Nahrungsergänzung mit Arsen induziert oxidativen Stress durch Unterdrückung des Kernfaktors Erythroid 2--verwandter Faktor 2 in der Leber und den Nieren von Legehennen

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ABSTRAKT

Diese Studie untersuchte die Auswirkungen einer Nahrungsergänzung mit Arsen auf die Legeleistung, Eiqualität, hepatische und renale Histopathologie und oxidativen Stress in Leber und LeberNieren von Legehennen. Darüber hinaus wurde der Kernfaktor Erythroid {{0}}-bezogener Faktor 2 (Nrf2)-Kelch-ähnliches ECH-assoziiertes Protein 1 (Keap1) untersucht, um den molekularen Mechanismus des Stresses aufzudecken. Fünfhundertzwölf 40- Wochen alte Hyline White-Legehennen wurden nach dem Zufallsprinzip 4 Gruppen mit 8 Buchten pro Gruppe und 16 Hennen pro Bucht zugeteilt. Die Arsendosen, die den 4 Gruppen verabreicht wurden, waren 0,95, 20,78, 40,67 und 60,25 mg/kg. Die Ergebnisse zeigten, dass die Nahrungsergänzung mit Arsen die Hühnereiproduktion (P, 0,05), das durchschnittliche Eigewicht (P, 0,05), die Haugh-Einheiten (P, 0,05), die Albuminhöhe (P, 0,05) signifikant reduzierte. und Eierschalenfestigkeit (P, 0,05). Nahrungsergänzung mit Arsen induzierte auch die Akkumulation von Arsen und histopathologische Schäden in der Leber undNiere. Dementsprechend erhöhte die Nahrungsergänzung mit Arsen die Serum-Alanin-Aminotransferase (P, {{0}}.05), die Aspartat-Aminotransferase (P, 0.05) signifikant. Blut-Harnstoff-Stickstoff (P, {{10}}.05) und Harnsäure (P, 0.05)-Spiegel. Nach Arsenexposition waren die Aktivitäten von Superoxiddismutase (SOD) (P, 0,05), Katalase (P, 0,01), Glutathionreduktase (P, 0,05), Glutathionperoxidase (P, 0,05) und Glutathiongehalt (P, 0,05). signifikant verringert, während der Malondialdehyd-Spiegel signifikant erhöht war (P, 0,05) in Leber und Niere. Es traten positive Korrelationen zwischen den antioxidativen Enzymaktivitäten und der antioxidativen Enzymgenexpression in Leber und Niere auf, mit Ausnahme der renalen Mangansuperoxiddismutase-Genexpression und der SOD-Aktivität. Darüber hinaus korrelierte die hepatische und renale Nrf2-mRNA-Expression positiv mit der antioxidativen Genexpression und negativ mit der Keap1-mRNA-Expression. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine Nahrungsergänzung mit Arsen oxidativen Stress induzierte, indem sie den Nrf2-Keap1-Signalweg in Leber und Nieren von Legehennen unterdrückte.

