Molekularer Nachweis von Reifungsstadien in der sich entwickelnden Niere
Feb 20, 2022
ABSTRAKTJüngste Fortschritte in der Stammzellbiologie haben die Erzeugung von ermöglicht NiereOrganoide in vitro, und eine weitere Reifung dieser Organoide wird nach einer experimentellen Transplantation beobachtet. Die derzeitigen Organoide bleiben jedoch unreif, und ihre genauen Reifungsstadien sind aufgrund begrenzter Informationen über entwicklungsstadienabhängige Genexpressionen in denNierein vivo. Um relevante molekulare Koordinaten zu ermitteln, führten wir bei der Entwicklung eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) durchNierenin verschiedenen Stadien in der Maus. Durch die Auswahl von Genen, die eine Hochregulierung bei der Geburt im Vergleich zum Tag 15,5 des Embryos sowie eine zelllinienspezifische Expression aufwiesen, erstellten wir Genlisten, die mit Entwicklungsstadien in einzelnen Zelllinien korrelieren. Anwendung dieser Listen auf transplantierte EmbryonenNieren zeigten, dass die meisten Zelltypen, abgesehen von den Sammelrohren, eine ähnliche Reifung aufwiesenNierenim neonatalen Stadium in vivo, was eine nicht-synchrone Reifung über die Zelllinien hinweg zeigt. Daher können unsere scRNA-seq-Daten als nützliche molekulare Koordinaten dienen, um die Reifung der Entwicklung zu beurteilenNierenund schließlich vonNiereOrganoide.
Schlüsselwörter:Nierenentwicklung, Einzelzell-RNA-Sequenzierung, Reifung, In-situ-Hybridisierung, Nieren
EinführungDasNierewird von mindestens zwei Arten von Vorläufern abgeleitet: Nephron-Vorläufer und Ureterknospe (Costantini und Kopan, 2010). Die Nephron-Vorläufer geben Tonephrone ab, darunter glomeruläre Podozyten, proximale Tubuli, Henle-Schleifen (LOH) und distale Tubuli, während sich die Ureterknospe ausgiebig verzweigt, um die Sammelrohre und den Harnleiter zu bilden (Kobayashietal., 2008) (Maroseetal., 2008). Diese differenzierten Komponenten bilden den Harnweg fließen. Die Nephron-Vorläufer und die Ureterknospe beginnen ihre Interaktionen um den Embryonaltag (E) 11,5 in Mäusen. Bei E 15,5 werden die gesamten Nephronsegmente spezifiziert, aber neue Nephrone werden weiterhin aus den Nephron-Vorläufern erzeugt. Nach glomerulärer Vaskularisierung beginnt der Urin bei E16,5–E17,5 zu fließen (Rasouly und Lu, 2013). In der Zwischenzeit ist die innere (medulläre) Region derNieredehnt sich aus und spiegelt die Verlängerung des LOH und der Sammelkanäle wider. Diese Entwicklung der Markregion setzt sich nach dem Tag der Geburt fort (P0), während Nephron-Vorläufer die Selbsterneuerung einstellen und innerhalb weniger Tage nach der Geburt verschwinden (Hartmanet al., 2007) (Rumballe et al., 2011) ( Volovelsky et al., 2018).
Jüngste Fortschritte in der Stammzellbiologie haben die Erzeugung von ermöglichtNiereOrganoide in vitro (Morizane et al., 2015; Taguchi et al., 2014; Takasato et al., 2015). Wir haben zuvor erstelltNiereOrganoide aus pluripotenten Stammzellen: embryonale Stammzellen der Maus (ESCs) und menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) (Taguchietal., 2014).Nierenbei etwa E14,5–E15,5 bei Mäusen und 10–14 Schwangerschaftswochen beim Menschen (Taguchi und Nishinakamura, 2017; Takasatoet al., 2015; Wu et al., 2018). Wir und andere haben auch Methoden zur experimentellen Transplantation entwickeltNiereOrganoide in immundefiziente Mäuse, was eine Organoidvaskularisierung und Verbindung zum Wirtskreislauf ermöglicht (Bantounas et al., 2018; Sharmin et al., 2016; Subramanian et al., 2019; Tanigawa et al., 2018; van den Berg et al., 2018). Bei der Transplantation erwerben glomeruläre Podozyten innerhalb der Organoide reifere morphologische Merkmale im Zusammenhang mit der Filtrationsfunktion, die möglicherweise durch eine Sauerstoffversorgung und/oder Wechselwirkung mit vaskulären Endothelzellen verursacht werden. Während die genauen Mechanismen ungelöst bleiben, wird die Transplantation häufig verwendet, um die Reifung von Organoiden in zu induzieren das Forschungsgebiet der Stammzellbiologie.
