Die Exposition gegenüber Dieselabgasen verändert die Expression von Netzwerken, die an der Neurodegeneration im Gehirn von Zebrafischen beteiligt sind, Teil 1

Abstrakt

Neurodegenerative Erkrankungen sind weltweit eine der Hauptursachen für Behinderungen, ihre Ursachen sind jedoch weitgehend unklar. Genetische Faktoren können für die meisten dieser Erkrankungen nur einen kleinen Teil des Risikos ausmachen, was darauf hindeutet, dass Umweltfaktoren eine bedeutende Rolle bei der Entstehung dieser Krankheiten spielen.

Neurodegenerative Erkrankungen beziehen sich auf eine Art von Krankheit, die aus verschiedenen Gründen zur Degeneration von Gehirnzellen führt. Zu den häufigsten Erkrankungen gehören die Alzheimer-Krankheit, die Parkinson-Krankheit, die Huntington-Krankheit usw. Diese Krankheiten beeinträchtigen Neuronen im Gehirn und führen zu einer Beeinträchtigung der Gehirnfunktion und zu Symptomen wie Gedächtnis-, Denk- und Verhaltensänderungen.

Allerdings müssen wir aufgrund dieser Krankheiten nicht unsere positive Einstellung verlieren. Es gibt viele Möglichkeiten, Patienten dabei zu helfen, ihr Gedächtnis zu verbessern und ihre Symptome zu lindern. Werfen wir einen Blick auf einige dieser Methoden:

Machen Sie zunächst etwas körperliche Bewegung. Untersuchungen zeigen, dass körperliche Aktivität die Durchblutung des Gehirns verbessert und die Freisetzung von Chemikalien wie Dopamin und Endorphinen erhöht, die zum Schutz und zur Verbesserung der Funktion von Neuronen beitragen. Gleichzeitig kann Bewegung auch dazu beitragen, Probleme wie Angstzustände, Depressionen und Schlaflosigkeit zu lindern und den Patienten das Leben angenehmer zu gestalten.

Zweitens: Pflegen Sie soziale Beziehungen. Es ist auch sehr wichtig, dass unsere sozialen Netzwerke eng mit verwandten Bereichen des Gehirns verbunden sind und soziale Interaktion nicht nur Stress reduzieren, sondern auch die Gesundheit des Gehirns verbessern kann, indem sie das Glück steigert, Depressionen bekämpft und vieles mehr.

Schließlich essen Sie gut und schlafen Sie ausreichend. Beide Aspekte können wichtige Auswirkungen auf die Gehirngesundheit haben. Eine gute Ernährung muss nicht nur genügend Nährstoffe enthalten, sondern auch den wiederholten Verzehr von zu viel Zucker, gesättigten Fettsäuren und Cholesterin vermeiden. Darüber hinaus kann ausreichend Schlaf dazu beitragen, Gedächtnisprobleme in verschiedenen Stadien zu bekämpfen, insbesondere bei Krankheiten wie der Alzheimer-Krankheit.

Kurz gesagt bedeuten neurodegenerative Erkrankungen nicht, dass die Erwartungen an das Leben aufgegeben werden. Unter Beibehaltung einer positiven Einstellung ist es auch notwendig, wissenschaftliche und wirksame Methoden anzuwenden, um die Lebensqualität zu verbessern. Mehr Lachen und mehr Sonnenschein helfen Ihnen, gesund zu bleiben. Es ist ersichtlich, dass wir das Gedächtnis verbessern müssen, und Cistanche deserticola kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche deserticola ein traditionelles chinesisches Arzneimittel ist, das viele einzigartige Wirkungen hat, darunter die Verbesserung des Gedächtnisses. Die Wirksamkeit von Cistanche deserticola beruht auf den zahlreichen darin enthaltenen Wirkstoffen, darunter Gerbsäure, Polysaccharide, Flavonoidglykoside usw. Diese Inhaltsstoffe können die Gesundheit des Gehirns auf verschiedene Weise fördern.

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Kürzlich wurde festgestellt, dass eine längere Exposition gegenüber Luftverschmutzung das Risiko für Alzheimer und Parkinson erhöht, die molekularen Mechanismen, durch die sie wirken, sind jedoch nicht vollständig verstanden.

