Differenzielle Kontrolle menschlicher Treg- und Effektor-T-Zellen bei der Tumorimmunität durch Fc-entwickelte Anti-CTLA-4-Antikörper

Anti-CTLA-4-mAb ist wirksam bei der Stärkung der Tumorimmunität beim Menschen. CTLA-4 wird von konventionellen T-Zellen nach Aktivierung und von natürlich vorkommenden FOXP3-plus-CD4-plus-Treg-Zellen konstitutiv exprimiert, was die Frage aufwirft, wie Anti-CTLA-4-mAb diese funktionell gegensätzlichen T-Zellpopulationen differenziell kontrollieren kann Tumorimmunität. Hier zeigen wir, dass FOXP3-stark supprimierende Effektor-Treg-Zellen in Melanomgeweben reichlich vorhanden waren und CTLA-4 in höheren Konzentrationen exprimierten als tumorinfiltrierende CD8-plus-T-Zellen. Nach In-vitro-Tumorantigenstimulation peripherer mononukleärer Blutzellen von gesunden Personen oder Melanompatienten zeigten Fc-Region-modifizierte Anti-CTLA-4-mAb mit hoher Antikörper-abhängiger zellvermittelter Zytotoxizität (ADCC) und zellulärer Phagozytose (ADCP )-Aktivität reduzierte selektiv CTLA-4- plus FOXP3-plus-Treg-Zellen und expandierte folglich tumorantigenspezifische CD8-plus-T-Zellen.

Wichtig ist, dass die Expansion nur auftrat, wenn die Antigenstimulation einige Tage nach der Antikörperbehandlung verzögert wurde, um CTLA-4 plus aktiviertem Effektor CD8 plus T-Zellen vor mAb-vermittelter Abtötung zu bewahren. In ähnlicher Weise verlängerte bei Tumor-tragenden Mäusen die Anti-CTLA-4-mAb-Behandlung mit hohem ADCC/ADCP-Gehalt und verzögerter Tumorantigen-Impfung signifikant ihr Überleben und erhöhte die Zytokinproduktion durch tumorinfiltrierende CD8-plus-T-Zellen deutlich, während die Antikörperbehandlung gleichzeitig mit der Impfung nicht. Anti-CTLA4-mAb, der modifiziert wurde, um eine geringere oder keine Fc-Bindungsaktivität aufzuweisen, zeigte keine solche zeitabhängige In-vitro- und In-vivo-Immunverstärkung. Daher kann ein hoher ADCC-Anti-CTLA-4-mAb selektiv Effektor-Treg-Zellen depletieren und eine Tumorimmunität in Abhängigkeit von CTLA-4 hervorrufen, der den Status von Effektor-CD8 plus T-Zellen ausdrückt. Diese Ergebnisse sind entscheidend für die Entwicklung einer Krebsimmuntherapie mit mAbs, die auf die Moleküle abzielen, die üblicherweise von FOXP3 plus Treg-Zellen und tumorreaktiven Effektor-T-Zellen exprimiert werden.

Regulatorische T-Zellen|CTLA-4|FOXP3|Krebs-Immuntherapie|Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität.

Natürlich vorkommende CD25 plus CD4 plus Treg-Zellen, die den Transkriptionsfaktor FOXP3 exprimieren, spielen eine unverzichtbare Rolle bei der Aufrechterhaltung der immunologischen Selbsttoleranz und Homöostase (1). Sie behindern jedoch auch wirksame Immunantworten gegen körpereigene Tumorzellen, wie die Ergebnisse zeigen, dass Maustumore einfach durch Depletion von Treg-Zellen ausgerottet werden können (2–5).

Beim Menschen gibt es zunehmend Hinweise auf eine reichliche Infiltration von Treg-Zellen in verschiedene Tumorgewebe (6–8) und eine signifikante Korrelation zwischen der Treg-Infiltration und einer schlechten Prognose bei verschiedenen Krebsarten (9). Die Kontrolle von Treg-Zellen in Tumorgeweben ist daher wahrscheinlich ein vielversprechender Weg, um bei Krebspatienten eine wirksame Tumorimmunität hervorzurufen.

Bei der Antitumorwirkung haben wir herausgefunden, dass Cistanche deserticola in der Rattenforschung eine offensichtliche Antitumorwirkung hat. 3 Die Polysaccharidkomponenten in Cistanche deserticola können die Immunfunktion des Körpers verbessern, die Aktivierung weißer Blutkörperchen fördern, den Immunstatus des Körpers verbessern und können auch direkt auf Tumorzellen einwirken. Hemmen die Proliferation, Metastasierung und Invasion von Tumorzellen. Hemmt auch die Angiogenese. Tumorwachstum und Metastasierung benötigen die Unterstützung des Wachstums neuer Blutgefäße, und die Polysaccharidkomponenten in Cistanche können die Angiogenese hemmen, wodurch Tumorwachstum und Metastasierung verringert werden.

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Humane FOXP3--exprimierende CD4 plus T-Zellen sind in ihrer Funktion heterogen, einschließlich Treg-Zellen und nicht supprimierender herkömmlicher T-Zellen. Sie können durch ihre unterschiedlichen Expressionsniveaus von FOXP3 und CD45RA (10) (Fig. 1A) in drei Subpopulationen fraktioniert werden: (i) CD45RA plus FOXP3lo naive/ruhende Treg-Zellen [Fraktion (Fr). I]; (ii) CD45RA-FOXP3hi-Effektor-Treg (Treg)-Zellen (Fr. II), die terminal differenziert und stark unterdrückend sind; und (iii) CD45RA-FOXP3lo-Nicht-Treg-Zellen (Fr. III), denen die unterdrückende Aktivität fehlt und die in der Lage sind, proinflammatorische Zytokine zu sezernieren. Bei antigener Stimulation wird Fr. I naive Treg-Zellen differenzieren in Fr. II Treg-Zellen, die CTLA-4 stark exprimieren (10).

Abb. 1. Bevorzugte CTLA-4-Expression durch FOXP3hi-Treg-Zellen in Melanomgewebe. (A und B) Repräsentative Plots von CD4 plus T-Zell-Färbung (A) und Frequenzen jeder Fraktion (B). PBMCs von gesunden Spendern (HD, n=5) und PBMCs und TILs von Melanompatienten (n=11 bzw. 14) wurden einer direkten Färbung für CD4, CD45RA und FOXP3 unterzogen. (C und D) Repräsentative Diagramme der CCR7- und CD45RA-Expression durch CD8 plus T-Zellen (C) und Zusammenfassung jeder CD8 plus T-Zell-Untergruppe (D). (E) CTLA-4-exprimierende Cluster (gepunktete Linie) in PBMCs und TILs von Melanompatienten durch CyTOF-Analyse. viSNE-Diagramme von CD4-plus- und CD8-plus-T-Zellen mit Heatmaps für die angegebenen Markerexpressionsniveaus werden gezeigt (n=2). (F) Nur Oberflächen- oder Oberflächen- und intrazelluläre Färbung von CTLA-4 in HD-PBMC. (G) Oberflächen-CTLA-4-Expressionen durch jede Zellfraktion von TILs und PBMCs von Melanompatienten. Mittel ± SEM. *P Kleiner als oder gleich {{20}}.05, **P Kleiner als oder gleich 0.01, ***P Kleiner als oder gleich 0,001 und ****P kleiner oder gleich 0,0001 durch einfache ANOVA mit Post-Hoc-Tukey-HSD-Test.

Obwohl die meisten Zellen in Fr. III sind Nicht-Treg-Zellen und differenzieren nicht in Fr. II eTreg-Zellen, eine zirkulierende Untergruppe von regulatorischen T-Follikelzellen, bei denen es sich um CXCR5 plus CD45RA− handelt, ist in Fr. III (11), was auf die Heterogenität der Fr. hinweist. III-Bevölkerung. Im Gegensatz dazu zeigt die Mehrheit der Tumore mit dem Vorhandensein dieser drei FOXP3 plus Populationen im Blut eine vorherrschende Infiltration von Treg-Zellen, die anscheinend wirksame Antitumor-Immunantworten bei Krebspatienten unterdrücken (12). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Depletion/Reduktion von Treg-Zellen in Tumoren und regionalen Lymphknoten maßgeblich an der Hervorrufung und Verstärkung von Antitumor-Immunantworten beteiligt ist, wie kürzlich mit einigen monoklonalen Antikörpern (mAbs) gezeigt wurde, die spezifisch für die Moleküle sind, die spezifisch von Treg-Zellen exprimiert werden (13).