Trotz dieser Fortschritte ist eine genaue Bestimmung der Reifungsstadien schwierig, da molekulare Koordinaten, dh umfassende Informationen über die stadienabhängige Genexpression bei der Entstehung fehlenNiere.Derzeit sind diese Koordinaten nicht einmal für Mausembryonen verfügbarNierenin vivo. Diese Situation ergibt sich hauptsächlich aufgrund der zunehmenden Anzahl von Zelltypen währendNiereEntwicklung, wobei jeder Zelltyp kleine Mengen an Zellen enthält. Herkömmliche Genexpressionsanalysen, die eine große Anzahl homogener Zellen erfordern, sind für eine heterogene Reifung nicht geeignetNieren.Die GUDMAP-Datenbank (www.gudmap.org) hat eine große Anzahl von Genexpressionsanalysen in der Entwicklung angesammeltNiere, einschließlich einiger insgesamtNierenund einige in sortierten oder mikrodissezierten Zellen (McMahon et al., 2008). Allerdings auch die
letztere Analysen enthalten oft Zellen aus mehreren Stadien, sodass die Daten nicht direkt für Reifungsanalysen verwendbar sind. Die Analyse der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) hat die Untersuchung von Genexpressionen in komplizierten und heterogenen Organen ermöglicht, einschließlich derNiere, und einige dieser Daten wurden in der GUDMAP-Datenbank hinterlegt (Adam et al., 2017a; Combes et al., 2019a, 2019b; Lindström et al., 2018; Magella et al., 2017; Ransick et al. , 2019; Wanget al., 2018; Wu et al., 2018). Die meisten dieser früheren Studien analysierten jedoch embryonale oder erwachsene TiereNierenzu einem einzigen Zeitpunkt oder im Vergleich
lebendigNierenmit in-vitroNiereOrganoide. Daher haben sich nur wenige Studien damit befasstNiereReifung von der Mitte der Schwangerschaft bis zur Geburt für einen begrenzten Zelltyp (Chen et al., 2015). Molekülkoordinaten für zu etablierenNiereReifung In der vorliegenden Studie führten wir scRNA-seq an sich entwickelnden Mäusen durchNierenin verschiedenen Stadien und ausgewählte reifungsabhängige Gene. Wir bewerteten ferner den Reifungsstatus von transplantierten embryonalen Nieren, indem wir die RNA-seq-Daten und die Expression von reifungsabhängigen Genen verglichen. Unsere RNA-seq-Daten und die ausgewählten Genlisten dienen als Referenzwerkzeuge für die Reifung der EntwicklungNierenund schließlich vonNiereOrganoide.
Ergebnisse
scRNA-seq-Analyse von sich entwickelnden NierenWir führten scRNA-seq an der sich entwickelnden Maus durchNierenin drei verschiedenen Stadien: E15.5, E17.5 und P0. Es wurden qualitativ hochwertige Daten mit mittleren Lesevorgängen von 4.493, 2,36 0 bzw. 2.467 Genen pro Zelle erhalten. Nach Analyse der Daten mit Seurat v3.1.1 (Butler et al., 2018; Stuart et al., 2019a) wurden die Zellen in 45 Cluster eingeteilt, mit einer größeren Anzahl fester Cluster bei P0 als bei E15.5 (Abb. 1A). Wir identifizierten Zelltypen für die meisten Cluster unter Verwendung zelltypspezifischer Marker: Nephron-Vorläufer (Six2þ, Cluster 0, 1 und 10), glomeruläre Podozyten (Nphs1þ, Cluster 8 und 11), glomeruläre Belegepithelzellen (Claudin 1 (Cldn1 )þ, Cluster 20), proximale Tubuli (S1-Segment: Solute Carrier Family (Slc) 5a2þ, Cluster 15 und 31; S2-Segment: Slc5a2?/Slc34a1þ, Cluster 13 und 6; S3-Segment: Aquaporin 1 (Aqp1)þ/Slc7a13þ (Lee et al., 2015; Ransick et al., 2019), Cluster 37), LOH (dünner absteigender Ast: Aqp1þ/Slc39a8þ (Lee et al., 2015; Ransick et al., 2019), Cluster 27; dick aufsteigend Extremität: Uromodulin (Umod)þ/Slc12a1þ, Cluster 28 und 17), distale Tubuli (Slc12a3þ, Cluster 5), Harnleiterknospenspitzen (Retþ, Cluster 22 und 35) und Sammelrohrstiele (Aqp2þ, Cluster 16, 21 und 41) (Abb. 1B, Abb. S1A). Eingelagerte Zellen bildeten einen Cluster, der von den Sammelrohrclustern getrennt war (Atp6v1g3þ, Cluster 39) (Abb. 1B). Interstitielle Zellen wurden in mehrere Cluster eingeteilt (7, 9, 12, 14, 23, 29, 30, 33 und 34), unter denen die Cluster 9/33, 12 und 34 stromale Vorläufer darstellen könnten (Foxd1þ (Kobayashi et al. , 2014)), Mesangialzellen (Nt5eþ) bzw. Renin-produzierende Zellen (Ren1þ) (Abb. S1B). Endothelzellcluster (Pecam1þ, Cluster 3, 19, 24, 25 und 32) enthielten Ehd3þ-Zellen (Cluster 32, Abb. S1C), die wahrscheinlich glomeruläre Endothelzellen darstellten (Patrakka et al., 2007). So kategorisierte Seurat v3.1.1, das Integrationsanker verwendet, um die nächsten Nachbarn zu gruppieren (Stuartet al., 2019b), erfolgreich zahlreiche Zelltypen in theNierenin verschiedenen Entwicklungsstadien.
Zeitliche Änderungen der Transkriptionsfaktorexpressionen und Entwicklungssignalaktivitäten währendNiereReifung
Nephron-Vorläufer wurden in drei Cluster eingeteilt (Abb. S1D): Cluster 0 mit Six2þ/Cited1þ naiven Zellen, Cluster 10 mit Six2þ/Cited1þ/Top2aï proliferierenden naiven Zellen und Cluster 1 mit Six2þ/Cited{{10} }/Wnt4þ geprimte Zellen (Boyle et al., 2008; Kobayashiet al., 2008; Self et al., 2006). Während der Nephronsegmentspezifikation bildete die Nephronvorläuferpopulation zuerst einen Mafb þ-Podozytenzweig,
die sich schließlich in Nphs1þ-Podozyten differenzierten (Abb. 1B und 2A). Die Verzweigungen für proximale Tubuli und LOH/distalen Tubuli bildeten sich separat von der Podozytenverzweigung. Vorläuferzellen für Proximaltubuli
exprimierten die Transkriptionsfaktor-Gene Osr2 und dann Hnf4a (Abb. 2B), von denen letzteres reifungsabhängige Gene in den proximalen Tubuli reguliert (Deacon et al., 2019; Marable et al., 2018, 2020; Martovetsky
et al., 2013). Gemeinsame Vorläuferzellen für LOH/distalen Tubuli exprimierten sowohl Pou3f3 (Nakai et al., 2003) als auch Sim1, mit anschließender Expression von Sim2 und Gata3 nach Spezifikation von LOH bzw. distalen Tubuli (Abb. 2C). Tfap2b, von dem kürzlich berichtet wurde, dass es für die Entwicklung distaler Nephrone wichtig ist (Marneros, 2020), wurde auch in LOH und distalen Tubuli nachgewiesen (Abb. S1E). Somit treten zeitliche Verschiebungen der Transkriptionsfaktorexpressionen in einzelnen Nephronsegmenten während aufNiereReifung, und die Cluster an den peripheren Enden der Zweige (Cluster 5, 6, 8, 17, 31 und 37) repräsentieren das reifste Stadium in jeder Linie.
