Mitarbeiter zum Zeitpunkt der Blutentnahme eine Lean-Analyse der NASA durch. Die SFN-Diagnose wurde durch eine klinische Aktendurchsicht und histologische Untersuchung einer Hautstanzbiopsie aus der prätibialen Region gestellt. Hautbiopsien wurden unabhängig am Massachusetts General Hospital zur morphometrischen Quantifizierung epidermaler Nervenenden untersucht, um die Neuritendichte der Hautoberfläche zu untersuchen.

BH4-Kompetitiver ELISA: Der BH4-Spiegel wurde in Serumproben von ME-CFS-Patienten und altersentsprechenden gesunden Kontrollpersonen gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen und quantifiziert (Human BH4 Competitive ELISA Kit; Anbieter: MyBioSource, Inc, San Diego, CA 92195, USA; Kat #MBS733839). Das Kit wurde in unserem Labor validiert (multimodaler Plattenleser Perkin Elmer Victor Konzentration auf die Positivkontrolle. Kurz gesagt, Serumproben wurden mit Assay-Verdünnungsmittel (oder 1× PBS) verdünnt und dann auf eine Mikroplatte pipettiert, die mit polyklonalem Anti-BH4-Antikörper vorbeschichtet war. Nach 30-minütiger Inkubation mit der Probe wurde BH4-HRP-Konjugat zur Platte gegeben und eine weitere Stunde bei 37 °C inkubiert. Die restlichen Serumproben wurden dekantiert und auf der Platte mit 1x Waschpuffer (alternativ mit 1x PBS-T) dreimal für jeweils fünf Minuten mit einer Mehrkanalpipette gewaschen. Nach dem Waschen wurde jede Vertiefung 10 Minuten lang im Dunkeln mit TMB-Substrat umgesetzt. Die Farbentwicklung erfolgt nach 10 min Substratinkubation unter Schüttelbedingungen. Das BH4-HRP-Konjugat würde mit Serum-BH4 um die Bindung an den beschichteten Primärantikörper konkurrieren. Je mehr Serum-BH4 in einer Probe enthalten ist, desto geringer ist die Bindung von BH4-HRP und desto weniger Farbe wird erzeugt. Insgesamt wurden 66 Serumproben (34 + 32 ME-CFS-Kontrollpatienten) gemäß den entsprechenden institutionellen Richtlinien entnommen (Einzelheiten im Abschnitt „Probengewinnung“) und unter GLP-Bedingungen analysiert. Die Probenverteilung erfolgte zufällig und der Test war doppelblind, wie im Abschnitt „Begründung der Probengröße“ beschrieben.

Begründung der Stichprobengröße und statistische Analyse: Die Stichprobengröße wurde anhand der folgenden Gleichung begründet. Stichprobengröße {{0}} n=z2p(1−p)/ε2=1.282∗0.95∗(1−0. 95)/0.052=32. Z ist der Z-Score, der 1,28 für die Potenz 0,8 beträgt. p ist der Bevölkerungsanteil; für ein 95 %-Konfidenzintervall beträgt p {{20}},95. ε ist die Fehlerspanne, die 0,05 beträgt. Um eine Signifikanz der Mittelwertdifferenz zwischen den Gruppen bei p < 0,05 zu erreichen, wurden daher insgesamt n=32 Stichproben pro Gruppe einbezogen. Für den Vergleich zwischen Kontroll- und CFS + OI-Patienten wurden n=10 Proben pro Gruppe einbezogen. Beim Vergleich der Kontroll- und Kontrollgruppen +OI + SFN wurde eine ähnliche Stichprobengröße einbezogen. Die Berechnung der Stichprobengröße wurde basierend auf ε=0.05 und p=0.99 durchgeführt. Ein nichtparametrischer Mann-Whitney-U-Test wurde angewendet, um die Signifikanz des Mittelwerts zwischen den beiden Gruppen zu testen, wenn die beiden Gruppen identische und normale Datenverteilungen aufwiesen; andernfalls wurde ein parametrischer ungepaarter t-Test durchgeführt. Für die gepaarte Analyse zwischen Gruppen wurde ein parametrischer gepaarter t-Test durchgeführt, wenn die Datenpunkte beider Gruppen normalverteilt waren; andernfalls wurde ein Wilcoxon-Rangtest durchgeführt, um die Signifikanz zwischen den Gruppen zu bewerten. Eine Zwei-Wege-ANOVA mit Post-hoc-Bonferroni oder Tukey wurde angewendet, um die Signifikanz des Mittelwerts in mehr als zwei Gruppen zu testen, wobei Geschlecht (männlich oder weiblich) und Gesundheit (gesund oder CFS) als Effektoren berücksichtigt wurden. Alle statistischen Analysen wurden in der Software GraphPad Prism Version 9.5.1 (733) (Boston, MA 02110, USA) durchgeführt.