Schlüsselwörter:Arsen, Legehennen, Nrf2-Keap1-Weg, oxidativer Stress, Nieren

EINLEITUNG

In den letzten Jahren wurde festgestellt, dass Umweltgefahren in zunehmenden Konzentrationen auftreten. Arsen ist ein stark metalloider Giftstoff, selbst in sehr geringen Konzentrationen in Geflügelfutter. Seine physiologische Rolle bei Geflügel ist gut definiert, da es für die Synthese von Methionin-Metaboliten, einschließlich Cystein, notwendig ist. Die empfohlenen Arsenkonzentrationen in Geflügelfutter liegen zwischen {{0}},012 und 0,050 mg/kg (Balos et al., 2019). Eine frühere Untersuchung hat jedoch gezeigt, dass die Arsenkonzentrationen in Geflügelfutter wahrscheinlich außerhalb der Toleranzwerte von Tieren liegen, wenn das Geflügelfutter Algen, Kupfercarbonat, Kupfersulfatpentahydrat, Dikupferchloridtrihydroxid oder Eisencarbonat enthält (Adamse et al., 2017). . Kaziet al. (2013) berichteten, dass es sehr wahrscheinlich ist, dass Arsen in Geflügelfutter die Gesundheit von Masthühnern beeinträchtigt. Die übermäßigen Arsenmengen in Geflügelfutter und seine toxikologischen Auswirkungen auf Geflügel sind nach wie vor ein ernstes Problem. Wenn überschüssiges Arsen in ein Tier eindringt, kann es eine Vielzahl von gesundheitsschädlichen Wirkungen hervorrufen, wie z. B. Immuntoxizität, Atmungstoxizität, kardiovaskuläre Toxizität, Hepatotoxizität, Hepatotoxizität, Nephrotoxizität, Neurovirulenz, Reproduktionstoxizität und Genotoxizität. Die toxikologischen Wirkungen von Arsen auf viszerale Organe wurden hauptsächlich in Säugetierstudien dokumentiert, was darauf hindeutet, dass Arsen ein Risiko für Leber- und Nierenfunktionen darstellt (Waalkes et al., 2004; Mazumder, 2005; Zheng et al., 2014). Dennoch sind die toxikologischen Wirkungen einer Arsenexposition im Futter auf Leber und Niere von Legehennen noch unklar. Die Toxizität von Arsen bei Tieren steht in engem Zusammenhang mit oxidativem Stress, der das Gleichgewicht zwischen Pro- und Antioxidantien stört (Flora, 2011). Wenn Arsen in eine Zelle eindringt, bindet es an intrazelluläres Glutathion (GSH) oder oxidiert es, was zur Bildung freier Radikale führt. Wie wir wissen, können zytoprotektive Gene durch eine Reihe von intrazellulären Transkriptionsfaktoren reguliert werden, einschließlich des Nuklearfaktors Erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), des Aktivatorproteins 1 und des Nuklearfaktors Kappa-B (Kwak et al., 2001). ). Der Transkriptionsfaktor Nrf2 ist ein lebenswichtiges Molekül, das den Stresspegel in Zellen reguliert. Unter Ruhebedingungen interagiert Nrf2 mit dem Kelch-ähnlichen ECH-assoziierten Protein 1 (Keap1), das sich hauptsächlich im Zytoplasma befindet. Wenn oxidativer Stress ausgelöst wird, wandert Nrf2 nach Trennung vom Keap1-Molekül aus dem Zytoplasma in den Zellkern und aktiviert dann die Expression von zytoprotektiven Genen (Motohashi und Yamamoto, 2004). Danach regulieren zytoprotektive Gene weiter die Aktivitäten nachgeschalteter antioxidativer Enzyme, einschließlich Superoxiddismutase (SOD), Glutathionreduktase (GR), Glutathionperoxidase (GSH-Px) und Katalase (CAT). Eine frühere Studie hat gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor Nrf2 an Arsen-induziertem Stress bei Säugetieren beteiligt ist (Sinha et al., 2013). Die genauen Auswirkungen einer Arsenexposition auf die Auswirkungen von oxidativem Stress bei Legehennen bleiben jedoch schwer fassbar. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Wirkung einer Nahrungsergänzung mit Arsen auf Legeleistung, Eiqualität, biochemische Serumindizes, hepatische und renale histopathologische Veränderungen und oxidativen Stress bei Legehennen. Darüber hinaus wurde der Nrf2-Keap1-Signalweg untersucht, um den molekularen Mechanismus in der Leber zu identifizieren undNierenvon Legehennen. Diese Studie bietet einige Einblicke in die biologische Theorie der Toxizität von überschüssigem Arsen in der Leber und in der NahrungNierevon Legehennen.

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MATERIALEN UND METHODEN

Diese Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Alle an Tieren durchgeführten experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Chinese Association for Laboratory Animal Sciences durchgeführt.

Tiere, Ernährung und experimentelles Design

Fünfhundertzwölf {{0}} Wochen alte Hyline White-Legehennen mit ähnlichen Körperbedingungen wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und in 4 Gruppen eingeteilt. Jede Gruppe enthielt 8 Wiederholungen von 16 Vögeln. Arsen wurde der Maisbohnen-Grundnahrung in 4 verschiedenen Konzentrationen (0, 20, 40 und 60 mg/kg; in Form von Arsanilsäure) zugesetzt (Ergänzungstabelle 1). Die Arsenkonzentrationen in der Beschickung wurden durch Atomabsorptionsspektrometrie zur Hydriderzeugung gemäß der früheren Methodik gemessen (Dos Passos et al., 2012). Die tatsächlichen Arsenkonzentrationen in den 4 Gruppen betrugen 0,95, 20,78, 40,67 und 60,25 mg/kg. Die Vögel wurden in Käfigen (60 → 50 → 50 cm3) gehalten, die mit 1 Futternapf und 2 Nippeltränken ausgestattet waren, und 2 Hennen wurden pro Käfig gehalten. Während der gesamten Versuchsdauer hatten die Hennen freien Zugang zu Futter und Tränke. Das gesamte Experiment dauerte 10 Wochen, einschließlich einer 1-wöchigen Anpassungsphase und einer 9-wöchigen formellen Testphase.

Legeleistung und Eiqualität

Während der gesamten Versuchsdauer wurden täglich Legeleistungsindizes erfasst, darunter Futterverbrauch, Legehennenleistung und Eigewicht (EW). Die Bestimmung der Futteraufnahme und der EW in jeder Gruppe wurde unter Verwendung einer empfindlichen Gewichtsskala (XS2002S, Mettler Toledo, Zürich, Schweiz) durchgeführt. Das Futterverwertungsverhältnis (FCR) wurde nach folgender Formel berechnet: FCR 5 Futteraufnahme in Gramm/Eimasse in Gramm. Insgesamt 40 Eier aus jeder Gruppe wurden nach dem Zufallsprinzip gesammelt, um die Eiqualitätsparameter innerhalb von 24 h nach der Eiablage am Ende des Experiments zu messen. Die Eier wurden unter Verwendung einer empfindlichen Waage (XS2002S, Mettler Toledo) gewogen. Danach wurden die Haugh-Einheit, die Albuminhöhe, die Dotterfarbe und die Stärke der Eierschale mit einem digitalen Eiertester (DET6000, Nabel Co. Ltd., Kyoto, Japan) bestimmt. Die Eierschalendicke mit der inneren Membran wurde am scharfen, mittleren und stumpfen Bereich des Eies unter Verwendung eines Messmikrometers bestimmt(547-350, Mitutoyo, Kawasaki, Japan), und die Mittelwerte wurden für die statistische Analyse verwendet.