CTLA-4 wird von konventionellen T-Zellen nach Aktivierung und konstitutiv von FOXP3 plus CD25 plus CD4 plus Treg-Zellen exprimiert. Es spielt eine Schlüsselrolle bei der Treg-vermittelten Suppression, zumindest teilweise über die Kontrolle der CD80/CD86-Expression durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) (14–16). Anti-Human-CTLA-4-mAb, der bei der Behandlung von Melanomen klinisch wirksam ist (17, 18), wurde ursprünglich als Blocker des CTLA-4-vermittelten negativen Signals in aktivierte Effektor-T-Zellen angesehen, wodurch deren aktivierter Zustand aufrechterhalten wird Tumorzellen angreifen. Neuere präklinische Studien haben jedoch gezeigt, dass Anti-CTLA-4-mAb FOXP3 plus Treg-Zellen, insbesondere in Tumorgeweben, abbauen und dadurch die Tumorimmunität stärken kann (19–21). Beim Menschen ist jedoch umstritten, ob CTLA-4-mAb die Anzahl oder die Funktion von Treg-Zellen oder Effektor-T-Zellen oder beides bei der Verstärkung von Antitumor-Immunantworten in klinischen Kontexten beeinflusst.

In dieser Studie haben wir in vivo und in vitro bei Menschen und Mäusen die Wirkungen von Fc-manipulierten Anti-CTLA-4-mAbs auf FOXP3-plus-Treg-Zellen und Selbst-/Tumorantigen-spezifische CD8-plus-T-Zellen untersucht. Wir zeigen, dass zelldepletierende Anti-CTLA-4-mAb mit hoher antikörperabhängiger zellvermittelter Zytotoxizität (ADCC)-Aktivität Antitumor-Immunantworten hervorrufen können, abhängig von den Niveaus und der Kinetik der CTLA-4-Expression durch die zwei Populationen. Die Ergebnisse können auf zelldepletierende mAbs ausgedehnt werden, die auf andere Zelloberflächenmoleküle abzielen, die sowohl Treg- als auch Effektor-T (Teff)-Zellen üblicherweise in unterschiedlichen Mengen und mit unterschiedlicher Kinetik exprimieren.

Bedeutung

Anti-CTLA-4-mAb kann die Tumorimmunität trotz CTLA-4-Expression durch funktionell gegensätzliche T-Zellpopulationen verstärken: aktivierte Effektor-T-Zellen (Teff) und FOXP3 plus CD4 plus Treg-Zellen. Hier zeigen wir, dass Anti-CTLA-4-mAb, der so konstruiert wurde, dass er zytotoxisch depletierte Treg-Zellen wirksam in vitro beim Menschen und in vivo bei Mäusen beseitigt. Es vermehrte antigenspezifische CD8 plus Teff-Zellen, wenn die Tumorantigenstimulation um mehrere Tage verzögert wurde, um sie vor dem Abtöten durch den mAb zu schützen. Anti-CTLA-4-mAb, der modifiziert wurde, um eine geringere oder keine zellabbauende Aktivität zu zeigen, zeigte keine solchen Wirkungen. Diese Strategie der unterschiedlichen Kontrolle von Treg- und Teff-Zellen durch zytotoxische Anti-CTLA-4-mAb zur Hervorrufung einer wirksamen Tumorimmunität wird bei der Entwicklung einer Krebsimmuntherapie helfen, die auf andere Moleküle abzielt, die häufig von Treg- und Teff-Zellen exprimiert werden.

Autorenbeiträge: DH, A. Tanaka, HN und SS konzipierte Forschung; DH, A. Tanaka, TK, A. Tanemura, DS, JBW, ELL, KWWT, DA und IK forschten; A. Tanemura steuerte neue Reagenzien/Analysewerkzeuge bei; DH, A. Tanaka, TK, DS, DA, EWN, IK, HN und SS analysierten Daten; und DH, A. Tanaka und SS schrieben das Papier.

Gutachter: MA, Tokyo Medical and Dental University; und SAQ, University College London.

Interessenkonflikt: HN erhielt ein Forschungsstipendium von Bristol Myers Squibb. SS erhielt ein Forschungsstipendium von Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. TK ist bei Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. angestellt, die einige der in dieser Studie verwendeten Antikörper lieferte.

Veröffentlicht unter der PNAS-Lizenz.

1 Derzeitige Adresse: Department of Immunology, Graduate School of Medicine, Nagoya University, 466-8550 Nagoya, Japan.

2 Aktuelle Adresse: Department of Immunology, Moffitt Cancer Center, Tampa, FL 33612.

3 Derzeitige Adresse: Division of Cancer Immunology, Exploratory Oncology Research & Clinical Trial Center, National Cancer Center, 277-8577 Kashiwa, Japan.

4 An wen ist die Korrespondenz zu richten. E-Mail: shimon@ifrec.osaka-u.ac.jp.

Online veröffentlicht am 26. Dezember 2018.

Ergebnisse

Akkumulation von CTLA-4-exprimierenden, terminal differenzierten FOXP3hi-Treg-Zellen in Melanomgeweben.

Wir untersuchten zunächst die Häufigkeit verschiedener T-Zell-Subpopulationen unter tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) bei Melanompatienten. CD45RA-FOXP3hi-eTreg-Zellen (Fr. II) waren überwiegend (∼10--fach) im Verhältnis zwischen CD4-plus-TILs erhöht, verglichen mit peripheren Blut-CD4-plus-T-Zellen bei gesunden Spendern oder Melanompatienten (Abb. 1 A und B ). Die Frequenz von CD45RA− FOXP3lo Fr. III-Nicht-Treg-Zellen nahmen unter CD4 plus TILs ebenfalls leicht zu (etwa zweifach). Im Gegensatz dazu waren CD45RA plus FOXP3lo-naive Treg-Zellen (Fr. I) in TILs signifikant auf durchschnittlich ein Viertel der entsprechenden Fraktion in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) reduziert.

Unter FOXP3− konventionelle CD4 plus T-Zellen in TILs, CD45RA − FOXP3− Effektor-/Gedächtnis-CD4 plus T-Zellen, die weiter in die CD25 plus (Fr. IV) und die CD25− (Fr. V) Populationen zerlegt werden könnten (10) , leicht (∼1,3--fach) erhöht, während CD45RA plus FOXP3− naive CD4 plus T-Zellen (Fr. VI) signifikant auf ein Zehntel von denen in PBMCs reduziert wurden. In der CD8 plus T-Zell-Fraktion von TILs gab es im Vergleich zu PBMCs der Patienten oder gesunden Spender eine signifikante Zunahme (∼1,6--fach) von CD45RA− CCR7− Effektor-Gedächtnis-T (TEM)-Zellen, mit einer signifikanten Abnahme von CD45RA plus CCR7 plus naiven und CD45RA plus CCR7 – terminal differenzierten Effektorgedächtnis (TEMRA)-Zellen auf die Hälfte bzw. ein Fünftel derjenigen in PBMCs und keine signifikante Veränderung von CD45RA – CCR7 plus zentrales Gedächtnis T (TCM)-Zellen (Abb. 1 C und D). Bei Melanompatienten wurde auch festgestellt, dass naive CD8 plus T-Zellen in PBMCs deutlich (∼14--fach) im Vergleich zu gesunden Spendern abnahmen.

Anschließend untersuchten wir, welche T-Zellpopulation CTLA-4 in TILs oder PBMCs von Melanompatienten durch Zytometrie mit einem Time-of-Flight (CyTOF)-Massenspektrometrie-Zytometer exprimierte (Abb. 1E und SI-Anhang, Abb. S1A). Der Zellcluster CD4 plus CD45RA – Foxp3hi, der Fr darstellt. II eTreg-Zellen exprimierten überwiegend CTLA4 in PBMC und TIL, während CD8 plus T-Zellen kaum CTLA-4 in PBMC oder TIL exprimierten. Bei Mäusen wurde in ähnlicher Weise eine vorherrschende CTLA4-Expression durch FOXP3 plus Treg-Zellen in der Milz und im CMS5a-Tumorgewebe beobachtet (SI-Anhang, Abb. S1B). CTLA4, exprimiert von menschlichem Fr. II Treg-Zellen befanden sich hauptsächlich im intrazellulären Kompartiment und Zelloberflächen-CTLA-4 war begrenzt (Abb. 1F). Dennoch sind in TILs, Treg-Zellen und in geringerem Maße Fr. III Nicht-Treg-Zellen exprimierten Oberflächen-CTLA-4 in signifikant hohen Konzentrationen (Abb. 1G und SI-Anhang, Abb. S2). TIL-CD8 plus TCM- und TEM-Zellen exprimierten im Vergleich zu allen zirkulierenden T-Zellfraktionen auch ein höheres Maß an Oberflächen-CTLA-4, obwohl Treg-Zellen eine viel höhere Expression bei Melanompatienten zeigten (Abb. 1G und SI Anhang, Abb. S2).

Zusammengenommen sind Kardinalmerkmale menschlicher Melanomgewebe eine deutliche Zunahme und Abnahme von Treg-Zellen bzw. naiven Treg-Zellen und eine deutliche Zunahme von Effektor-/Gedächtnis-CD8-plus-T-Zellen bei einer Verringerung von naiven CD8-plus-T-Zellen. Diese Treg-Zellen und CD8 plus T-Zellen in TILs exprimieren CTLA-4 auf der Zelloberfläche, wobei erstere stärker exprimiert werden als letztere. Im Gegensatz zu TIL-eTreg-Zellen weisen zirkulierende eTreg-Zellen bei Melanompatienten eine signifikant niedrigere CTLA4-Oberflächenexpression auf, was darauf hindeutet, dass sie möglicherweise weniger von einer Anti-CTLA-4-mAb-Behandlung betroffen sind.