Aus Sicht der Entwicklungssignale wurde ein Indikator für die Aktivität des WNT-Signalwegs, Axin2, hauptsächlich in sich entwickelnden distalen Tubuli nachgewiesen, wie zuvor berichtet (Jho et al., 2002). Fgf8 und Etv4, ein
Indikator für FGF-Signalisierungsaktivität (Maoetal., 2009), wurden auch in sich entwickelnden distalen Tubuli exprimiert, jedoch auf ein unreifes Stadium beschränkt. Im Gegensatz dazu wurde Bmp7 (Oxburgh et al., 2005) in distalen Tubuli sowohl im unreifen als auch im reifen Stadium sowie in Podozyten exprimiert, während Bmp4 (Miyazaki et al., 2000) hauptsächlich in proximalen Tubuli nachgewiesen wurde. Wir stellten auch fest, dass die Aktivitäten der wichtigsten Signalwege verringert wurden.
in reifen Zellen in den meisten Nephronsegmenten reguliert. Zum Beispiel fehlten Axin2 (WNT-Signalisierungsindikator) und Etv4 (FGF-Signalisierungsindikator) in reifen Podozyten und proximalen und distalen Tubuli (Abb. 2D). Die gleiche Tendenz wurde für Hey1 (Notch-Signalisierungsindikator) beobachtet, während Hes1 nur in Podozyten und proximalen Tubuli herunterreguliert wurde (Abb. 2E). Ein BMP-Signalisierungsindikator, Id1 (Korchynskyi und Ten Dijke, 2002; Léopez-Rovira et al., 2002), war in reifen Podozyten und distalen Tubuli verringert (Abb. 2F). Daher wird währenddessen eine nephronsegmentspezifische Aktivierung der Entwicklungssignalisierung, gefolgt von einer Herunterregulierung, beobachtetNiereReifung.
Vom Entwicklungsstadium abhängige Genlisten für einzelne Zelllinien
Unsere scRNA-seq-Analyse zeigte, dass UMAP-Cluster, die einige etablierte abstammungsbeschränkte Differenzierungsmarker exprimierten, bereits bei E15.5 vorhanden waren (Abb. 1B). Um stadienabhängige Gene für einzelne Nephronsegmente zu identifizieren, haben wir zunächst die Gen-Expressionen zwischen E15.5 und P0 in den reifsten Clustern jeder Linie verglichen und Gene herausgegriffen, die bei P0 im Vergleich zu E15 signifikant hoch- oder herunterreguliert waren. 5. Wir fanden jedoch heraus, dass diese Listen Gene enthielten, die mit zellulärem Stress assoziiert sind, wie Hitzeschockproteingene, Gene der Jun/Fos-Familie und Gadd45-Gene (Adam et al., 2017a), die durch hervorgerufen werden können die härteren Zelldissoziationsprozesse, die für P0 verwendet werdenNieren. Because these genes were ubiquitously expressed, it was difficult to discriminate them from maturation-dependent genes that were ubiquitously expressed. Thus, we decided to select cell-type specific genes and picked up the upregulated or downregulated genes in the corresponding clusters between the two stages. Most of the upregulated genes at P0 showed consistent results in UMAP plots, while the downregulated genes showed less prominent differences between the two stages. In addition, the downregulated genes were detected in more immature cell clusters at P0, reflecting the repetitive differentiation processes from nephron progenitors. Therefore, we decided to focus on the upregulated genes (fold change, >2.5) und kuratierte jedes Kandidatengen für seine räumlich-zeitliche Expression basierend auf den UMAP-Plots. Violinplots der endgültig ausgewählten Gene zeigten ihre stadienabhängigen Expressionen in einzelnen Zelllinienaltern (Abb. 3A, Abb. S2, S3, S4A, Tabelle S1). Punktdiagramme bestätigten ihre zelltypspezifischen Expressionen ( 3B ), obwohl viele Gene, die für das S2-Segment der proximalen Tubuli ausgewählt wurden, auch in den S1- und S3-Segmenten exprimiert wurden. Diese ausgewählten Genlisten umfassten Kollagen Typ 4 Alpha3-Kette (Col4a3) und Semaphorin (Sema) 3g für Podozyten, Slc5a12 (Laktattransporter) und Cytochrom P450-Familie (Cyp) 27b1 (Alpha-Hydroxylase von Vitamin D) für proximale Tubuli, Umod und Prostaglandin E Rezeptor 3 (Ptger3) für LOH, Aqp2 und Aqp3 für Sammelkanäle und Lipocalin2 (Lcn2) für Harnleiterknospenspitzen. Die meisten Gene waren bereits bei E17.5 hochreguliert
und zeigten vergleichbare Expressionsniveaus wie bei P0, was darauf hindeutet, dass zwischen E15.5 und E17.5 eine erhebliche Reifung stattfinden kann. Wir haben nur wenige Gene für distale Tubuli entdeckt (Tabelle S1), da die meisten hochregulierten Gene in dieser Zelllinie auch in Sammelrohren exprimiert wurden. Zusammengenommen entwickelt sich die scRNA-seq-AnalyseNierenin mehreren Reifungsstadien ermöglichten die Identifizierung von stadienabhängigen und abstammungsspezifischen Genen in den meisten Nephronsegmenten.