Sammlung von Proben

Nach dem Aufzuchtversuch wurden 32 Vögel aus jeder Gruppe zufällig ausgewählt und durch Abschneiden der Halsvenen eingeschläfert. Blutproben wurden in sterilen Zentrifugenröhrchen gesammelt und sofort zur Messung der biochemischen Serumindizes ins Labor transportiert. Danach wurden die Vögel seziert, und die Leber uNierenwurden aus der Bauchhöhle entfernt. Die Leber uNiereProben wurden in 4 Teile geschnitten. Ein Teil wurde zur histopathologischen Untersuchung sofort in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die anderen 3 Teile wurden zur weiteren Bestimmung von oxidativen Stressparametern, Arsenablagerung und Genexpression sofort in flüssigem Stickstoff gelagert.

Arsen-Ablagerungs-Assay

Nach Messung der Eiqualität wurde das Eigelb vom Eiweiß getrennt. Die Akkumulation von Arsen in Eiweiß und Eigelb wurde durch Atomabsorptionsspektrometrie zur Hydriderzeugung gemäß der früheren Methodik gemessen (Dos Passos et al., 2012). Die Akkumulation von Arsen im ganzen Ei wurde durch Summieren des Arsengehalts in Eiweiß und Eigelb berechnet. Auf ähnliche Weise wurde die Atomabsorptionsspektrometrie zur Hydriderzeugung verwendet, um die Akkumulation von Arsen in der Leber und zu bestimmenNiere von Legehennen(Dos Passos et al., 2012).

Bestimmung von biochemischen Serumindizes

Gesamtprotein, Albumin, Globulin, Alanin-Aminotransferase (ALT) und Aspartat-Aminotransferase (AST) sind wichtige Indizes zur Beurteilung der Leberfunktion. Diese Parameter wurden unter Verwendung geeigneter Assay-Kits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Blutharnstoffstickstoff (BUN), Harnsäure (UA) und Kreatinin (CT) sind wichtige Indizes zur Beurteilung der Nierenfunktion und wurden mit Nachweiskits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) bestimmt.

Histopathologische Veränderungen

Leber- und Nierengewebe, fixiert in 4 Prozent Paraformaldehyd, wurden in 70, 80, 90, 95 und 100 Prozent Ethanol dehydriert und schließlich in Paraffin eingebettet. Die Gewebe wurden in 6- mm dicke Schnitte geschnitten und dann mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Danach Beobachtungen von histopathologischen Veränderungen in der Leber undNiereGewebeproben wurden von einem Pathologen unter einem optischen Mikroskop (Olympus, Melville, NY) durchgeführt.

Lipidperoxidations- (LPO) und antioxidative Enzymaktivitätsassays

Die Aktivitäten von SOD, CAT, GR und GSH-Px sowie die Gehalte an Malondialdehyd (MDA) und GSH in Leber und Niere wurden mit geeigneten Analysekits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) bestimmt. Kurz gesagt wurde der MDA-Gehalt durch ein spektrophotometrisches Verfahren gemessen, das auf der Reaktion zwischen Thiobarbitursäure und MDA basiert (Janero, 1990). GR-Aktivität und GSH-Gehalt wurden unter Verwendung von 5,5--Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) bestimmt (Carlberg und Mannervik, 1985; Abegg et al., 2012). Die SOD-Aktivität wurde gemäß der inhibitorischen Reaktion zwischen Nitroblau-Tetrazolium-Reduktion und Xanthinoxidase bestimmt. Die CAT-Aktivität wurde basierend auf der Bildung eines stabilen Wasserstoffperoxid-Ammonium-Molybdat-Komplexes bestimmt (Aebi, 1984). Die GSH-Px-Aktivität wurde durch Auswertung der Reduktion von t-Butylhydroperoxid bestimmt (Wheeler et al., 1990).

Gesamt-RNA-Isolierung und quantitative Echtzeit-PCR

Gesamt-RNA wurde aus den Leber- und Nierengeweben mit dem Trizol RNAiso Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die RNA-Proben wurden unter Verwendung des PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa, Dalian, China) revers in cDNA transkribiert. Die Forward- und Reverse-Primer für Mangan-Superoxid-Dismutase (MnSOD), Kupfer-Zink-Superoxid-Dismutase (CuZnSOD), CAT, GR, GSH-Px, Nrf2, Keap1 und das Housekeeping-Gen (b-Actin) sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Die Genhäufigkeit wurde mit einem StepOnePlus Real-Time PCR-System (ABI 7500, Applied Biosystems, Foster City, CA) gemessen. Die Zyklusbedingungen waren 95 °C für 30 s, gefolgt von 35 Zyklen mit 95 °C für 5 s, 59 °C für 10 s und 72 °C für 30 s. Der fache Unterschied in der mRNA-Expression wurde unter Verwendung der relativen Quantifizierungsmethode unter Verwendung von Echtzeit-PCR-Effizienzen gemessen und auf das Niveau von b-Aktin normalisiert, um die relativen CT-Veränderungen zwischen allen Gruppen zu vergleichen (Livak und Schmittgen, 2001).