Reduktion sowohl von Treg-Zellen als auch von Antigen-spezifischen CD8 plus T-Zellen durch In-vitro-Behandlung mit zelldepletierendem Anti-CTLA-4-mAb und gleichzeitiger Antigenstimulation.

Um zu untersuchen, ob die Antitumorwirkung von Anti-CTLA-4-mAb auf seiner Fähigkeit beruht, Treg-Zellen durch ADCC zu depletieren, modifizierten wir den Fc-Teil von Anti-CTLA-4-IgG1-mAb (Klon MDX{{3 }}, Ipilimumab), das eine moderate ADCC-Aktivität besaß, um seine Affinität für Fc RIIIa (CD16a), einen aktivierenden Fc R, der von NK-Zellen, Monozyten/Makrophagen und anderen Zellen exprimiert wird, zu ändern (22) (Abb. 2A). Ein so erzeugter Anti-CTLA-4-mAb mit einer hohen ADCC-Aktivität, den wir asymmetrische Reengineering-Technologie-Fc-Domäne (ART-Fc) nannten, besaß unterschiedliche Aminosäuresubstitutionen an jeder schweren Kette (23); das heißt, L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A-Substitutionen in eine Schwerketten-Fc-Region und D270E/K326D/A330M/K334E-Substitutionen in die andere. Der rekonstruierte mAb zeigte eine 1,000--fach höhere Bindungsaffinität für menschliches Fc RIIIa als unmodifizierter mAb, ohne die Affinität für das inhibitorische Fc RIIb zu erhöhen. Wir erzeugten auch einen anti-CTLA-4-mAb, der kaum an Fc Rs bindet, den wir Silent-Fc-anti-CTLA-4 nannten, durch Aminosäuresubstitutionen; das heißt, L235R, G236R und S239K in die Fc-Region beider schwerer Ketten. Verglichen mit unmodifiziertem oder stillem Fc-Anti-CTLA-4-mAb zeigte ART-Fc in Gegenwart von PBMCs von gesunden Spendern eine viel höhere In-vitro-Zytotoxizität gegenüber CTLA-4–-exprimierenden Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO). , mit erhöhter Zytotoxizität durch längere Inkubation (Fig. 2B). In ähnlicher Weise tötete der ART-Fc-Anti-CTLA-4-mAb frisch zubereitetes Fr. II Treg-Zellen und in geringerem Maße Fr. III Nicht-Treg oder Fr. I naive Treg-Zellen, während IgG1 (Ipilimumab) oder Silent-Fc-mAb kaum Tötungsaktivität zeigten (Fig. 2C).

Als nächstes untersuchten wir die Auswirkungen dieser Fc-manipulierten mAbs auf die antigenspezifische in-vitro-Expansion von CD8 plus T-Zellen, indem wir PBMCs von HLA-A*0201-exprimierenden gesunden Spendern oder Melanompatienten für 9 Tage mit verschiedenen Peptiden stimulierten, zum Beispiel: abgeleitet von Melan-A/MART-1, einem Selbst-/Tumorantigen, das von normalen Melanozyten und einigen Melanomzellen exprimiert wird (24); und NY-ESO-1, Krebs-/Hodenantigen, das von verschiedenen Arten von Krebszellen und menschlichen Keimbahnzellen (25), Cytomegalovirus (CMV) oder Influenzavirus (Grippevirus) exprimiert wird. Diese In-vitro-Peptidstimulation, beispielsweise durch Melan-A-Peptid, hielt die hohe Expression von CTLA4 durch Treg-Zellen aufrecht (Abb. 2D und SI-Anhang, Abb. S3). Die Peptidstimulation allein expandierte auch Peptid-spezifisches Tetramer (Tet) plus CD8 plus T-Zellen, die im Vergleich zu Tet-Zellen höhere CTLA-4-Spiegel exprimierten, insbesondere auf der Zelloberfläche (Abb. 2 E, F, und ich). Wenn ART-Fc-anti-CTLA-4-mAb von Beginn der Peptidstimulation von PBMCs von gesunden Spendern oder Melanompatienten an vorhanden war, war das Verhältnis von CTLA-4-exprimierenden Treg-Zellen zu CD4-plus-T-Zellen gleich dosisabhängig signifikant reduziert, während Silent-Fc-mAb diesen Effekt nicht zeigte (Abb. 2 D und G und SI-Anhang, Abb. S4 und S5).

Die Reduktion der Treg-Zellen ging jedoch nicht mit der Expansion antigenspezifischer CD8-plus-T-Zellen einher; vielmehr verursachte die Behandlung eine deutliche Verringerung des Verhältnisses von Tet plus CD8 plus T-Zellen zu CD8 plus T-Zellen (Fig. 2H). Bei diesen In-vitro-Stimulationen zeigten unmodifiziertes IgG1 oder Silent-Fc-Anti-CTLA-4-mAb keine signifikante eTreg-depletierende Aktivität (Abb. 2I). Der Grad der eTreg-Zellreduktion durch diese mAbs korrelierte tatsächlich mit der Reduktion antigenspezifischer CD8-plus-T-Zellen, unabhängig vom stimulierenden Antigen, beispielsweise Melan-A oder CMV-Peptid (Abb. 2I).

Während also Treg-Zellen konstitutiv CTLA-4 exprimieren, insbesondere intrazelluläres CTLA-4, expandiert die Antigenstimulation CD8 plus T-Zellen, die große Mengen an CTLA-4 exprimieren, insbesondere auf der Zelloberfläche. ART-Fc anti-CTLA-4 mAb mit hoher ADCC-Aktivität ist daher in der Lage, nicht nur CTLA-4 plus Treg-Zellen, sondern auch Antigen-aktivierte CTLA-4 plus CD8 plus T-Zellen zu depletieren . Dieser Effektor CD8 plus T-Zell-Depletion kann einen immunverstärkenden Effekt der eTreg-Zelldepletion bei Immunantworten in vitro ausgleichen.

Abb. 2. Gleichzeitige In-vitro-Peptidstimulation mit ART-Fc-Anti-CTLA-4-mAb schränkt antigenspezifische CD8-plus-T-Zell-Antworten ein. (A) Zusammenfassung der Aminosäuresubstitutionen, die am Fc-Teil des Anti-Human-CTLA-4-IgG1-mAb (Klon MDX-010, Ipilimumab) vorgenommen wurden, um ART-Fc- oder Silent-Fc-mAb zu erzeugen, und ihre Affinitäten zu inhibitorischem Fc RIIb oder aktivierendem Fc RIIIa. Die Silent-Fc-mAb-Affinität lag unter der Nachweisgrenze des BIACORE-Assays. (B) ADCC-Aktivität verschiedener Anti-CTLA4-mAbs gegen humane CTLA-4-exprimierende CHO-Zellen. Anti-CTLA-4-mAbs (ART, ADCC-verstärktes Anti-CTLA-4-ART-Fc; IgG1, konventionelles unmodifiziertes Anti-CTLA-4-IgG1; Silent, Fc-Region-inaktiviertes Anti- CTLA-4 Silent-Fc) wurden mit CHO-Zellen und HD PBMCs (n=3) bei einem E/T-Verhältnis von 50:1 inkubiert. Mittel ± SEM. Sternchen weisen auf signifikante Unterschiede zwischen jedem Antikörper und stillem Fc bei den jeweiligen Konzentrationen für {{30}}-h- (schwarz) oder 24--h- (rot) Kulturen hin. (C) ADCC-Aktivität für jede Zellfraktion von CD4-Plus- und CD8-Plus-T-Zellen aus PBMCs durch ART-Fc, IgG1 oder Silent-Fc-Anti-CTLA-4-mAbs (n=4 oder 5). Die Häufigkeit toter Zellen unter CTV-vormarkierten Zellen nach der {{40}}-stündigen Kultur ist angegeben. (D) CTLA-4-Ausdruck von Fr. II Treg-Zellen nach 9 Tagen Melan-A-Peptid-Stimulation und 1 ug/ml ART-Fc-, Silent-Fc- oder IgG1-Anti-CTLA-4-mAb-Behandlung für ganze PBMCs (n {{50 }}). (E und F) Oberflächen-CTLA-4-Expressionen durch Tet-plus- und Tet-CD8-plus-T-Zellen nach angegebenen Peptidstimulationen. Repräsentative Histogramme (E) und Zusammenfassung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) (F) (Melan-A, n=9; CMV, n=9; Grippe, n=3; ESO{{ 57}}, n=4). (G und H) Repräsentative Diagramme und Häufigkeiten von Fr. II eTreg-Zellen (G) und antigenspezifische CD8 plus T-Zellen (H) von HDs (n=6) oder Melanompatienten (n=5) nach der Kultur mit dem angegebenen Peptid und 1 ug/ml ART -Fc anti-CTLA-4 mAb wie in D. (I) Quantifizierung der Häufigkeit von Treg-Zellen (oben) und Tet plus CD8 plus T-Zellen (unten) nach 9 d Melan-A- oder CMV-Antigenstimulation zu HD-PBMCs mit angezeigten Anti-CTLA-4-mAbs in G und H. Mittelwerte ± SEM. Die dargestellte Signifikanz zwischen den beiden Gruppen wurde unter Verwendung des gepaarten t-Tests, der einfachen ANOVA oder der zweifachen ANOVA mit Post-hoc-Tukey-HSD-Test berechnet. *P kleiner oder gleich 0,05, **P kleiner oder gleich 0,01, ***P kleiner oder gleich 0,001 und ****P kleiner oder gleich 0,0001.