Histologische Validierung stadienabhängiger Genexpressionen repräsentativer Gene
Um die Gültigkeit der Genlisten durch histologische Untersuchung zu bestätigen, haben wir die Expression ausgewählter Gene in E15.5 und P0 bestimmt.NierenB. durch konventionelle Digoxigenin-basierte In-situ-Hybridisierung oder hochempfindliche RNAscope-Technologie (Wang et al., 2012). Da die In-situ-Hybridisierung und insbesondere die RNAscope-Technologie eine umfangreiche Signalverstärkung beinhaltet, ist es unwahrscheinlich, dass subtile Unterschiede in den Genexpressionsniveaus erkannt werden. Daher wählten wir Gene aus, die eine minimale Expression bei E15.5 zeigten und in den UMAP-Plots auf eine einzelne Linie bei P0 beschränkt waren. Solche Gene wären auch nützlich für die kostengünstige Bewertung von Reifungsstadien anhand histologischer Schnitte. In Podozyten wurden alle vier untersuchten Gene (Col4a3, Sema3g, Htra1, Clic3) leicht bei P0 nachgewiesen, und ihre Expressionsniveaus bei E15.5 waren niedriger als die bei P0 (Abb. 4A ). Im Gegensatz dazu zeigte Nphs1 eine vergleichbare Expression in den beiden Stadien (Fig. 4A). In den proximalen Tubuli zeigten drei Gene (Slc5a12, Cyp27b1, Kap) schwache oder minimale Signale bei E15.5 und eine starke Expression bei P0 (Abb. 4B), während Slc34a1 eine vergleichbare Expression in beiden Stadien zeigte (Abb. 4B). Stadienabhängige Expressionen von drei Genen wurden in LOH (Umod, Ptger3, Car15) validiert, im Gegensatz zu der relativ konstanten Expression von Slc12a1 (Abb. 5A). Wir haben auch eine In-situ-Hybridisierung für drei Gene (Aqp2, Cdkn2b, Lcn2) in Sammelrohren durchgeführt und ihre stadienabhängigen Expressionen bestätigt (Abb. 5B). Unter diesen wurden Aqp2 und Cdkn2b in Sammelrohrstielen exprimiert, während Lcn2 in Ureterknospenspitzen nachgewiesen wurde. Im Gegensatz dazu zeigten Ret und Wnt7b relativ konstante Expressionsniveaus (Fig. 5B). Die In-situ-Hybridisierungsdaten stimmten mit den UMAP-Diagrammen überein, was die Zuverlässigkeit unserer scRNA-seq-Daten unterstützt.
Histologische Validierung stadienabhängiger Genexpressionen repräsentativer Gene
Um die Gültigkeit der Genlisten durch histologische Untersuchung zu bestätigen, haben wir die Expression ausgewählter Gene in E15.5 und P0 bestimmt.NierenB. durch konventionelle Digoxigenin-basierte In-situ-Hybridisierung oder hochempfindliche RNAscope-Technologie (Wang et al., 2012). Da die In-situ-Hybridisierung und insbesondere die RNAscope-Technologie eine umfangreiche Signalverstärkung beinhaltet, ist es unwahrscheinlich, dass subtile Unterschiede in den Genexpressionsniveaus erkannt werden. Daher wählten wir Gene aus, die eine minimale Expression bei E15.5 zeigten und in den UMAP-Plots auf eine einzelne Linie bei P0 beschränkt waren. Solche Gene wären auch für eine kostengünstige Bewertung von Reifungsstadien unter Verwendung histologischer Schnitte nützlich. In Podozyten wurden alle vier untersuchten Gene (Col4a3, Sema3g, Htra1, Clic3) leicht bei P0 nachgewiesen, und ihre Expressionsniveaus bei E15.5 waren niedriger als die bei P0 (Abb. 4A ). Im Gegensatz dazu zeigte Nphs1 eine vergleichbare Expression in den beiden Stadien (Fig. 4A). In den proximalen Tubuli zeigten drei Gene (Slc5a12, Cyp27b1, Kap) schwache oder minimale Signale bei E15.5 und eine starke Expression bei P0 (Abb. 4B), während Slc34a1 eine vergleichbare Expression in beiden Stadien zeigte (Abb. 4B). Stadienabhängige Expressionen von drei Genen wurden in LOH (Umod, Ptger3, Car15) validiert, im Gegensatz zu der relativ konstanten Expression von Slc12a1 (Abb. 5A). Wir haben auch eine In-situ-Hybridisierung für drei Gene (Aqp2, Cdkn2b, Lcn2) in Sammelrohren durchgeführt und ihre stadienabhängigen Expressionen bestätigt (Abb. 5B). Unter diesen wurden Aqp2 und Cdkn2b in Sammelrohrstielen exprimiert, während Lcn2 in Ureterknospenspitzen nachgewiesen wurde. Im Gegensatz dazu zeigten Ret und Wnt7b relativ konstante Expressionsniveaus (Fig. 5B). Die In-situ-Hybridisierungsdaten stimmten mit den UMAP-Diagrammen überein, was die Zuverlässigkeit unserer scRNA-seq-Daten unterstützt.