Statistische Analysen

Alle Daten sind als mittlere 6 SE ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde durch einfache ANOVA unter Verwendung von SPSS Version 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) durchgeführt. Wenn die Unterschiede zwischen den Gruppen signifikant waren (angezeigt durch P, 0,05), wurden die Mittelwerte mit Tukeys ehrlich signifikantem Unterschied für Post-hoc-Mehrfachvergleiche verglichen. Pearson-Korrelationen wurden durch bivariate Korrelationsanalyse (SPSS Version 20.0, SPSS Inc.) analysiert. Die Signifikanz- und Korrelationskoeffizienten werden jeweils als "p" und "r" dargestellt.

ERGEBNISSE

Legeleistung und Eiqualität Verglichen mit denen in der Gruppe mit {{0}},95 mg/kg Arsen waren die Eiproduktion am Tag der Henne und die EW bei der Gruppe mit 60,25 mg/kg signifikant verringert. kg Arsengruppe (P, 0.05). Nahrungsarsen beeinflusste jedoch nicht die Futteraufnahme oder die FCR (Tabelle 1). Verglichen mit der Arsengruppe mit {{20}},95 mg/kg war die Haugh-Einheit bei 40,67 mg/kg (P, 0,05) und 60,25 mg signifikant verringert /kg (P, 0,05) Arsengruppen. Darüber hinaus waren sowohl die Albuminhöhe als auch die Eierschalenstärke in der Gruppe mit 20,78 mg/kg Arsen im Vergleich zu der Gruppe mit 0,95 mg/kg Arsen signifikant verringert (P, 0,05), erreichten in der Gruppe mit 40,67 mg/kg Arsen ein Plateau und nahmen in der Gruppe mit 60,25 stark ab mg/kg Arsengruppe (P, 0,05). Arsen in der Nahrung hatte keinen Einfluss auf die Eigelbfarbe oder die Eierschalendicke (Tabelle 1)

Ablagerung von Arsen

Die Ablagerung von Arsen im Eiweiß (P, {{0}}.05), Eigelb (P, 0.05) und im ganzen Ei (P, 0.05) stieg signifikant an, wenn die Arsendosis aus der Nahrung von 0,95 auf 60,25 mg/kg stieg (Tabelle 2). In ähnlicher Weise stieg die Arsenablagerung in Leber (P, 0,05) und Niere (P, 0,05) signifikant an, wenn die Arsendosis aus der Nahrung von 0,95 auf 60,25 mg/kg anstieg (Tabelle 2).

Korrelationsanalyse zwischen Eiqualität und Arsenablagerung im Ei

Die Ablagerung von Arsen im Eiweiß korrelierte negativ mit der Haugh-Einheit (r {{0}}.622, P, 0.{{10}}1), Eiweiß Höhe (r 5 20.878, P, 0.01) und Eierschalenstärke (r 5 20.897, P, 0.{{ 30}}1). Unterdessen war die Ablagerung von Arsen im Eigelb auch negativ mit der Haugh-Einheit (r 5 20.654, P, 0,01), der Albuminhöhe (r 5 20,893, P, 0,01) und verbunden Eierschalenfestigkeit (r 5 20.902, P, 0,01). In ähnlicher Weise wurden negative Beziehungen zwischen der Ablagerung von Arsen im ganzen Ei und der Haugh-Einheit (r 5 20.640, P, 0,01), der Albuminhöhe (r 5 20,888, P, 0,01) gefunden. , und Eierschalenfestigkeit (r 5 20,902, P, 0,01) (Tabelle 3)

Biochemische Serumindizes

Verglichen mit denen in der Gruppe mit {{0}},95 mg/kg Arsen waren die ALT-Werte in der Gruppe mit 20,78 mg/kg signifikant erhöht (P , 0.{ {16}}5), 40,67 mg/kg (P , 0,05) und 60,25 mg/kg (P , 0,05) Arsengruppen. Unterdessen waren die AST-Werte in der Gruppe mit 60,25 mg/kg Arsen signifikant erhöht im Vergleich zu denen in der Gruppe mit 0,95 mg/kg Arsen (P, 0,05). Nahrungsarsen beeinflusste die Gesamtprotein- oder Albuminspiegel im Serum nicht (Tabelle 4).

Verglichen mit denen in der Gruppe mit {{0}},95 mg/kg Arsen waren sowohl die BUN- als auch die UA-Spiegel in der Gruppe mit 60,25 mg/kg Arsen signifikant erhöht (P, 0,05), während die Arsenexposition mit der Nahrung dies nicht tat den CT-Spiegel im Serum beeinflussen (Tabelle 4).