Zebrafischembryonen, die Dieselabgaspartikelextrakt (DEPe) ausgesetzt sind, führen zu dysfunktionaler Autophagie und neuronalem Verlust. Hier setzten wir Zebrafischembryonen DEPe aus und führten Hochdurchsatzanalysen der proteomischen und transkriptomischen Expression in ihrem Gehirn durch, um durch Luftverschmutzung verursachte Krankheitswege zu identifizieren. Die DEPe-Behandlung veränderte mehrere biologische Prozesse und Signalwege, die für neurodegenerative Prozesse relevant sind, darunter den xenobiotischen Stoffwechsel, die Phagosomenreifung und die Amyloidverarbeitung. Die größte Induktion der Genexpression im Gehirn erfolgte bei Cyp1A (mehr als das 30--Fache).

Die Relevanz dieser Expressionsänderung wurde durch die Blockierung der Induktion mittels CRISPR/Cas9 bestätigt, was zu einem dramatischen Anstieg der Empfindlichkeit gegenüber DEPe-Toxizität führte und bestätigte, dass die Cyp1A-Induktion ein kompensatorischer Schutzmechanismus war.

Diese Studien identifizierten gestörte molekulare Pfade, die zur Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen beitragen können. Letztendlich wird die Bestimmung der molekularen Grundlagen dafür, wie Luftverschmutzung das Risiko einer Neurodegeneration erhöht, bei der Entwicklung krankheitsmodifizierender Therapien hilfreich sein.

Schlüsselwörter

Luftverschmutzung · Demenz · Parkinson-Krankheit · Alzheimer-Krankheit · Transkriptomik · Proteomik.

Einführung

Luftverschmutzung trägt wesentlich zur Sterblichkeit bei und wird mit Atemwegserkrankungen, Herzerkrankungen, Schlaganfall, Lungenkrebs und Diabetes in Verbindung gebracht. Neue epidemiologische Erkenntnisse belegen einen Zusammenhang zwischen der Belastung durch Luftverschmutzung und der Entwicklung neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich Alzheimer und Parkinson (AD und PD) (Fu et al. 2019). Es gibt nur wenige Forschungsarbeiten, die die Mechanismen untersuchen, durch die Luftverschmutzung das Risiko für AD und Parkinson erhöhen kann, aber die wenigen existierenden stützen einen Kausalzusammenhang (Fu et al. 2019).

Die Ansammlung von Proteineinschlüssen im Gehirn ist ein universelles Merkmal neurodegenerativer Erkrankungen und wahrscheinlich ein häufiger Weg, der zu neuronaler Dysfunktion und zum Tod führt. Beispielsweise sind die Bildung von Amyloid-Beta- (A-Beta) und Tau-Strukturen die pathologischen Kennzeichen von AD und -Synuclein (-syn)-Aggregaten oder Lewy-Körpern bei PD (Ross und Poirier 2004; Woulfe 2008).

Veränderungen in der Proteostase scheinen der Bildung dieser Aggregate zumindest teilweise zugrunde zu liegen, die genauen Mechanismen sind jedoch noch unbekannt und können je nach genetischen und umweltbedingten Risikofaktoren bei einzelnen Personen variieren. Wir wissen, dass eine erhöhte Expression oder ein verminderter Abbau von A-Beta oder -Syn zu AD und PD führen kann (Bostancıklıoğlu2019; Johnson et al. 2019).

Weitere häufige Merkmale neurodegenerativer Erkrankungen sind Entzündungen und oxidativer Stress. Aktivierte Mikroglia, die Entzündungszellen im ZNS, können bei Autopsien von AD- und PD-Gehirnen leicht erkannt werden und tragen wahrscheinlich zur Pathogenese der Neurodegeneration bei (Kannarkat et al. 2013). Es wird angenommen, dass diese Entzündung und möglicherweise eine mitochondriale Dysfunktion zu oxidativem Stress führen, der auch in autopsierten Gehirnen festgestellt wird (Picca et al. 2020).

Die meisten mechanistischen Studien zu Luftverschmutzung und Neurodegeneration konzentrierten sich bislang auf Entzündungen (Jayaraj et al. 2017). Luftverschmutzung scheint sowohl ZNS-Entzündungen als auch oxidativen Stress im Gehirn von Tieren und Menschen zu verstärken (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2007, 2008a, b und c; Levesque et al. 2011a, b, 2013; Moulton und Yang 2012; Mumaw et al. 2017; Yokota et al.2013a, b).