Transplantierte embryonale Nieren zeigen eine Reifung nahe dem Neugeborenenstadium
Um festzustellen, ob transplantiertNierenNach dem physiologischen Reifungsprozess führten wir Transplantationsexperimente mit embryonalen Mäusen durchNierenals Spendergewebe. Wegen Transplantation von
isoliert embryonalNierenHydronephrose verursachte, die wahrscheinlich auf eine Fehlverbindung der Harnwege zurückzuführen war (Abb. S5A), verwendeten wir ein zuvor berichtetes Protokoll, das möglicherweise den intakten Harnfluss erhält (Yokote et al., 2015). Dafür haben wir E12.5 verpflanztNierenverbunden mit der Kloake, dem Vorläufer der Blase, in das Nebenhodenfett erwachsener Wirtsmäuse (Abb. 6A). Bei der Ernte 12 Tage nach der Transplantation wird dieNierenhatte an Größe zugenommen (3,29 ? 0,35 mm 2 vs. 0,23 ? 0,02 mm 2 , n¼ 3, p < 0,05) und Urin wurde in der Blase nachgewiesen (Abb. 6A), was darauf hindeutet, dass der Urin durch die Blase fließtNiere-Die Blasenverbindung blieb erhalten. Die histologische Analyse zeigte, dass das Nierenmark mit kortikomedullärer Musterung gebildet war (Abb. 6A). Die Färbung zelltypspezifischer Marker zeigte, dass die Gesamtverteilung von LTL þ proximalen Tubuli, SLC12A1 þ LOH und KRT8 þ Harnleiterknospen erhalten blieb (Abb. 6B) und dass Glomeruli mit NPHS1þ Podozyten mit PECAM1þ Endothelzellen vaskularisiert wurden (Abb. S5B). , die selten während der In-vitro-Kultur embryonaler Nieren beobachtet wird (Halt et al., 2016). Als nächstes führten wir eine scRNA-seq-Analyse von transplantierten Embryonen durchNierenund verglichen die Daten mit denen, die von embryonalen Nieren in vivo erhalten wurden. Die UMAP-Plots der transplantierten Nieren zeigten ähnliche Clustermuster wie die von Neugeborenennieren in vivo (Abb. 6C), aber die Cluster, die die Nephron-Vorläufer und Ureterknospenspitzen darstellten, fehlten in den transplantierten Nieren (Abb. 6C, Abb. S5C und D). Obwohl der Grund für diese unerwartete Erschöpfung der nephrogenen Nische unbekannt bleibt, könnte er die geringere Größe transplantierter Nieren im Vergleich zu Nieren in vivo erklären, wie wir in einem späteren Abschnitt diskutieren werden. Nichtsdestotrotz waren die anderen Zellpopulationen in ähnlichen Mustern wie in den Nieren im Neugeborenenstadium gruppiert (Fig. 6C). Die Expressionsniveaus der meisten reifungsabhängigen Gene in Podozyten und proximalen Tubuli in den transplantierten Nieren waren vergleichbar mit denen in P0-Nieren (Abb. 6D, Abb. S6, Tabelle S2). Viele Gene in den Sammelrohren wurden jedoch auf niedrigerem Niveau exprimiert als die in P{{10}}-Nieren, einschließlich Cdkn2b (Abb. 6D, Abb. S6, Tabelle S2). Im Gegensatz dazu wurden Aqp2- und Aqp3-Expressionen relativ auf vergleichbaren Niveaus wie in P0-Nieren gehalten (Fig. 6D). Darüber hinaus blieben Wnt9b und Hoxd3, die in vivo bei P0 herunterreguliert waren, in den transplantierten Nieren hoch (Abb. S4A). Daher waren die Sammelrohre in den transplantierten Nieren wahrscheinlich unreifer als die Nieren at P0. Eine ähnliche Tendenz, wenn auch in geringerem Ausmaß, wurde bei LOH beobachtet (Abb. 6D, Abb. S6). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Reifung nicht notwendigerweise über alle Zelllinien hinweg synchron erfolgt.
DiskussionDie Organreifung ist einer der wichtigsten Aspekte in der Entwicklungs-Mentalbiologie. In der Stammzellbiologie wird die Transplantation häufig verwendet, um die Reifung pluripotenter, von Stammzellen abgeleiteter Organoide zu induzieren, einschließlichNiereOrganoide. Eine genaue Bestimmung der Reifungsstadien ist jedoch schwierig, da molekulare Koordinaten für die Reifung fehlen. Daher führten wir eine scRNA-seq-Analyse von Mausembryonen durchNierenin verschiedenen Entwicklungsstadien, was die Identifizierung von Genen ermöglichte, die eine stadienabhängige Expression in reifenden Embryonen zeigtenNieren. Indem wir diese Informationen auf scRNA-seq-Daten in transplantierten embryonalen Nieren anwandten, stellten wir ferner fest, dass der Reifungsprozess nach der Transplantation nahe am Neugeborenenstadium, aber nicht synchron über die Zelllinien hinweg verlief. Im Gegensatz zur Massensequenzierung war scRNA-seq in der Lage, die Genexpression in den reifsten Fraktionen jeder Zelllinie zu beurteilen, wodurch präzise Vergleiche mit den entsprechenden Subpopulationen sowohl in sich entwickelnden als auch in transplantierten Nieren ermöglicht wurdenNieres. Die selektierten Genlisten für stadienabhängige Expressionen erwiesen sich als molekulare Koordinaten zur Bewertung der Reifungsstadien einzelner Linien. Das Hinzufügen von scRNA-seq-Daten in postnatalen Nieren in verschiedenen Stadien und in erwachsenen Nieren würde weitere nützliche Ressourcen für die Reifungsbewertung schaffen.