Robuste Expansion antigenspezifischer CD8 plus T-Zellen durch eTreg-Zelldepletion vor der Antigenstimulation.

. Als nächstes versuchten wir, CTLA-4-plus-Treg-Zellen vor der Antigenstimulation zu depletieren, um Antigen-aktivierte CTLA-4-exprimierende CD8-plus-T-Zellen vor dem Abtöten durch Anti-CTLA-4-mAbs zu bewahren. Wir kultivierten ganze PBMCs von gesunden Spendern oder Melanompatienten in Gegenwart von ART-Fc-Anti-CTLA-4-mAb für 5 d ohne Antigenstimulation, entfernten den mAb, stimulierten dann die Zellen mit verschiedenen Peptiden für 8 d und analysierten sie auf die Verhältnis von Treg-Zellen und Tet plus CD8 plus T-Zellen zu CD4 plus T-Zellen bzw. CD8 plus T-Zellen (Fig. 3A). Das Verhältnis von FOXP3hi-Treg-Zellen wurde innerhalb von 5 Tagen durch die ART-Fc-Vorbehandlung signifikant reduziert (Abb. 3A und SI-Anhang, Abb. S6) und während der anschließenden Peptidstimulation auf einem niedrigen Niveau gehalten (Abb. 3B), was darauf hinweist, dass Treg die Zellen hatten sich während der Antigen-Stimulationsperiode nicht vollständig erholt. Diese ART-Fc-Vorbehandlung in Kombination mit Antigenstimulation induzierte eine robuste Expansion von Melan-A-spezifischen CD8-plus-T-Zellen von gesunden Spender-PBMCs und NY-ESO-1-spezifischen CD8-plus-T-Zellen von PBMCs von Patienten, deren Melanomgewebe exprimiert wurden NY-ESO-1 (Abb. 3C). CMV-spezifische CD8-plus-T-Zellen waren von der ART-Fc-vermittelten Treg-Depletion nicht stark betroffen. Im Gegensatz zu ART-Fc veränderte Silent-Fc-anti-CTLA-4-mAb nicht die Häufigkeit von Treg-Zellen und konnte Tet plus CD8 plus T-Zellen unabhängig von der Antigenspezies nicht expandieren (Fig. 3D).

Einer der verschiedenen Unterdrückungsmechanismen, die von Treg-Zellen verwendet werden, ist die CTLA-4-abhängige Herunterregulierung der CD80- und CD86-Expression durch dendritische Zellen (DCs) (14, 15). Um mögliche Beiträge dieses Mechanismus zur Expansion von Selbst-/Tumorantigen-spezifischen CD8-plus-T-Zellen nach einer In-vitro-ART-Fc-Anti-CTLA-4-mAb-Behandlung zu untersuchen, haben wir die CD80- und CD86-Expression von untersucht DCs, die phänotypisch definiert wurden als Lin-1− CD11c plus HLA-DR plus , in gesunden Spender-PBMCs. Sowohl die CD80- als auch die CD86-Expression zeigten eine deutliche Hochregulierung in der mit ART-Fc vorbehandelten Gruppe, im Gegensatz zu einer unveränderten CD80/CD86-Expression in einem unmodifizierten IgG1--vorbehandelten, stillen Fc – vorbehandelte oder unbehandelte Gruppe (Abb. 3E). Außerdem korrelierte der Grad der FcR-Bindungsaffinitäten von mAbs gut mit ihrer Treg-Depletionsaktivität und auch mit Tet plus CD8 plus T-Zell-induzierender Aktivität ( 3F ). Da die bloße Blockade von CTLA-4 durch Silent-Fc CD80/86 nicht hochregulierte, deuteten die Ergebnisse darauf hin, dass die Treg-Verarmung durch ART-Fc DCs aktivierte, obwohl die Möglichkeit besteht, dass ART-Fc selbst dies tun könnte tragen zusätzlich zur Aktivierung von DCs durch hochaffine Bindung an ihre aktivierenden Fc-Rezeptoren bei.

Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die Treg-Verarmung durch ART-Fc-Anti-CTLA-4-mAb mehrere Tage vor der Antigenexposition die Abtötung von CTLA-4-plus-Antigen-aktivierten CD8-plus-T-Zellen durch den Antikörper ersparen kann, sie zumindest teilweise erweitern, indem die CD80/CD86-Expression durch APCs verbessert wird.

Abb. 3. Die Prädepletion von Treg-Zellen unter Verwendung von ART-Fc-anti-CTLA-4-mAb verstärkt die Selbst-/Tumorantigen-spezifischen CD8-plus-T-Zell-Antworten. (A–D) Antigen-spezifische CD8-plus-T-Zellen wurden von ganzen PBMCs von HDs (n=7) oder Patienten (n=5) ​​nach 5 Tagen Vorbehandlung mit ART-Fc-Anti-CTLA induziert { {11}} mAb. (A) Schema des Experiments und repräsentative FOXP3- und CD45RA-Färbung von CD4 plus T-Zellen am Tag –5 und am Tag 0 des Experiments. Zusammenfassung von Fr. II eTreg-Frequenzen am Tag 0 (unten). (B und C) Repräsentative FOXP3-Färbung von CD4 plus T-Zellen (B) und antigenspezifischen CD8 plus T-Zellen (C) mit oder ohne ART-Fc-Vorbehandlung für jedes Peptid nach der Kultur. Zusammenfassung der Treg- und Antigen-spezifischen CD8 plus T-Zellfrequenzen nach der Kultur (unten). (D) Zusammenfassung von Fr. II eTreg und Tet plus CD8 plus T-Zell-Frequenzen mit Silent-Fc-Anti-CTLA-4-mAb-Vorbehandlung anstelle von ART-Fc wie in A–C. (E) Expressionsniveaus von CD80 und CD86 durch Lin-1-CD11c plus HLA-DR plus DCs nach 5 d Melan-A-Stimulation mit der Vorbehandlung von angezeigtem Anti-CTLA -4 mAbs (n=6). Zahlen auf Histogrammen zeigen MFI. (F) Zusammenfassung der Häufigkeiten von Treg und Tet plus CD8 plus T-Zellen nach Vorbehandlung mit den angegebenen Anti-CTLA-4-mAbs, gefolgt von Melan-A26–35-Stimulation wie in A–C. Mittel ± SEM. Die dargestellte Signifikanz zwischen den beiden Gruppen wurde unter Verwendung eines gepaarten t-Tests berechnet. *P Kleiner oder gleich 0,05.

CTLA-4-vermittelte Treg-Depletion vor Tumor-Antigen-Impfung verstärkt Antitumor-Antworten bei Mäusen.

Um die In-vitro-Ergebnisse mit humanen PBMCs und Anti-Human-CTLA-4-mAbs bei Mäusen zu validieren, haben wir mAbs mit einer hohen oder niedrigen ADCC- und Antikörper-abhängigen zellulären Phagozytose (ADCP)-Aktivität aus Anti-Maus-CTLA{{4) erzeugt }} mAb (Klon UC10) vom IgG2a-Isotyp (im Folgenden als mIgG2a bezeichnet) durch Aminosäuresubstitution in der Fc-Domäne ( 4A ). Die Mutation S239D in beiden schweren Ketten erhöhte die Affinität für Maus-Fc-RIV um das siebenfache (mFa55-mIgG2a-Variante), während L235R-, G236R- und S239K-Mutationen in beiden schweren Ketten sie nicht mehr an Maus-Fc-Rs binden (mFa31-mIgG2a-Variante); Ersteres wurde Maus-ADCC/ADCP-enhanced-Fc (enhanced), letzteres Maus-Silent-Fc (mSilent) mAb genannt. Um die Antitumoraktivität dieser Fc-modifizierten Anti-Maus-CTLA-4-mAbs in Kombination mit einer Tumorantigenimpfung zu vergleichen, inokulierten wir subkutan in BALB/c-Mäuse CMS5a-Fibrosarkomzellen, die das humane NY-ESO-1-Antigen exprimieren, und an Tag 9, als sich der Tumor etablierte, wurden die Mäuse mit 100 ug von jedem mAb behandelt und am selben Tag mit NY-ESO-1-Peptid geimpft (Tag 9; wir nennen das Protokoll im Folgenden "gleichzeitige Behandlung"). oder 3 Tage später (Tag 12; im Folgenden "Ak-Vorbehandlung") (Fig. 4B). Die Ab-Vorbehandlung mit mEnhanced mAb war bei der Verzögerung des Tumorwachstums wirksamer als die gleichzeitige Behandlung oder Vorbehandlung mit mIgG2a oder mSilent mAb; die Wirkungen der beiden letztgenannten mAbs auf das Tumorwachstum waren gering und unterschieden sich nicht signifikant zwischen der Ab-Vorbehandlung und der gleichzeitigen Behandlung (Fig. 4C). Das Überleben war signifikant besser bei mit mEnhanced mAb vorbehandelten Mäusen und auch bei Mäusen mit gleichzeitiger Behandlung oder Vorbehandlung mit mIgG2a, obwohl beide Arten der mIgG2a-Behandlung bei den meisten Mäusen keine Tumorregression induzieren konnten (Abb. 4 C und D).