Histopathologische Veränderungen

Das Aussehen des Lebergewebes war in der Gruppe mit {{0}},95 mg/kg Arsen normal und unverändert. Als jedoch die Arsendosis aus der Nahrung von 20,78 auf 60,25 mg/kg anstieg, wurden die Proliferation des Gallengangs, die Hepatozytensteatose und die Deformation der Zentralvene schwerwiegender (Abbildungen 1A–1D). Das Aussehen des Nierengewebes war in der Gruppe mit 0,95 mg/kg Arsen normal und unverändert. Es gab jedoch eine schwere glomeruläre Schrumpfung in der Gruppe mit 20,78 mg/kg Arsen im Vergleich zu der Gruppe mit 0,95 mg/kg Arsen. Als die Arsendosis aus der Nahrung von 40,67 auf 60,25 mg/kg anstieg, wurden die Vergrößerung der Nierentubuli, die tubuläre Fibrose und die Hyalinisierung schwerwiegender (Abbildungen 1E–1H).

Biomarker für oxidativen Stress

Verglichen mit denen in der Gruppe mit {{0}},95 mg/kg Arsen waren die hepatischen MDA-Spiegel in der Gruppe mit 60,25 mg/kg Arsen signifikant erhöht (P , {{12} }.05), und die renalen MDA-Spiegel waren bei 20,78 mg/kg (P , 0,05), 40,67 mg/kg (P , 0,05) und 60,25 mg/kg (P , 0,05) Arsen signifikant erhöht Gruppen (Abbildung 2A). GSH-Spiegel in der Leber undNieresignifikant verringert in der Gruppe mit 20,78 mg/kg Arsen im Vergleich zu denen in der Gruppe mit 0,95 mg/kg Arsen (P, 0.05) und erreichte in den Gruppen mit 40,67 und 60,25 mg/kg Arsen ein Plateau (Abbildung 2B). Die hepatische SOD-Aktivität war in den Gruppen mit 40,67 mg/kg (P, 0,05) und 60,25 mg/kg (P, 0,05) Arsen im Vergleich zu der Gruppe mit 0,95 mg/kg Arsen signifikant verringert. Die renale SOD-Aktivität war in der Gruppe mit 20,78 mg/kg Arsen im Vergleich zu der Gruppe mit 0,95 mg/kg Arsen (P, 0,05) signifikant verringert und erreichte in den Gruppen mit 40,67 und 60,25 mg/kg Arsen ein Plateau (Abbildung 2C). CAT-Aktivität in der Leber undNierenahm signifikant ab, als die Arsendosis aus der Nahrung von {{0}},95 auf 60,25 mg/kg anstieg (P, 0.05, Abbildung 2D). Verglichen mit der Gruppe mit 0,95 mg/kg Arsen war die GR-Aktivität in Leber und Niere in der Gruppe mit 60,25 mg/kg Arsen signifikant verringert (P, 0,05, Abbildung 2E ). Darüber hinaus war die hepatische GSH-Px-Aktivität im Vergleich zur 0,95-mg/kg-Arsen-Gruppe in der 60,25-mg/kg-Arsen-Gruppe signifikant verringert (P, 0,05) und die renale GSH-Px-Aktivität in der 20,78-mg/kg-Arsen-Gruppe stark verringert (P, 0,05) und erreichte in den Gruppen mit 40,67 und 60,25 mg/kg Arsen ein Plateau (Abbildung 2F).