ROS-Assay:Menschliche embryonale Mikrogliazellen vom Typ HMC3 wurden gezüchtet und mit vollständigem DMEM-Medium passagiert. Kurz gesagt, HMC3-Zellen wurden für die ROS-fluorometrische Studie in einer 96-Well-Platte ausplattiert. Die Zellen wurden bis zu einer Konfluenz von 75–80 % gezüchtet und mit einer DCFDA-Sonde (Kat.-Nr. ab113851; Abcam, Cambridge, UK) 45 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Die Standardmedien wurden 90 Minuten lang durch 100 µL (1:2 Verdünnung=50 µL Serum + 50 µL Medien) mit Serum ergänztes Medium ersetzt, um den optimalen Fluoreszenzwert zu erreichen. Am Ende der Inkubationszeit wurde das Medium abgesaugt und dann bei der Anregungs-Emission unter Verwendung der 485-nm- und 535-nm-Filtersätze im Plattenlesegerät PerkinElmer Victor X3 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) gemessen.

Autorenbeiträge:AR konzipierte die Idee, entwarf, führte Recherchen durch und schrieb das Manuskript. CGG führte Recherchen durch und verfasste das Manuskript. RW half bei der Entnahme von Blutproben und der Führung von Patientenakten. DP ist ein klinischer PI, der für die Sammlung von Bioproben, Fragebögen und die IRB-Genehmigung verantwortlich war. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Finanzierung:Diese Arbeit wurde von Simmaron Research Inc., einer gemeinnützigen 501C-Forschungsorganisation, Incline Village, NV 89451, aus Mitteln des Ramsay Award 2023 an AR by Solve ME Initiative und Foundation Hesse Sibylla, Quebec, QC, Kanada, unterstützt.

Erklärung des Institutional Review Board:Kein Teil dieses Forschungsartikels, einschließlich Bilder und Texte, wurde zuvor in einem Buch, Artikel oder einer anderen veröffentlichten Literatur veröffentlicht oder reproduziert. Die Bilder sind Originale und wurden nicht aus anderen Quellen kopiert. Hierbei handelt es sich nicht um eine klinische Studie, sondern um eine institutionelle Beobachtungsstudie. Die Sammlung von Bioproben, Fragebogenrichtlinien, Aufzeichnungen und die Generierung eindeutiger Identifikationsnummern wurden vom Western IRB, Protokoll Nr. 20201812 (aktuelles Erneuerungsdatum Nr. 21.07.23), durchgeführt.

Einverständniserklärung:Alle Autoren haben ihr Einverständnis zur Veröffentlichung dieses Übersichtsartikels gegeben.

Erklärung zur Datenverfügbarkeit:Mit diesem Dokument ist kein elektronisches Datenblatt verbunden. Keine Daten in einem elektronischen Repository.

Interessenskonflikte:AR, CGG, RW und DP sind Mitarbeiter von Simmaron Research INC, einer gemeinnützigen 501C-Forschungsorganisation. Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Abkürzungen

ME/CFS=Myalgische Enzephalomyelitis oder chronisches Müdigkeitssyndrom; OI=Orthostatische Intoleranz; SFN=Small-Fiber-Polyneuropathie; BH4=Tetrahydrobiopterin; eNOS=endotheliale Stickoxidsynthase; NEIN=Stickoxid. ROS=Reaktive Sauerstoffspezies. ME/CFS=Myalgische Enzephalomyelitis oder chronisches Müdigkeitssyndrom; OI=Orthostatische Intoleranz; SFN=Small-Fiber-Polyneuropathie; BH4=Tetrahydrobiopterin; eNOS=endotheliale Stickoxidsynthase; NO=Stickoxid; und ROS=Reaktive Sauerstoffspezies.

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