Abb. 4. Vorbehandlung mit ADCC/ADCP-verstärktem Anti-CTLA-4-mAb induziert starke Antitumorwirkungen bei Mäusen. (A) Zusammenfassung der Aminosäuresubstitutionen am Fc-Teil des Anti-Maus-CTLA-4-IgG2a-mAb (Klon UC10; mIgG2a) zur Erzeugung von ADCC/ADCP-verstärktem Anti-Maus-CTLA{{ 10}} (enhanced) oder Silent-Fc-Anti-Maus-CTLA-4 (mSilent) mAbs und ihre Affinitäten zu Maus-Fc-RIV sind gezeigt. Die Affinität von mSilent mAb lag unter der Nachweisgrenze des BIACORE-Assays. (B– D) Versuchsschema (B). Mäuse wurden am Tag {{40}} mit 2 × 106 CMS5a-Fibrosarkom, das humanes NY-ESO-1 exprimiert, herausgefordert und unbehandelt gelassen oder mit mEnhanced, mIgG2a oder stumm behandelt Anti-Maus-CTLA-4-mAb an Tag 9. Die Impfung mit NY-ESO-181-88-Peptiden gemischt mit CFA wurde am selben Tag (Tag 9, gleichzeitige Behandlung) oder 3 Tage später (Tag 12, Ab-Vorbehandlung). Tumorwachstum jeder Maus mit einer fetten Linie, die den Durchschnitt jeder Behandlungsgruppe angibt (C) (n=8–13 pro Gruppe). Zusammenfassung des durchschnittlichen Tumorwachstums jeder Behandlungsgruppe (D, links). Sternchen zeigen P-Werte zwischen der mEnhanced-mAb-Vorbehandlungsgruppe durch Zweiweg-ANOVA mit Tukey-Mehrfachvergleichstest an. Zusammenfassung der Überlebensrate (D, rechts) jeder Behandlungsgruppe. P-Werte zwischen dem Überleben jeder Gruppe und dem Überleben der Kontrolle mit alleinigem Impfstoff wurden durch einen Log-Rank-Test berechnet. Das Todesereignis entspricht einer Tumorlänge von mehr als oder gleich 200 mm oder dem Tod der Maus. *P kleiner oder gleich 0,05, **P kleiner oder gleich 0,01, ***P kleiner oder gleich 0,001 und ****P kleiner oder gleich 0,0001.

Die verstärkte mAb-Vorbehandlung führte auch zu einer signifikanten Erhöhung der Anzahl der tumorinfiltrierenden CD8-plus-T-Zellen und des CD8/Treg-Verhältnisses in TILs, obwohl der Prozentsatz der FOXP3-plus-Zellen unter den CD4-plus-T-Zellen leicht anstieg (Abb. 5 A– C). Während die Häufigkeit von NY-ESO-1-Peptid-spezifischem CD8 plus TILs bei den Mäusen, die mit jedem mAb oder zwischen Vorbehandlung und gleichzeitiger Behandlung behandelt wurden, statistisch nicht unterschiedlich war, wurden die Antigen-spezifischen CD8 plus TILs von verstärktem mAb vorbehandelt Mäuse zeigten im Vergleich zu anderen Gruppen eine signifikant aktivere IL-2- und IFN-Produktion nach In-vitro-Restimulation mit NY-ESO-1-Peptid (Fig. 5 D und E). Darüber hinaus nahmen Effektorgedächtnis-CD8-plus-T-Zellen, definiert als CD44highCD62Llow-Population, unter NY-ESO-1-spezifischen CD8-plus-TILs in mit Enhanced mAb vorbehandelten Mäusen signifikant zu (Abb. 5 F und G).

Zusammengenommen war die Vorbehandlung mit mEnhanced mAb am wirksamsten bei der Hervorrufung der Tumorimmunität, gefolgt von einer Vorbehandlung mit mIgG2a, das eine gewisse ADCC-Aktivität aufwies, während mSilent mAb viel weniger wirksam war. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine Vorbehandlung tumortragender Mäuse mit ADCC/ADCP-verstärktem Anti-CTLA-4-mAb, gefolgt von einer Tumorantigen-Impfung, wirksam Antitumor-Immunantworten in vivo hervorrufen kann.

Diskussion

Die wichtigsten Erkenntnisse in diesem Bericht sind: (i) terminal differenzierte, stark supprimierende eTreg-Zellen sind in Tumorgeweben reichlich vorhanden und exprimieren Oberflächen-CTLA-4 in höheren Konzentrationen als tumorinfiltrierende CD8 plus T-Zellen; (ii) Anti-CTLA-4-mAb mit hoher ADCC-Aktivität ist in der Lage, CTLA-4-hohe eTreg-Zellen und CTLA-4 plus Effektor-CD8 plus T-Zellen zu depletieren/reduzieren; und (iii) zelldepletierende Anti-CTLA-4-mAb können eine wirksame Tumorimmunität hervorrufen und verstärken, wenn das Antikörperbehandlungsschema so konzipiert ist, dass es CTLA-4 plus Effektor CD8 plus T-Zellen nicht beeinflusst, zum Beispiel durch Änderung des Zeitpunkts der Treg-Zelldepletion und der Impfung mit Krebsantigenen.

Die ADCC-Aktivität von Anti-CTLA-4-mAb ist eine Schlüsseldeterminante für die Wirksamkeit der eTreg-Reduktion und der daraus resultierenden Expansion von tumorreaktiven CD8-plus-T-Zellen. Unterstützend haben wir gezeigt, dass Anti-CTLA-4-mAb (ART-Fc) mit einer erhöhten ADCC-Aktivität (und/oder ADCP-Aktivität bei Mäusen) in der Lage war, die Antitumor-Immunantworten in vitro beim Menschen und in vivo zu verstärken Mäuse durch Abbau von CTLA-4-exprimierenden Treg-Zellen. Anti-CTLA4-mAbs (Silent-Fc), die so modifiziert wurden, dass sie viel weniger oder keine ADCC-Aktivität zeigten, zeigten keine solche Antitumoraktivität, selbst wenn sie die gleiche Spezifität für ein Epitop des CTLA-4-Moleküls besaßen. Beim Menschen bleibt unklar, ob die Antitumorwirkung von Ipilimumab mit IgG1-Fc-Anteil auf die Blockade des CTLA4-Moleküls oder die Depletion von CTLA-4-exprimierenden Zellen durch ADCC zurückzuführen ist. Bei Mäusen wurde gezeigt, dass eine Verstärkung der Antitumor-Immunität durch einen Anti-CTLA-4-mAb eine Depletion tumorinfiltrierender Treg-Zellen durch FcR-vermittelte ADCC erforderte (19–21, 26, 27). In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass Antikörper gegen GITR-, OX40- und CD25-Moleküle, in denen tumorinfiltrierende Treg-Zellen die höchsten Mengen exprimieren, von der ADCC-vermittelten Depletion von Treg-Zellen bei der Tumorabstoßung abhängig sind (19, 26, 28). Es wurde auch berichtet, dass die Behandlung mit Ipilimumab bei Melanompatienten FOXP3 plus Treg-Zellen im Tumorgewebe signifikant reduzierte, insbesondere bei klinischen Respondern (29).