Genexpressionen von antioxidativen Enzymen, Nrf2- und Keap1-Molekülen

Die hepatische CuZnSOD-Genexpression war in der Gruppe mit 20,78 mg/kg Arsen im Vergleich zur Gruppe mit 0,95 mg/kg Arsen signifikant verringert (P, 0.{{16} }5) und erreichte in den Gruppen mit 40,67 und 60,25 mg/kg Arsen ein Plateau. Die renale CuZnSOD-Genexpression war bei 40,67 mg/kg (P , 0.05) und 60,25 mg/kg (P , 0.05) Arsen-Gruppen verglichen mit der 0.95 mg/kg Arsen-Gruppe (Abbildung 3A). Verglichen mit der Gruppe mit 0,95 mg/kg Arsen war die hepatische MnSOD-Genexpression in der Gruppe mit 20,78 mg/kg Arsen signifikant verringert (P, 0.{{73 }}5) und erreichte in den Gruppen mit 4{{80}},67 und 60,25 mg/kg Arsen ein Plateau. Die renale MnSOD-Genexpression unterschied sich zwischen den Gruppen nicht signifikant (Abbildung 3B). Die hepatische CAT-Genexpression war in der Gruppe mit 20,78 mg/kg Arsen im Vergleich zur Gruppe mit {{105}},95 mg/kg Arsen signifikant verringert (P, 0,05) und erreichte ein Plateau in den Gruppen 40,67 und 60,25 mg/kg Arsen. Die renale CAT-Genexpression war in der Gruppe mit 20,78 mg/kg Arsen im Vergleich zu der Gruppe mit 0,95 mg/kg Arsen signifikant verringert (P, 0,05) und erreichte in der Gruppe mit 40,67 mg/kg Arsen ein Plateau und war in der Gruppe mit 60,25 mg/kg stark verringert Arsen-Gruppe verglichen mit der 0,95 mg/kg Arsen-Gruppe (P, 0,05, Abbildung 3C). Die GR-Genexpression in Leber und Niere war in der Gruppe mit 20,78 mg/kg Arsen im Vergleich zu der Gruppe mit 0,95 mg/kg Arsen (P, 0,05) signifikant verringert und erreichte in den Gruppen mit 40,67 und 60,25 mg/kg Arsen ein Plateau (Abbildung 3D). Darüber hinaus nahm die hepatische GSH-Px-Genexpression signifikant ab, wenn die Arsendosis aus der Nahrung von 0,95 auf 40,67 mg/kg (P, 0,05) stieg und dann in der Gruppe mit 60,25 mg/kg Arsen ein Plateau erreichte. Die renale GSH-Px-Genexpression nahm in der Gruppe mit 20,78 mg/kg Arsen im Vergleich zu der Gruppe mit 0,95 mg/kg Arsen (P, 0,05) signifikant ab und erreichte in den Gruppen mit 40,67 und 60,25 mg/kg Arsen ein Plateau (Abbildung 3E). Die Nrf2-Genexpression in Leber und Niere war in der Gruppe mit 20,78 mg/kg Arsen im Vergleich zu der Gruppe mit 0,95 mg/kg Arsen signifikant verringert (P, 0,05) und erreichte in den Gruppen mit 40,67 und 60,25 mg/kg Arsen ein Plateau (Abbildungen 4A und 4C ). Im Gegensatz dazu war die Keap1-Genexpression in Leber und Niere in der Gruppe mit 20,78 mg/kg Arsen im Vergleich zu der Gruppe mit 0,95 mg/kg Arsen stark erhöht (P, 0,05) und erreichte in den Gruppen mit 40,67 und 60,25 mg/kg Arsen ein Plateau (Abbildungen 4B und 4D).

Korrelationsanalysen in Bezug auf den Nrf2- Keap1 Pathway

Die Genexpression von CuZnSOD (Leber, r {{0}}.613, P , 0,01;Niere, r {{0}}.687, P , 0.{{10}}1), CAT (Leber, r 5 0.738, P , 0.01; Niere, r 5 0.903, P , 0.01), GR (Leber, r 5 0 0,477, P 0,05; Niere, r 5 0 0,485, P 0,05) und GSH-Px (Leber, r 5 0 0,450, P 0,05; Niere , r 5 0,767, P, 0,01) in Leber und Niere, und die hepatische MnSOD-Genexpression (r 5 0,707, P, 0,01) waren positiv mit den Aktivitäten ihrer entsprechenden korreliert antioxidative Enzyme. Darüber hinaus korrelierte die Nrf2-Genexpression positiv mit der Genexpression von CuZnSOD (Leber, r 5 0.756, P 0,01;Niere, r {{0}}.736, P , 0.01), CAT (Leber, r 5 0.893, P , 0,01;Niere, r {{0}}.740, P , {{10}}.01), GR (Leber, r 5 0 0,837, P 0,01; Niere, r 5 0 0,915, P 0,01) und GSH-Px (Leber, r 5 0 0,822, P 0,01; Niere, r {{17} }.722, P, 0,01) in der Leber undNiereund hepatische MnSOD-Genexpression (r {{0}}.720, P 0,01). Es gab eine negative Korrelation zwischen Nrf2- und Keap1-mRNA-Expression (Leber, r 5 20.746, P 0,01;Niere, r {{0}}.771, P , 0,01) in Leber und Niere. Darüber hinaus gab es keine Korrelation zwischen der MnSOD-Genexpression und der SOD-Enzymaktivität oder der Nrf2-mRNA-Expression in derNieren von Legehennen(Tabelle 5).