Von besonderem Interesse sind die Erkenntnisse, dass Luftverschmutzung die Expression einiger Entzündungsgene im Riechkolben (OB) von Mäusen erhöht, einer Gehirnregion, in der die PD-Pathologie sehr früh im Krankheitsverlauf beobachtet wird (Levesque et al. 2011a, b; Yokota et al. 2013a). . Entzündungen wurden auch bei Hunden beobachtet, die in städtischen Gebieten lebten, im Vergleich zu Hunden, die in ländlichen Gebieten lebten, und die Autoren spekulierten, dass diese Veränderungen auf die hohe Luftverschmutzung zurückzuführen seien (Calderón-Garcidueñas et al. 2003).

Dieselben Autoren vermuteten auch, dass sich -syn aufgrund der Luftverschmutzung im Gehirn von Stadtbewohnern ansammelt (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2008a,b). In einer aktuellen Studie an einem Zebrafischmodell wurde berichtet, dass die Exposition gegenüber DEPe Neurotoxizität und eine signifikante Abnahme der Neuronenzahl durch Störung der Autophagie verursacht (Barnhill et al. 2020).

DEPe enthält viele der toxischen Bestandteile der Luftverschmutzung und wird häufig zur Modellierung der Exposition in Zellkultursystemen verwendet (Costa et al. 2014; Hesterberg et al. 2010; Levesque et al. 2011b). Autophagie ist ein wesentlicher intrazellulärer Mechanismus zur Entfernung und Beseitigung fehlgefalteter Proteine ​​und beschädigter Organellen.

Tatsächlich ist eine präzise autophagische Aktivität für die zelluläre Homöostase notwendig, und eine dysfunktionale Autophagie in Neuronen führt zu verändertem Überleben und Neurodegeneration (Kesidou et al. 2013). In vielen dieser Studien gibt es klare Einschränkungen, aber sie alle legen nahe, dass die Belastung durch Luftverschmutzung das Risiko für AD erhöht und PD. Unser Verständnis der Mechanismen, durch die Umweltverschmutzung dieses Risiko erhöht, ist begrenzt, aber ultrafeine Partikel und verschiedene Bestandteile der Luftverschmutzung können entweder direkt über den Riechkolben oder über die Lunge über den Blutkreislauf in das Gehirn gelangen (Kilian und Kitazawa 2018).

Diese Partikel bestehen aus einem Kohlenstoffkern und adsorbierten Verbindungen wie polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen, Metallen, Nitrat, Sulfat und anderen Elementen und machen einen erheblichen Anteil der Luftschadstoffe aus, insbesondere in städtischen Gebieten. Viele dieser Verbindungen werden mit oxidativem Stress und zellulärem Stress in Verbindung gebracht Toxizität, die einen kausalen Zusammenhang zwischen Luftverschmutzung und Neurodegeneration plausibler macht.

Detaillierte multidisziplinäre Untersuchungen, einschließlich Zell- und Tiermodellen, können Einblicke in die Ursachen von Krankheiten geben und zukünftige Therapieansätze leiten (Cannon und Greenamyre 2011). Unter den Modellorganismen, die für In-vivo-Studien verwendet werden, ist Danio rerio (Zebrafisch) ein leistungsfähiges Modell für das Studium der Toxikologie, Molekulargenetik, Toxikogenomik und Arzneimittelforschung.

Die meisten biologischen Wege sind bei Wirbeltieren hoch konserviert und die meisten funktionellen menschlichen Gene weisen Homologe bei Zebrafischen auf (Vaz et al.2018). Darüber hinaus entwickeln sich Zebrafischembryonen schnell und unabhängig, sodass eine Analyse in jedem gewünschten Entwicklungsstadium möglich ist. Diese Merkmale, zusammen mit der schnellen Fortpflanzung und den geringen Haltungskosten, machen Zebrafische zu einem geeigneten Modell für die Untersuchung der toxischen Auswirkungen von Umwelteinflüssen.

Um die molekularen Mechanismen hinter der Pathogenese der Krankheit besser zu verstehen, wurde eine breite Palette von Hochdurchsatz-Ansätzen zur Genexpressionsprofilierung entwickelt. Massenspektrometrie-basierte Proteomik und Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung sind besonders vielversprechend bei der Identifizierung interessanter biologischer Pfade. Diese Techniken werden häufig verwendet, um die Reaktion von Zell- und Tiermodellen auf Umweltreize zu verstehen (Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jamiet al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012).