Darüber hinaus hat ein kürzlich erschienener Bericht gezeigt, dass unter Melanompatienten mit hoher Tumormutationslast diejenigen, die genetisch eine hochaffine Variante von Fc RIIIa mit verstärktem ADCC (V158-Variante, im Gegensatz zur F158-Variante mit niedriger Affinität) haben, signifikant besser abschneiden klinisches Ansprechen auf die Behandlung mit Ipilimumab und besseres Gesamtüberleben (27). Dieser Befund stützt die Annahme, dass Anti-CTLA-4-mAb mit besserer Treg-Depletionsaktivität in der Krebsimmuntherapie wirksamer sein könnte als Ipilimumab. Es ist daher wahrscheinlich, dass ART-Fc anti-CTLA4 mAb, der eine hohe Affinität für die V158-Variante besitzt (KD=3,7 × 10–10 M, verglichen mit 3,1 × 10–6 M für Ipilimumab oder IgG1) , kann eine bessere klinische Wirksamkeit in der Krebsimmuntherapie über die Depletion von Treg-Zellen haben. Zusammengenommen weisen diese Befunde bei Menschen und Mäusen darauf hin, dass Anti-CTLA-4-mAb mit hohem ADCC/ADCP-Gehalt beim Hervorrufen und Verbessern der Tumorimmunität durch Depletion von Treg-Zellen wirksam sein kann.

Abb. 5. Ag-spezifische CD8-plus-T-Zell-Antworten, induziert in Tumor-tragenden Mäusen durch Vorbehandlung mit ADCC/ADCP-verstärktem Anti-CTLA-4-mAb. (A–G) TILs aus Abb. 4 wurden 19 d nach Tumorimplantation analysiert (n=4–6 pro Gruppe). Die Anzahl der infiltrierten T-Zellen pro Gramm Tumor (A). CD8/Treg-Zellverhältnis (B). Häufigkeit von Foxp3 plus Treg-Zellen unter CD4 plus T-Zellen (C). Repräsentative Plots von IL-2 plus IFN- plus CD8 plus T-Zellen (D). Die Zytokinproduktion wurde durch Restimulation von TILs mit ESO-181–88-Peptiden in vitro für 5 h gemessen. Zusammenfassung von Tet plus CD8 plus T-Zellen im Tumor und IL{{20}} plus IFN- plus CD8 plus T-Zellen in D nach der Restimulation (E). Repräsentative Diagramme (F) und Zusammenfassung (G) von CD44- und CD62L-Expressionen durch NY-ESO-1-Tet plus CD8 plus T-Zellen im Tumor jeder Behandlungsgruppe. Die Daten wurden aus drei unabhängigen Experimenten erhalten. P-Werte zwischen naiven oder EM CD8 plus T-Zell-Teilmengen jeder Bedingung. Mittel ± SEM. *P Kleiner als oder gleich 0.05, † P Kleiner als oder gleich 0.05, **P Kleiner als oder gleich 0,01, ††P Kleiner als oder gleich 0,01 und ***P Kleiner als oder gleich 0,001 durch Zweiweg-ANOVA mit Mehrfachvergleichstest nach Tukey.

Materialen und Methoden

Spenderproben.

Periphere Blutproben wurden von gesunden Personen oder Patienten mit Melanom im Stadium III bis IV erhalten. PBMCs wurden durch Dichtegradienten mit Ficoll-Paque (GE Healthcare) isoliert. TILs wurden aus reseziertem Melanomgewebe erhalten. Der Tumor wurde zerkleinert und Einzelzellsuspensionen, die nach sanfter MACS-Dissoziation (Miltenyi) erzeugt wurden, wurden durch Filtrieren durch ein 40--μm-Zellsieb hergestellt. Alle Spender gaben vor der Probenahme gemäß der Deklaration von Helsinki eine schriftliche Einverständniserklärung ab. Die vorliegende Studie wurde vom Institutional Review Board der Universität Osaka genehmigt.

CyTOF-Analyse.

TILs und Splenozyten von Tumor-tragenden Mäusen wurden mit CD3-Plus-Zellen angereichert und mit 198-Cisplatin zur Unterscheidung toter Zellen und einer Gruppe von Antikörpern, einschließlich der folgenden metallkonjugierten Antikörper, gefärbt: 172Yb-CD4 (RM4-5 ), 168Er-CD8 (53-6.7), 164Dy-CTLA-4 (UC-10), 158GdFOXP3 (FJK-16s). Für humane PBMCs und TILs wurden Zellsuspensionen mit Anti-CD45-Antikörpern mit verschiedenen Metallkonjugaten barcodiert, wie zuvor beschrieben (35), vor der Färbung mit 198- Cisplatin zur Unterscheidung toter Zellen und anschließender Antikörperfärbung mit dem folgenden Panel. Metallkonjugierte Antikörper wurden von Fluidigm oder Maxpar erhalten. Das Antibody Labeling Kit (Fluidigm) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, um gereinigte Antikörper zu konjugieren: 89Y-CD45 (Klon: HI30; Fluidigm), 115In-CD45 (HI30; Biolegend), 175Yb- CD45 (HI30; Biolegend)-Antikörper wurden zum Barcodieren verschiedener Proben verwendet; CLA-FITC (HECA-452; BD), CCR8-PE (L263G8; Biolegend), CXCR5-Biotin (RF8B2; BD), eVolve 605 (114 Cd)-CD8a (RPA -T8; eBioscience), 139La-CD123 (6H6; Biolegend), 141Pr-CCR6 (11A9; Fluidigm), 142Nd-CD14 (M5E2; Biolegend), 144Nd-FITC (CLA) (FIT22; Fluidigm), 145NdCD4 (RPA-T4 ; Fluidigm), 148Sm-CD20 (2H7; Biolegend), 149Sm-CCR4 (205410; Fluidigm), 150Nd-SAV (CXCR5) (1D4-C5; Fluidigm), 151Eu-ICOS (C398.4A; Fluidigm) , 152Sm-CD69 (FN50; Biolegend), 153Eu-CD45RA (HI100; Fluidigm), 154Sm-CD3 (UCHT1; Fluidigm), 155Gd-CD197 (CCR7) (150503; R&D Systems), 156Gd-anti-PE (CCR8) ( PE001; Fluidigm), 158Gd-CD27 (L128; Fluidigm), 159TbCD19 (HIB19; Biolegend), 160Gd-CD39 (A1; Fluidigm), 163Dy-CXCR3 (G025H7; Fluidigm), 164Dy-CD95 (DX2; Fluidigm), CD45RO (UCHL1; Fluidigm), 166Er-CD279 (PD-1) (EH12.2H7; Biolegend), 167Er-PDL1 (29E.2A3; Biolegend), 169Tm-CD25 (IL-2R) ( 2A3; Fluidigm), 171Yb-CD11c (3,9; Biolegend), 172YbCD38 (HIT2; Fluidigm), 173Yb-TIGIT (MBSA43; eBioscience), 174Yb-HLA-DR (L243; Fluidigm), 176Yb-CD127 (IL-7R) (A019D5; Fluidigm), 209Bi-CD11b (ICRF44; Fluidigm), 146Nd-Helios (22F6; Biolegend), 161Dy–CTLA-4 (14D3; Fluidigm), 162Dy-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) und 168Er-Ki-67 (Ki-67; Fluidigm).

Human- und Mauszellen wurden vor der intrazellulären Färbung mit eBioscience Foxp3/Transkriptionsfaktor-Färbepuffern (ThermoFisher) fixiert. Gefärbte Zellen wurden dann über Nacht in 2 % PFA mit 191/193--Iridium-DNA-Interkalator (Fluidigm) resuspendiert, dann gewaschen und unmittelbar vor der Analyse mit Helios CyTOF in Maxpar-Wasser (Fluidigm) und EQ-Vier-Elemente-Beads (Fluidigm) resuspendiert System (Fluidigma). Normalisierte Daten wurden mit Cytobank Premium analysiert.

Stimulation antigenspezifischer CD8 plus T-Zellen.

Ganze PBMCs von gesunden Personen und Melanompatienten wurden mit 10 μM kurzer Peptide stimuliert, die spezifisch für HLA-A*0201 (Operon Biotechnology) für 8–9 Tage waren: Melan-A26–35 (EAAGIGILTV), CMV495–503 (NLVPMVATV), Flu58 –66 (GILGFVFTL) oder NY-ESO1157–165 (SLLMWITQC) (12, 22). Um die Wirkung von Anti-CTLA-4-mAb mit verschiedenen ADCC zu bestimmen, wurde einer der folgenden mAbs der Kultur mit 1 ug/ml (sofern nicht anders angegeben) am selben Tag oder 5 Tage vor der Antigenstimulation zugesetzt: ADCC -verstärktes Anti-Human-CTLA-4-IgG1 (MDX-010-ART-Fc), konventionelles unmodifiziertes Anti-CTLA-4-IgG1 (MDX-010-IgG1) oder Silent-Fc Anti-CTLA-4-IgG1-Antikörper (MDX-010-silent-Fc): Alle mAbs wurden freundlicherweise von Chugai Pharmaceutical zur Verfügung gestellt. Die Hälfte des Mediums wurde alle 3 Tage durch frisches Medium ersetzt, das 10 U/ml IL-2 und 40 ng/ml IL-7 enthielt.

Laktatdehydrogenase-Freisetzungsassay mit humanen CTLA-4-exprimierenden CHO-Zellen.