DISKUSSION

Arsen ist ein allgegenwärtiges und toxisches Metalloid in der Natur. Es induziert mehrere Toxikosen bei Menschen und Tieren, einschließlich Hepatotoxizität, Nephrotoxizität, Neurovirulenz, Immuntoxizität, kardiovaskuläre Toxizität, Hepatotoxizität und Reproduktionstoxizität (Mandal und Suzuki, 2002). Arsen zielt am stärksten auf das Fortpflanzungssystem von Tieren ab. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine Roxarsone-Exposition über die Nahrung die Legerate und die Eiproduktion stört (Chiou et al., 1999; Zhang et al., 2017). In dieser Studie verringerte die Nahrungsergänzung mit Arsen die Legeleistung signifikant, einschließlich der Eiproduktion und der EW. Frühere Studien haben herausgefunden, dass eine Nahrungsergänzung mit Arsen die Akkumulation von Arsen in Eiern induziert und die Eiqualität verringert (Chiou et al., 1998; Zhang et al., 2017). In der vorliegenden Studie verringerte die Nahrungsergänzung mit Arsen die Haugh-Einheit, die Albuminhöhe und die Stärke der Eierschale signifikant. Mit Ausnahme von Eigelbfarbe und Eierschalendicke wurden negative Korrelationen zwischen der Arsenablagerung in Eiern und Eiqualitätsparametern gefunden. Dies deutet darauf hin, dass die Haugh-Einheit, die Albuminhöhe und die Stärke der Eierschale durch die Ablagerung von Arsen im Ei beeinflusst werden könnten. Wie wir wissen, ist die Palisadenschichtdicke in der Eierschale die Determinante der Eierschalendicke (Ruiz und Lunam, 2000), während die Pigmentablagerung die Dotterfarbe bestimmt. Daher spekulierten wir, dass eine Nahrungsergänzung mit Arsen die Dicke der Palisadenschicht der Pigmentablagerung in den Eiern von Legehennen möglicherweise nicht beeinflusst. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Leber- und Nierenerkrankungen bei Säugetieren nach Arsenexposition häufig sind (Liu und Waalkes, 2008; Huang et al., 2009). Eine frühere Studie zeigte, dass Arsenexposition histopathologische Läsionen in der Leber hervorruft, einschließlich Gewebedesorientierung, Peliose und Vakuolisierung, begleitet von Karyolyse, Apoptose und Nekrose von Hepatozyten bei Channa punctatus (Roy und Bhattacharya, 2006). In dieser Studie beobachteten wir schwerwiegende Veränderungen in der Proliferation des Gallengangs, der Hepatozytensteatose und der Deformation der Zentralvene in der Leber, als die Arsendosis aus der Nahrung von 20,78 auf 60,25 mg/kg anstieg. Roy und Bhattacharya (2006) fanden auch heraus, dass Arsenexposition zu einer Schrumpfung des Glomerulus, Unregelmäßigkeiten im Nierentubulus und einer Vergrößerung des Bowman-Raums führt. In der vorliegenden Untersuchung, wie die Dosis von Arsen in der Nahrung

von 20,78 auf 60,25 mg/kg erhöht, waren die histopathologischen Veränderungen der Nieren sehr schwerwiegend, einschließlich Vergrößerung der Nierentubuli, glomerulärer Schrumpfung und tubulärer Fibrose und Hyalinisierung, was mit einer früheren Studie übereinstimmt (Roy und Bhattacharya, 2006). Gemäß früheren Berichten haben sich die AST- und ALT-Spiegel im Serum als Surrogatmarker der hepatischen Entzündungsreaktion und der Fibrose erwiesen (Wang et al., 2008; Khattab et al., 2015). In dieser Studie deuteten Anstiege der AST- und ALT-Spiegel im Serum darauf hin, dass die entzündliche Reaktion der Leber nach einer Arsenexposition verstärkt wurde, was mit den beobachteten histopathologischen Veränderungen in der Leber von Legehennen übereinstimmte. Patel und Kalia (2013) stellten auch fest, dass sich die durch Arsen induzierte Hepatotoxizität in einem Anstieg der ALT- und AST-Spiegel im Serum bei Wistar-Ratten manifestiert. Die Nierenfunktion wird routinemäßig anhand der BUN-, CT- und UA-Spiegel im Serum überwacht. Wir fanden heraus, dass die BUN- und UA-Spiegel im Serum signifikant erhöht waren und die Serum-CT-Spiegel tendenziell nach Nahrungsergänzung mit Arsen anstiegen, was darauf hindeutetNiereSchädenresultierte aus der Arsenexposition bei Legehennen, was mit früheren Forschungsergebnissen übereinstimmt (Liu et al., 2000). Es ist allgemein bekannt, dass durch Arsenbelastung verursachte Gewebeschäden in engem Zusammenhang mit oxidativem Stress stehen (Jomova et al., 2011). Wenn oxidativer Stress ausgelöst wird, induzieren intrazelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS) LPO, was durch intrazelluläre MDA-Spiegel überwacht werden kann (Storey, 1996). In dieser Studie waren die hepatischen und renalen MDA-Spiegel nach Nahrungsergänzung mit Arsen signifikant erhöht, was darauf hindeutet, dass es einen Anstieg von LPO gab, was auf eine oxidative Schädigung der Leber und Leber hindeuten könnteNieren von Legehennen.GSH spielt auch eine wichtige Rolle bei der Regulation von intrazellulärem oxidativem Stress (Finkel und Holbrook, 2000). Verglichen mit denen in der Gruppe mit 0,95 mg/kg Arsen, GSH-Werte