Um festzustellen, ob mit den bereits vorhandenen Datensätzen ähnliche Ergebnisse erzielt werden können, haben wir die veröffentlichten scRNA-seq-Daten in E14.5 und P1 erneut analysiertNieren(Adam et al., 2017a; Magella et al., 2017). UMAP-Plots zeigten jedoch, dass die Cluster, die die reifen Populationen der meisten Zelltypen bei P1 darstellten, in den E14.5-Daten fehlten (Abb. S7A und B), was uns daran hinderte, die Genexpression in den zu vergleichen
entsprechende Cluster zwischen den beiden Stufen. Die einzige Ausnahme waren Harnleiterknospenspitzen. Ret þ -Cluster wurden in beiden Stadien nachgewiesen, und Lcn2 wurde bei P1 hochreguliert (Abb. S7C), was mit unseren Ergebnissen übereinstimmt. Daher waren die bereits vorhandenen Daten von begrenztem Nutzen, was die Bedeutung der scRNA-seq-Daten und Genlisten in der vorliegenden Studie unterstreicht. Wir haben gezeigt, dass Podozyten und proximale Tubuli in den transplantiertenNierennahe dem Neugeborenenstadium ausgereift, während die Sammelrohre relativ unreif blieben. Die zugrunde liegenden Gründe für die Ausreifungsbeeinträchtigung der Sammelrohre müssen noch aufgeklärt werden. Ein möglicher Grund kann eine Verringerung der durch den Harnfluss hervorgerufenen körperlichen Kraft sein, da die Sammelrohre im Harntrakt am weitesten stromabwärts liegen. Wir haben Embryonen transplantiertNierenmit der Kloake, mit dem Ziel einer besseren Harnflusserhaltung im Vergleich zur konventionellen Transplantation isolierter Nieren (Abb. S5). Es bleibt jedoch möglich, dass der Harnfluss nicht ausreichte, um die Reifung des unteren Teils der Nephronsegmente zu fördern. Alternativ können die Sammelrohre bereits durch Rückfluss aus der Blase mechanisch beschädigt worden sein, obwohl zum Zeitpunkt der Analyse kein offensichtlicher Hydroureter oder keine Hydroephrose beobachtet wurde. Die anschließende Verbindung der vom Spender stammenden Blase mit dem Harnleiter des Wirts erfolgte
Abb. 6. Reifung von transplantiertenNierenin der Nähe des Neugeborenenstadiums. (A) Gesamtansicht eines E12.5Nieremit der Kloake vor der Transplantation (Tag 0). Ganzaufnahmeansicht und histologische Analyse mit Hämatoxylin- und Eosin-Färbung der transplantierten Niere, wobei die Blase am Tag 12 nach der Transplantation entnommen wurde. Roter Pfeil: Vorhandensein von Urin in der Blase. Maßstabsleiste: 500 μm. (B) Immunfärbung derNieream Tag 12 nach der Transplantation mit Markern für proximale Tubuli (LTL: grün), Henle-Schleifen (SLC12A1: rot) und Sammelrohre (KRT8: grau). Maßstabsbalken: 200 μm. (C) UMAP-Plots von embryonalen Nieren in vivo (E15.5 und P0) und transplantierten embryonalen Nieren (Tag 12 nach der Transplantation). Pfeil: Nephron-Vorläufer (NP); Pfeilspitze: Harnleiterknospenspitze (UB). POD: Podozyt; PEC: glomeruläre Belegepithelzelle; DN: differenzierendes Nephron; PT: proximaler Tubulus; LOH: Henle-Schleife; DT: distaler Tubulus; CD: Sammelrohr; CD-IC: Zwischenzelle des Sammelrohres; IC; interstitielle Zelle; EC: Endothelzelle; UT: Harnleiter; BC: Blutkörperchen. (D) Violindiagramme von stadienabhängigen Genen in transplantiertenNierenverglichen mit embryonalen Nieren in vivo (E15.5 und P0).
berichteten, Hydronephrose zu hemmen und die Weiterentwicklung zu unterstützen (Yokote et al., 2015), daher wäre es aufschlussreich, die Expression unserer Reifungsmarkergene in solchen Transplantaten zu analysieren. Obwohl weitere Studien erforderlich sind, haben sich unsere Genlisten als nützlich für die Bewertung des Reifungsstatus einzelner Linien in der Entwicklung erwiesenNierensowie in transplantiertNieren. Unsere RNA-seq-Daten dienen auch als nützliche Koordinaten zur Beurteilung des Reifungsstatus vonNiereOrganoide aus pluripotenten Stammzellen. Die aktuellen Nieren-Organoide stellen diejenigen im Embryonalstadium dar (Taguchi und Nishinakamura, 2017; Takasato et al., 2015; Wu et al., 2018), und eine weitere Reifung ist für die Krankheitsmodellierung und schließlich für die Erzeugung transplantierbarer Nieren erforderlich. Derzeit stehen außer morphologischen Analysen nur wenige Methoden zur Verfügung, um die Reifungsstadien von Organoiden zu messen. Somit dienen unsere Ergebnisse als Grundlage für den molekularen Nachweis der Reifung von Organoiden. Während die konventionelleNiereOrganoide bestehen hauptsächlich aus Nephronen (Glomeruli uNieren-Tubuli) berichteten wir kürzlich über die Entstehung von Nierenstrukturen höherer Ordnung, die aus verzweigten Harnleiterknospen mit Nephronen bestehen, die um die Spitzen der Harnleiterknospen herum verteilt sind (Taguchi und Nishinakamura, 2017). Wir erreichten dies durch die Kombination von Maus-ESC-abgeleiteten Nephron-Vorläufern und Ureterknospen mit embryonalen Stroma-Vorläufern, und es sollte theoretisch möglich sein, in naher Zukunft organotypische zu erzeugenNiereStrukturen ausschließlich von Maus-ESCs und schließlich von menschlichen iPSCs. Daher wäre der nächste Schritt die Transplantation von Organoiden zur weiteren Reifung. Unsere scRNA-seq-Daten dienen als nützliche Referenzwerkzeuge zur Beurteilung der Reifungsstadien der transplantierten Organoide.