Ein Laktatdehydrogenase (LDH)-Freisetzungstest wurde durchgeführt, um die ADCC-Aktivität in PBMCs zu bestimmen. Die CHO DG44-hCTLA4-Zellen (von Chugai Pharmaceutical) wurden auf 96-Well-Rundbodenplatten (1 × 10 4 Zellen pro Well) ausgesät und mit verschiedenen Konzentrationen von mAbs für 15 min inkubiert. Von gesunden Spendern erhaltene PBMCs wurden dann der Kultur in einem Verhältnis von Effektor zu Ziel (E∕T) von 50:1 zugesetzt. Die Zellen wurden bei 37 Grad, 5 Prozent CO2 für 6 oder 24 Stunden inkubiert, 100 μl des Überstands aus jeder Vertiefung wurden gesammelt und die Absorption bei 492 nm und 630 nm wurde mit dem Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (BioTek Instruments) gemessen. Die LDH-Freisetzung wurde nach Inkubation der Zellen in 1-prozentiger Nonidet P-40-Lösung als maximal angesehen. Die Zytotoxizität (Prozent) wurde aus der Formel bestimmt; (AC)∕(BC) × 100, wobei A, B und C die LDH-Freisetzung jedes Experiments, die maximale LDH-Freisetzung bzw. die Hintergrund-LDH-Freisetzung darstellen. Alle Experimente wurden doppelt durchgeführt.

ADCC-Assay mit frisch isolierten menschlichen PBMC.

PBMCs von gesunden Spendern wurden FACS-sortiert für jede Fraktion von T- und Treg-Zellen wurden mit CellTrace Violet (CTV; ThermoFisher) vormarkiert und mit Nicht-T-Zellen als Effektorzellen in einem Target-zu-Effektor-Verhältnis von 1:50 kultiviert. Als nächstes wurde 1 ug/ml des angezeigten Anti-CTLA-4-mAb zu 10 % menschlichem AB-Serum hinzugefügt, das RPMI1640-Medium mit 5 IE/ml IL -2 enthielt. Nach 24- h Kultur bei 37 Grad wurde die Häufigkeit toter Zellen, angezeigt durch LIVE/DEAD-fixierbare Färbung (ThermoFisher), unter den CTV-Plus-Zellen durch FACS bestimmt.

Experimente mit murinen Tumoren.

Sechs bis 7- Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden von CLEA Japan gekauft und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten. Mäuse wurden subkutan mit 2 × 106 CMS5a-NY-ESO-1 herausgefordert. Neun Tage nach der Tumorimplantation erhielten die Mäuse intravenös 100 µg Anti-Maus-CTLA4-mAb (UC-10-Klon; mIgG2a, mEnhanced oder mSilent von Chugai Pharmaceutical). Die mEnhanced-Variante (mFa55-mIgG2a-Variante) wurde durch S239D-Mutation in der CH2-Domäne erzeugt und zeigt im Vergleich zum Wildtyp-mIgG2a eine etwa siebenfach verbesserte Bindungsaffinität zum Maus-Fc-RIV. Mäuse wurden entweder am selben Tag (Tag 9, gleichzeitige Behandlung) oder 3 mit einer Impfung von 100 ug ESO-181-88-Peptiden (Operon Biotechnology) gemischt mit 200 μl CFA/PBS (Verhältnis 1:1) behandelt d später (Tag 12, Ak-Vorbehandlung) subkutan. Die Tumorgröße wurde alle 3–4 Tage gemessen. Die Experimente wurden vom Institutional Review Board genehmigt und in Übereinstimmung mit den Vorschriften der Universität Osaka durchgeführt.

Durchflusszytometrie.

Wie zuvor beschrieben (12, 23), wurden in vitro erzeugte Antigen-spezifische CD8 plus T-Zellen mit PE-markiertem Melan-A, CMV oder Flu-Tetramer (TC Matrix) oder PE-markiertem NY-ESO-1 gefärbt. Tetramer (MBL) für 10 min bei 37 Grad und dann mit verschiedenen Oberflächen-mAbs gefärbt. Für die Färbung von Oberflächen-CTLA-4 in dieser Studie wurde ein biotinylierter Anti-Human-CD152-Antikörper (Klon BNI3; BD Biosciences) bei 4 Grad für 15 Minuten mit anderen Antikörpern gegen Oberflächenmoleküle verwendet. Nach dem Waschen fügten wir APC-Streptavidin (Biolegend) ebenfalls bei 4 Grad für 15 Minuten hinzu, um eine Färbung von CTLA-4-Molekülen zu vermeiden, die nach ausgedehnten Färbebedingungen bei 37 Grad auf die Oberfläche ausgelagert wurden. Diese Färbeverfahren wurden vor der Fixierung und Permeabilisierung durchgeführt, wie in unserer vorherigen Studie beschrieben (24).

Die intrazelluläre Färbung von FOXP3 wurde unter Verwendung des FOXP3 Transcription Factor Staining Buffer Sets (eBioscience) durchgeführt. Die folgenden Antikörper mit den angegebenen fluoreszierenden Markierungen wurden zum Färben menschlicher Zellen verwendet: PerCP/Cy5.5-CCR7 (150503; BD Biosciences), FITC-CD45RA (HI100; BD Biosciences), Biotin-CTLA-4 (BNI3 ; BD Biosciences), APC-Streptavidin (BioLegend), V500-CD8 (RPA-T8; BD Biosciences), BrilliantViolet711-CD3 (OKT3; Biolegned), AlexaFluor700-CD4 (RPA -T4; eBioscience), FITC-Linienmischung (BD Biosciences), PerCP/Cy5.5-CD11c (3.9; BioLegend), APC-HLA-DR (LN3; eBioscience), PE-CD86 (IT2.2; eBioscience), AlexaFluor700-CD80 (L307.4; BD Biosciences), PE-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) und fixierbarer Vitalitätsfarbstoff eFluor780 (eBioscience). Folgende Antikörper wurden zum Färben von Mauszellen verwendet: V500-CD8 (53-6.7; BD Biosciences), PE-Cy7-CD3e (145-2C11; eBioscience), eFluor 450-CD4 (RM4-5; eBioscience), APC-CD25 (PC61.5; eBioscience), PE-FOXP3 (FJK-16s; eBioscience), FITC–IFN- (XMG1. 2; BD Biosciences), AlexaFluor647-IL-2 (JES6-5H4; eBiosciences) und fixierbarer Vitalitätsfarbstoff eFluor780 (eBioscience). Antigen-spezifische TIL-CD8-plus-T-Zellen von Mäusen wurden mit PE-markierten, H-2Dd-restringierten ESO-181–88-Tetrameren (TC-Matrix) wie oben beschrieben gefärbt. Um die Zytokinproduktion von CD8 plus T-Zellen zu messen, wurden Maus-TILs für 5 h bei 37 Grad in Gegenwart von 10 μM der gleichen ESO-181-88-Peptide restimuliert, die für eine Impfung mit GolgiPlug (BD Bioscience) verwendet wurden. Fixierung und Permeabilisierung wurden mit dem Cytofix/Cytoperm-Pufferset (BD Bioscience) durchgeführt. Die Zellen wurden mit LSR Fortessa (BD Bioscience) erfasst und mit der Software FlowJo v9.9.5 analysiert.

Statistische Analyse

Der zweiseitige gepaarte t-Test wurde verwendet, um die Signifikanz zwischen den beiden Gruppen zu bewerten. Einweg- oder Zweiweg-ANOVA mit Post-Hoc-Tukey-Test auf ehrliche signifikante Differenz (HSD) wurde zum Vergleichen mehrerer Gruppen verwendet. Alle statistischen Analysen wurden mit der Software Prism v6 (GraphPad) durchgeführt. P-Werte < 0,05 wurden als signifikant betrachtet.

DANKSAGUNGEN.

Wir danken Mitgliedern der Abteilung für Dermatologie, Graduate School of Medicine, Osaka University für das Sammeln von Patientenproben; und K. Teshima, T. Shimizu und N. Mizoguchi für technische Unterstützung. Fcengineered Anti-Human- und Maus-CTLA-4-Antikörper wurden von Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. erzeugt und bereitgestellt. Diese Studie wurde von Grant-in-Aid for Specially Promoted Research 16H06295 (an SS), Grants-in-Aid, unterstützt für wissenschaftliche Forschung (A) 26253030 (an SS) und (B) 26290054 (an HN), Stipendien für anspruchsvolle explorative Forschung 26670581 (an HN) und Stipendien für junge Wissenschaftler (B) 26860331 und 17K15723 (an A. Tanaka) vom japanischen Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie; und Core Research for Evolutional Science and Technology von der Japan Science and Technology Agency (SS). Diese Studie wurde teilweise als Forschungsprogramm des Projekts für die Entwicklung innovativer Forschung zu Krebstherapeutika (P-DIRECT) und der praktischen Forschung für innovative Krebsbekämpfung und des Projekts für Krebsforschung und therapeutische Evolution (P-CREATE) von Japan durchgeführt Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung.

1. Sakaguchi S (2004) Natürlich vorkommende CD4 plus regulatorische T-Zellen für immunologische Selbsttoleranz und negative Kontrolle von Immunantworten. Annu Rev. Immunol. 22:531–562.