In dieser Studie haben wir Expressionsanalysen der Auswirkungen der DEPe-Behandlung sowohl auf das Proteom- als auch auf das Transkriptomprofil in den Köpfen von Zebrafischembryonen durchgeführt. Durch die Isolierung von Proben aus dem Kopf, der hauptsächlich aus Gehirngewebe besteht, konnten gewebespezifischere Profile erhalten und von anderen Geweben ausgehende Schäden minimiert werden. Wir beschreiben hier veränderte Genexpression und Proteinprofile in mehreren Signalwegen, die an der Neurodegeneration in den Köpfen von DEPe-exponierten Zebrafischen beteiligt sind. Diese Ergebnisse liefern neue Einblicke in die möglichen Mechanismen, durch die Luftverschmutzung das Risiko für AD und Parkinson erhöht.

Material und Methoden

Fischbehandlung und CRISPR/Cas9-vermittelter Geneknockdown

Alle Studien wurden vom UCLA AnimalRights Committee genehmigt. Zebrafische (AB) wurden 1 Stunde lang durch Lichtstimulation gezüchtet, und eine Gesamtzahl von 200 Eiern wurde 24 Stunden lang bei 28 Grad inkubiert. Die resultierenden Embryonen wurden in Pronase (2 mg/ml) dechorioniert und bis 5 Tage nach der Befruchtung entweder mit DEPe (Standard Reference Materials, NIST, Gaithersburg, MD) in einer Endkonzentration von 20 μg/ml oder mit Vehikel behandelt (DPF).

Diese Konzentration wurde ausgewählt, da sie, wie zuvor berichtet, zum Verlust von Neuronen führte, jedoch ohne signifikante Mortalität (Barnhillet al. 2020). ) wurde basierend auf der Lage geeigneter PAM-Stellen im ersten Exon des Cyp1A-Gens entworfen.

Das beste Design wurde von IDT DNA (www.idtdna.com) zusammen mit der Standard-CRISPR-Cas9-tracrRNA erworben. Die crRNA für das Cyp1Agene und die tracrRNA wurden getrennt in 10 mM Tris-EDTA resuspendiert, um eine Endkonzentration von 100 μM zu ergeben. Dann wurde tracrRNA mit crRNAin 1×Duplex-Puffer (100 mM Kaliumacetat; 30 mM HEPES, pH 7,5; IDT-DNA) kombiniert, um eine Endkonzentration von 10 μM zu ergeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad auf 95 Grad erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um das Annealing der komplementären Nukleotidsequenzen incrRNA und tracrRNA und die Bildung von Functionalguide-RNA (gRNA) zu ermöglichen.

Ein Volumen von 3 μl getemperter gRNA wurde dann mit dem gleichen Volumen einer Spender-Einzelstrang-DNA (ssDNA; 200 μM) wie die Matrizensequenz für mutiertes Cyp1A kombiniert. Eine Menge von 3 µg Cas9-Nuklease (IDT) in 1 × Injektionspuffer (5 mM KCl; 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,8) wurde der Mischung zugesetzt, um die endgültigen CRISPR/Cas9-Ribonukleoprotein-Komplexe (Cyp1A-RNP) zu bilden.

Zur Herstellung des Scramble-RNP (SC-RNP) wurde die spezifische Cyp1A-crRNA durch eine kommerzielle Scramble-crRNA ohne Ziel im Genom ersetzt. Die Sequenz aller in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide ist in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Den Eiern wurden unter einem Stereomikroskop etwa 3 nL RNP-Injektionsmischung injiziert.

Es wurden fünf biologische Replikatinjektionen durchgeführt (jedes Replikat umfasste 400–600 Eier, denen Cyp1A-RNP injiziert worden war, und 100–200 Eier, denen SC-RNP injiziert worden war), und alle Mikroinjektionen waren innerhalb von 60 Minuten abgeschlossen. Die Eier wurden in 100-mm-Petrischalen aus Kunststoff gelegt und bei 28 Grad in Eierwasser inkubiert. Die Überlebensrate der Embryonen wurde bis zu 7 Tage lang überwacht.

Bilder von überlebenden Fischen wurden auf Fehlbildungen hin überprüft. Jede Larve wurde blind auf das Vorliegen von vier Entwicklungsfehlbildungen hin bewertet, darunter Kopffehlbildungen, Schwanzfehlbildungen, Herzödeme und Dotterödeme. Larven mit allen vier Fehlbildungen wurden mit 4 bewertet, während sich normal entwickelnde Larven mit 0 bewerteten. Zur Bewertung der signifikanten Unterschiede wurde der statistische T-Test verwendet.

For more information:1950477648nn@gmail.com