Die Erschöpfung der nephrogenen Nische bei den TransplantiertenNierenwar unerwartet. Obwohl dies nicht der Hauptbereich der vorliegenden Studie ist, die sich auf die Reifung konzentriert, kann diese Erschöpfung die geringere Größe transplantierter Nieren im Vergleich zu Nieren in vivo erklären. Nephron-Vorläufer in Mäusen führen bis mehrere Tage nach der Geburt zu naszierenden Nephronen (Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky
et al., 2018) und ein vorzeitiger Abbau von Nephron-Vorläufern führt zu kleineren Nieren (Kanda et al., 2014; Self et al., 2006). Es bleibt zu klären, welche Erhaltungsfaktoren bei Transplantaten fehlenNierenund ob der Verlust von Nephron-Vorläufern oder Harnleiterknospenspitzen die Hauptursache für dieses Phänomen ist. Die Lösung dieser Rätsel wird schließlich zum Wachstum von Transplantierten führenNiereOrganoide zu a
vergleichbare Größe zuNierenin vivo. Zusammengenommen haben wir gezeigt, dass unsere scRNA-seq-Daten und Genlisten als molekulare Grundlagen zur Beurteilung der Reifungsstadien von embryonalen und transplantierten Nieren dienen können und auf aus iPSCs gewonnene Nierenorganoide anwendbar wären. Obwohl wir uns in der vorliegenden Studie auf die Entwicklung und Reifung von Nephronen konzentriert haben, werden detaillierte Analysen anderer Abstammungslinien wie Stroma- und Endothelzellen unter Verwendung unserer scRNA-seq-Daten weitere Einblicke in diese liefernNiereReifung.
Materialen und Methoden
scRNA-seq-AnalysenDie Nieren wurden durch ein Protokoll dissoziiert, das von einem zuvor beschriebenen Verfahren (Tanigawa et al., 2016) modifiziert wurde, und für scRNA-seq-Analysen verwendet. C57BL/6N-Mäuse (CLEA Japan Inc.) wurden für E15.5- und E17.5-Analysen verwendet, und Foxd1GFPCreER; tdTomato und Tbx18MerCreMer: tdTomato-Mäuse mit einem gemischten genetischen Hintergrund von C57BL/6N und ICR wurden für P0-Analysen verwendet (Grisanti et al., 2013; Kobayashi et al., 2014). SechsNierenbei E15,5 wurden für 10 min in 0,25 Prozent Trypsin/EDTA verdaut. E17.5 und P0 weiblichNieren were minced roughly with forceps, digested with dissociation buffer comprising 2 mg/ml collagenase (Sigma; Cat# 9407), 2.4 U/ml dispase (Gibco; Cat# 17105-041), 2 mM CaCl 2 (Wako; Cat# 031–00435), 50 μ g/ml DNase I (Sigma; Cat# 11284932001), and 10% fetal calf serum (FCS) (Sigma; Cat# 172012) in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Sigma; Cat# D5796) for 15 min at 37? C, washed with phosphate-buffered saline (PBS), and treated with 0.25% trypsin/EDTA for 10 min. Trypsin was inactivated by addition of DMEM/10%FCS containing50 μ g/mlDNaseI,andthecells werewashed with HEPES-buffered saline solution (Thermo; Cat# 14185-052) containing 2% FCS, 50 μ g/ml DNase I, 1 mM CaCl 2 , and 0.035% NaHCO 3 (Wako; Cat# 191–01305). Cells were resuspended in 0.04% BSA/PBS, filtered through a 40- μ m-pore strainer (Falcon; Cat# 352340), and evaluated for their cell number and viability (>9 0 Prozent ) unter Verwendung eines automatisierten Countess-Zellenzählers (Thermo; Kat.-Nr. C10227). Insgesamt 5000 dissoziierte Zellen von E15.5 und E17.5 und zwei Proben (5000 Zellen pro Probe) von P0 wurden auf Chromium Controller (10x Genomics) aufgebracht. . Ein Chromium Single Cell 3 0 Library & Gel Beads Kit v2 (10x Genomics) wurde verwendet, um Oligo-dT-geprimte cDNA-Bibliotheken zu erstellen, die dann mit einem Illumina HiSeq 3000 sequenziert wurden (14.000 Reads für E15.5; 7000 Reads für E17.5; 14.000 Lesevorgänge für P0). Die Q30-Basis-RNA-Lesewerte (Q-Scores, die die Sequenzierungsqualität angeben) der Proben betrugen 86,2 Prozent für E15.5, 63,8 Prozent für E17.5 und 93,6 Prozent für P0.
Die Rohsequenzdaten wurden unter Verwendung des Cell-Ranger-Zählbefehls von Cell Ranger (Version 3.0.2; 10x Genomics) verarbeitet, um Zähltabellen von eindeutigen molekularen Identifikatoren (UMIs) für jedes Gen zu generieren pro Zelle. Zuerst haben wir die beiden P0-Proben mit dem Cell-Ranger-Aggr-Befehl von Cell Ranger integriert, um eine einzelne kombinierte P0-Probe zu generieren. Zu diesem Zeitpunkt erhielten wir 4.158, 5.551 und 10.810 Zellen für die E15.5-, E17.5- und P0-Proben mit mittleren Reads von 4.493, 2.360 bzw. 2467 Genen pro Zelle. Diese drei individuell generierten Datensätze wurden mit dem Cell-Ranger-Aggr-Befehl integriert. Alle nachfolgenden Analysen wurden in der statistischen Programmiersprache R durchgeführt (R Core Team, 2018). Das Seurat-Paket (Version 3.1.1) wurde für Analysen einschließlich Qualitätskontrolle, Datennormalisierung, Datenskalierung und Visualisierung verwendet (Butler et al., 2018) (Stuart et al., 2019a). Zur Qualitätskontrolle exprimierte Zellen<200 genes,="">8000 genes (possibly representing doublets), or >20 Prozent der mitochondrialen Gene wurden herausgefiltert. Der endgültige Datensatz enthielt 20.672 Gene und 3.441, 4.592 bzw. 8.161 Zellen in den E15.5-, E17.5- bzw. P0-Proben (insgesamt: 16.194 Zellen). Zur Dimensionsreduktion wurde eine Hauptkomponentenanalyse mit einem Dimensionswert von 74 verwendet, der durch die JackStrawPlot-Funktion bestimmt wurde (Chung und Storey, 2015). Die Top 2000 hochgradig variablen Gene wurden von der FindVariableFeatures-Funktion ausgewählt und zusammen mit Dimensionsinformationen für das Clustering verwendet. Die Clustersegmentierung wurde mit einem Auflösungswert von 2,4 durchgeführt. Der FindClusters-Befehl generierte insgesamt 45 Cluster, die mit clusterspezifischen Markergenen, die mit der FindMarkers-Funktion des Seurat-Pakets erhalten wurden, leicht unterschieden werden konnten relativ geringe Anzahl an Features. UMAP-Plots (Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction) wurden mit dem uwot-Paket generiert (Becht et al., 2019). Die erhaltenen UMAP-Koordinaten, Seurat-Cluster-Koordinaten und clusterspezifischen Marker wurden als CSV-Dateien zur Bestätigungsanalyse mit der Loupe Cell Browser-Software (10x Genomics) exportiert. Die scRNA-seq-Daten wurden beim National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus (GSE149134) hinterlegt.