2. Zou W (2006) Regulatorische T-Zellen, Tumorimmunität und Immuntherapie. Nat. Rev. Immunol. 6:295–307.

3. Tanaka A, Sakaguchi S (2017) Regulatorische T-Zellen in der Krebsimmuntherapie. Cell Res 27: 109–118.

4. Quezada SA, Peggs KS, Curran MA, Allison JP (2006) CTLA4-Blockade und GM-CSF-Kombinationsimmuntherapie verändert das intratumorale Gleichgewicht von Effektor- und regulatorischen T-Zellen. J Clin Invest 116: 1935–1945.

5. Shimizu J, Yamazaki S, Sakaguchi S (1999) Induktion der Tumorimmunität durch Entfernung von CD25 plus CD4 plus T-Zellen: Eine gemeinsame Grundlage zwischen Tumorimmunität und Autoimmunität. J. Immunol. 163:5211–5218.

6. Wolf AM, et al. (2003) Zunahme regulatorischer T-Zellen im peripheren Blut von Krebspatienten. Clinic Cancer Res. 9:606–612.

7. Curiel TJ, et al. (2004) Die spezifische Rekrutierung von regulatorischen T-Zellen beim Ovarialkarzinom fördert das Immunprivileg und sagt ein reduziertes Überleben voraus. Nat Med 10:942–949.

8. Petersen RP, et al. (2006) Tumorinfiltrierendes Foxp3 plus regulatorische T-Zellen sind mit einem Wiederauftreten bei NSCLC-Patienten im pathologischen Stadium I assoziiert. Krebs 107:2866–2872.

9. Shang B, Liu Y, Jiang SJ, Liu Y (2015) Prognostischer Wert von tumorinfiltrierenden FoxP3 plus regulatorischen T-Zellen bei Krebs: Eine systematische Überprüfung und Metaanalyse. Sci Rep 5:15179.

10. Miyara M. et al. (2009)Funktionelle Abgrenzung und Differenzierungsdynamik von humanen CD4 plus T-Zellen, die den Transkriptionsfaktor FoxP3 exprimieren. Immunität 30:899–911.

11. Wing JB, et al. (2017)Eine bestimmte Subpopulation von CD25-T-follikulären regulatorischen Zellen lokalisiert in den Keimzentren. Proc Natl Acad Sci USA 114: E6400–E6409.

12. Saito T. et al. (2016)Zwei FOXP3(plus)CD4(plus)-T-Zell-Subpopulationen kontrollieren deutlich die Prognose von Darmkrebs. Nat Med 22:679–684.

13. Sugiyama D, et al. (2013)Anti-CCR4-mAb depletiert selektiv FoxP3 vom Effektortyp plus CD4 plus regulatorische T-Zellen, was beim Menschen Antitumor-Immunantworten hervorruft. Proc Natl Acad Sci USA 110: 17945–17950.

14. Shevach EM (2009)Mechanisms of foxp3 plus T-regulatorische Zell-vermittelte Unterdrückung. Immunität 30:636–645.

15. Flügel K, et al. (2008) CTLA-4-Kontrolle über Foxp3 plus regulatorische T-Zellfunktion. Wissenschaft 322: 271–275.

16. Qureshi OS, et al. (2011) Trans-Endozytose von CD80 und CD86: Eine molekulare Grundlage für die zellextrinsische Funktion von CTLA-4. Wissenschaft 332: 600–603.

17. Hodi FS, et al. (2010) Verbessertes Überleben mit Ipilimumab bei Patienten mit metastasiertem Melanom. N Engl J Med 363: 711–723.

18. Robert C. et al. (2011)Ipilimumab plus Dacarbazin für zuvor unbehandeltes metastasierendes Melanom. N Engl J Med 364: 2517–2526.

19. Bullard Y, et al. (2013) Aktivierende Fc-Rezeptoren tragen zu den Antitumoraktivitäten von immunregulatorischen Rezeptor-gerichteten Antikörpern bei. J Exp Med 210: 1685–1693.

20. Simpson TR, et al. (2013) Die Fc-abhängige Depletion tumorinfiltrierender regulatorischer T-Zellen bestimmt die Wirksamkeit der Anti-CTLA-4-Therapie gegen Melanom mit. J Exp Med 210: 1695–1710.

21. Selby MJ, et al. (2013)Anti-CTLA-4-Antikörper des IgG2a-Isotyps verstärken die Antitumoraktivität durch Reduktion von intratumoralen regulatorischen T-Zellen. Cancer Immunol Res 1: 32–42.

22. Nimmerjahn F, Ravetch JV (2008) Fcgamma-Rezeptoren als Regulatoren von Immunantworten. Nat. Rev. Immunol. 8:34–47.

23. Mimoto F. et al. (2013)Neuartige asymmetrisch konstruierte Antikörper-Fc-Variante mit überlegener FcR-Bindungsaffinität und -spezifität im Vergleich zur fucosylierten Fc-Variante. MAbs 5:229–236.

24. Maeda Y, et al. (2014) Nachweis von selbstreaktiven CD8 plus T-Zellen mit einem anergischen Phänotyp bei gesunden Personen. Wissenschaft 346: 1536–1540.

25. Gnjatic S, et al. (2006) NY-ESO-1: Überprüfung eines immunogenen Tumorantigens. Adv Cancer Res 95:1–30.

26. Arce Vargas F, et al.; Melanom TRACERx-Konsortium; Nieren-TRACERx-Konsortium; Lung TRACERx Consortium (2017) Fc-optimiertes Anti-CD25 depletiert tumorinfiltrierende regulatorische T-Zellen und wirkt synergetisch mit PD-1-Blockade, um etablierte Tumore auszurotten. Immunität 46:577–586.

27. Arce Vargas F, et al.; TRACERx Melanom; TRACERx Nieren; TRACERx Lung consortia (2018) Fc-Effektorfunktion trägt zur Aktivität von humanen Anti-CTLA-4-Antikörpern bei. Krebszelle 33:649–663.e4.

28. Bullard Y. et al. (2014) Das OX40-Engagement erschöpft intratumorale Tregs über die Aktivierung von Fc Rs, was zu einer Antitumorwirksamkeit führt. Immunol Cell Biol 92:475–480.

29. Romano E. et al. (2015)Ipilimumab-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität regulatorischer T-Zellen ex vivo durch nichtklassische Monozyten bei Melanompatienten. Proc Natl Acad Sci USA 112:6140–6145.

30. Walker LSK, Sansom DM (2011) Die aufkommende Rolle von CTLA4 als zellexterner Regulator von T-Zell-Antworten. Nat. Rev. Immunol. 11:852–863.

31. Linsley PS, et al. (1996)Intrazellulärer Transport von CTLA-4 und fokale Lokalisierung zu Orten mit TCR-Engagement. Immunität 4:535–543.

32. Egen JG, Allison JP (2002) Die Akkumulation des zytotoxischen T-Lymphozyten-Antigens -4 in der immunologischen Synapse wird durch die TCR-Signalstärke reguliert. Immunität 16:23–35.

33. Ko K. et al. (2005) Behandlung von fortgeschrittenen Tumoren mit agonistischem Anti-GITR-mAb und seine Wirkungen auf tumorinfiltrierende Foxp3 plus CD25 plus CD4 plus regulatorische T-Zellen. J Exp Med 202: 885–891.

34. Prieto PA, et al. (2012) CTLA-4-Blockade mit Ipilimumab: Langzeit-Follow-up von 177 Patienten mit metastasiertem Melanom. Clinic Cancer Res. 18:2039–2047.

35. Mei HE, Leipold MD, Schulz AR, Chester C, Maecker HT (2015) Barcoding of Live Human Peripher Blood Mononuclear Cells for Multiplexed Mass Cymetry. J. Immunol. 194:2022–2031.

Danbee Haa,b, Atsushi Tanakaa, Tatsuya Kibayashia,c, Atsushi Tanemurad, Daisuke Sugiyamaa,1, James Badger Winga, Ee Lyn Lima, Karen Wei Weng Tenge, Dennis Adeegbea,2, Evan W. Newelle, Ichiro Katayamad, Hiroyoshi Nishikawaa, 1,3 und Shimon Sakaguchia,b,4.

ein Experimental Immunology, Immunology Frontier Research Center, Osaka University, 565-0871 Osaka, Japan; b Laboratory of Experimental Immunology, Department of Regeneration Science and Engineering, Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 606-8507 Kyoto, Japan; c Forschungsabteilung, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., 247-8530 Kanagawa, Japan; d Abteilung für Dermatologie, Graduate School of Medicine, Osaka University, 565-0871 Osaka, Japan; und e Agency for Science, Technology, and Research, Singapore Immunology Network, 138632 Singapur.

Beigesteuert von Shimon Sakaguchi, 23. November 2018 (zur Überprüfung gesendet am 19. Juli 2018; überprüft von Miyuki Azuma und Sergio A. Quezada).

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