waren in den Gruppen, die mit höheren Arsenkonzentrationen behandelt wurden, signifikant verringert, was darauf hindeutet, dass Arsen möglicherweise an GSH bindet, um die antioxidativen Fähigkeiten der Leber abzuschwächenNiere.Floraet al. (1997) berichteten, dass Arsen-Exposition die GSH-Konzentration verringert und ausgeprägte Läsionen in der Leber und der Leber hervorruftNierenvon Ratten. Darüber hinaus verleihen intrazelluläre antioxidative enzymatische Systeme Schutzfunktionen zum Schutz vor oxidativem Stress, einschließlich SOD, CAT, GR und GSH-Px (Finkel und Holbrook, 2000). In dieser Studie reduzierte die Nahrungsergänzung mit Arsen die Aktivitäten von SOD, CAT, GR und GSH-Px in Leber und Nieren von Legehennen signifikant. Wenn antioxidative Systeme den Überschuss an intrazellulärem ROS nicht neutralisieren können, kommt es aufgrund von LPO zu oxidativen Schäden, die wiederum die Aktivitäten von antioxidativen Enzymen abschwächen könnten. Eine frühere Studie berichtete in ähnlicher Weise, dass Arsen oxidativen Stress in der Rattenniere auslöst (Sener et al., 2016). Antioxidative Enzyme sind Proteine ​​und könnten durch Gene auf Transkriptionsebene reguliert werden. In der vorliegenden Studie verringerte die Arsen-Exposition die mRNA-Expression von CuZnSOD, CAT, GR und GSHPx signifikant. Darüber hinaus war die Genexpression von CuZnSOD, CAT, GR und GSH-Px positiv mit den Aktivitäten von antioxidativen Enzymen korreliert, was darauf hindeutet, dass die Arsen-Exposition die Aktivitäten von antioxidativen Enzymen durch Hemmung der mRNA-Expression reduzierte. In ähnlicher Weise wurde über Korrelationen zwischen den Aktivitäten antioxidativer Enzyme und der Genexpression in der Leber und den Nieren von Legehennen nach Quecksilberexposition berichtet. Die Nahrungsergänzung mit Arsen beeinflusste die MnSOD-Expression jedoch nichtNiere.Dies kann daran liegen, dass SOD mehrere Isoenzyme hat und seine Aktivität nicht durch das MnSOD-Gen beeinflusst wird. Nrf2 spielt eine wichtige Rolle im Abwehrsystem gegen oxidativen Stress. Unter basalen Bedingungen bindet Nrf2 an Keap1 im Zytoplasma. Sobald der intrazelluläre ROS-Spiegel hoch genug ist, um die reaktiven Thiolgruppen von Keap1 zu modifizieren, wandert Nrf2 viel leichter in den Zellkern, wo es die Antioxidantien irritiert

Element und aktiviert dann nachgeschaltete Schutzgene (Sinha et al., 2013). In dieser Studie fanden wir heraus, dass die Arsenexposition die Nrf2-Genexpression und die Expression nachgeschalteter antioxidativer Enzyme signifikant reduzierte. Die Herunterregulierung von Nrf2 und nachgeschalteten antioxidativen Enzymgenen nach Arsenexposition deutete darauf hin, dass Arsen die Expression von antioxidativen Enzymgenen durch Unterdrückung der Nrf2-Genexpression in der Leber hemmte undNiere. Darüber hinaus korrelierte die Steigerung der Keap1-Genexpression negativ mit der Genexpression von Nrf2 und antioxidativen Enzymen, was impliziert, dass die Hochregulierung von zytoplasmatischem Keap1 die Nrf2-Translokation vom Zytoplasma zum Zellkern fördert (Kensler et al., 2007). Eine ähnliche Studie berichtete, dass der intrazelluläre Nrf2-Keap1-Signalweg als Reaktion auf eine Arsenexposition inaktiviert wird (Janasik et al., 2018). Nichtsdestotrotz berichtete eine frühere Studie auch, dass die Exposition gegenüber Arsen den Nrf2-Keap1-Signalweg verstärkt, um vor oxidativen Schäden zu schützen (Massrieh et al., 2006). Diese Ergebnisse stehen nicht im Widerspruch zu dieser Studie. In den frühen Stadien von oxidativem Stress könnten die Schutzwirkungen von Nrf2-Keap1 aktiviert werden, um oxidativen Stress zu verhindern. Nichtsdestotrotz widersteht der Nrf2-Keap1-Weg möglicherweise nicht oxidativen Schäden, die durch anhaltende Exposition gegenüber einer hohen Arsendosis verursacht werden (Kensler et al., 2007). Danach könnte der Nrf2--Keap1-Signalweg gehemmt werden, und in Leber und Nieren von Legehennen kann es zu intrazellulären oxidativen Schäden oder sogar zu Apoptose kommen. Angesichts der vorliegenden Ergebnisse liefert diese Studie einige neue Beweise für die hepatische und renale antioxidative Abwehr unter Arsen-Exposition bei Legehennen und beleuchtet zum ersten Mal eine zentrale Rolle des Nrf2-Keap1-Signalwegs bei Arsen-induziertem oxidativem Stress . Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine Nahrungsergänzung mit Arsen die Legeleistung und die Eiqualität von Legehennen reduziert. Histopathologische Schäden traten in der Leber und aufNierenach diätetischer Arsenbelastung. Darüber hinaus induzierte Arsenexposition in der Nahrung hepatischen und renalen oxidativen Stress durch Beeinträchtigung des Nrf2-Keap1-Signalwegs bei Legehennen.