Auswahl von entwicklungsstadienabhängigen Genkandidaten
Um entwicklungsstadienabhängige Genkandidaten in jedem Cluster auszuwählen, verwendeten wir die FindMarkers-Funktion, um Gene aufzugreifen, die bei P0 im Vergleich zu E15.5 hochreguliert waren (z. B. Vergleich zwischen Cluster
8 at P0 and cluster 8 at E15.5 for podocytes). Subsequently, we utilized the AverageExpression function to add the average gene expression data for each cluster at each stage for stage-dependent comparisons (log-fold change >1 und p-Wert<0.05). to="" determine="" segment-specific="" genes,="" we="" compared="" the="" target="" cluster="" with="" all="" other="" clusters="" at="" p0="" and="" selected="" the="" genes="" with="" low="" p-values="" (p="" <="" 0.05)="" and="" low="" expression="" rates="" in="" other="" clusters="" (pct2=""><0.11). after="" selecting="" the="" overlapping="" genes,="" we="" verified="" them="" in="" umap="" plots="" to="" finalize="" the="" lineage-specific="" stage-dependent="">
Immunhistochemische AnalyseParaffinschnitte wurden der Antigengewinnung in einem Citratpuffer unterzogen, dreimal mit PBS gewaschen und durch Inkubation mit 1 Prozent BSA in PBS für 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Die Schnitte wurden dann über Nacht mit Primärantikörpern bei 4°C inkubiert. C, gefolgt von Inkubation mit sekundären Antikörpern, die mit Alexa Fluor-Farbstoffen konjugiert sind, für 90 min bei Raumtemperatur. Kerne wurden mit 4,6-Diamidino-2-phenylindole (Roche; Kat.-Nr. 10236276001) gefärbt. Die folgenden primären Antikörper wurden verwendet: biotinylierter LTL (Vector Laboratories; B-1325), Kaninchen-Anti-SLC12A1 (StressMarq Bioscience; SPC-401D), Ratten-Anti-KRT8 (Develop-mental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa; Troma-I), Meerschweinchen-anti-NPHS1 (Progen; GP-N2); und Kaninchen-Anti-CD31 (Abcam; ab28364). Fluoreszenzbilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop LSM780 (Carl Zeiss) oder einem konfokalen Mikroskop FV3000 (Olympus) aufgenommen.
In-situ-HybridisierungDie RNAscope-Analyse von 10 % formalinfixierten Paraffinschnitten wurde unter Verwendung eines RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 (ADC; Kat.-Nr. 323100) durchgeführt. Die Signalverstärkung wurde mit TSA plus Fluorophoren (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Einzelheiten zu den RNAscope-Sonden sind in Tabelle S3 angegeben. Digoxigenin-basierte In-situ-Hybridisierung von Kap wurde wie beschrieben (Kaku et al., 2013) unter Verwendung eines automatisierten Discovery-Systems (Roche) gemäß den Protokollen des Herstellers durchgeführt. Die Kap-Sonde wurde durch PCR unter Verwendung spezifischer Primer kloniert (Tabelle S3) und mit Digoxigenin unter Verwendung einer RNA-Polymerase markiert. Zwei bis drei Proben in jedem embryonalen Stadium wurden für jede Sonde untersucht und zeigten konsistente Ergebnisse.
Transplantation embryonaler MäusenierenSchwangere weibliche C57BL/6N-Mäuse (E12.5) und erwachsene männliche Mäuse (8–12 Wochen) wurden von CLEA Japan Inc. gekauft und in einer speziellen pathogenfreien Tiereinrichtung gehalten. Erwachsene Wirtsmäuse wurden durch peritoneale Verabreichung von normaler Kochsalzlösung mit 0,75 mg/kg Medetomidin, 4,{{10}} mg/kg Midazolam und 5,0 mg anästhesiert /kg Butorphanol. Embryonale Mäusenieren mit der Kloake bei E12.5 wurden in das Nebenhodenfett von Wirtsmäusen transplantiert (Yokote et al., 2015). Nach der Operation wurde Atipamezol als Anästhesieantagonist verabreicht. Die transplantierten embryonalen Nieren wurden 12 Tage nach der Transplantation geerntet. Für die scRNA-seq-Analyse wurden die Nieren ähnlich wie die P0-Nieren dissoziiert. Alle Tierversuche wurden gemäß unseren institutionellen Richtlinien durchgeführt und von der Ethikkommission der Universität Kumamoto (#A2019-113) genehmigt.
Re-Analyse der öffentlich zugänglichen scRNA-seq-DatenDie scRNA-seq-Daten für embryonale E14.5-MäuseNiereund P1Niere(Adam et al., 2017b; Magella et al., 2017) wurden von Gene Expression Omnibus (Zugangsnummern GSE94333 bzw. GSE104396) heruntergeladen. Alle nachfolgenden Analysen dieser Daten wurden in der statistischen Programmiersprache R (R Core Team, 2018) durchgeführt, und das Seurat-Paket (Version 3.2.2) wurde für Analysen einschließlich Qualitätskontrolle, Datennormalisierung, Datenskalierung und Visualisierung wie beschrieben verwendet in Abschnitt 4.1.