DNA-Methylom und Transkriptom identifizierten Schlüsselgene und -wege, die an der Bildung gesprenkelter Eierschalen bei alten Legehennen beteiligt sind

Abstrakt

Hintergrund

Die Qualität der Eierschalen von Geflügel hängt eng mit der Rentabilität der Eierproduktion zusammen. Eierschalenflecken spiegeln ein wichtiges Qualitätsmerkmal wider, das das Aussehen von Eiern und die Kundenpräferenz beeinflusst. Allerdings ist der Mechanismus der Speckle-Bildung noch immer wenig verstanden. In dieser Studie verglichen wir systematisch die Immun- und Antioxidantienindizes im Serum von Hühnern, die gesprenkelte und normale Eier legten. Transkriptom- und Methylomanalysen wurden verwendet, um den Mechanismus der Bildung von Eierschalenflecken aufzuklären.

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Ergebnisse

Die Ergebnisse zeigten, dass zwischen der Normal- und der Speckle-Gruppe sieben differentiell exprimierte Gene (DEGs) identifiziert wurden. Die Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) ergab, dass die exprimierten Gene hauptsächlich im Calcium-Signalweg, der fokalen Adhäsion und dem MAPK-Signalweg angereichert waren. Darüber hinaus wurden 282 differentiell methylierte Gene (DMGs) nachgewiesen, von denen 15 Gene mit dem Altern assoziiert waren, darunter ARNTL, CAV1 und GCLC. Die Signalweganalyse zeigte, dass die DMGs mit der T-Zell-vermittelten Immunität, der Reaktion auf oxidativen Stress und der zellulären Reaktion auf DNA-Schadensreize verbunden waren. Die integrative Analyse der Transkriptom- und DNA-Methylierungsdaten identifizierte BFSP2 als das einzige überlappende Gen, das in geringer Menge exprimiert und in der Speckle-Gruppe hypomethyliert wurde.

Schlussfolgerungen

Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass alters- und immunbezogene Gene und Signalwege eine entscheidende Rolle bei der Bildung gesprenkelter Eierschalen spielen und nützliche Informationen zur Verbesserung der Eierschalenqualität liefern.

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

Schlüsselwörter

Legehennen, gesprenkelte Eier, Transkriptom, DNA-Methylierung, Immunität

Hintergrund

Geflügeleier gehören zu den wichtigsten Proteinquellen und sind aufgrund ihres relativ geringen Preises bei Verbrauchern beliebt. In den letzten vier Jahrzehnten hat sich die Eierproduktion durch die Entwicklung spezialisierter Eierrassen und genetischer Selektion erheblich verbessert, mit dem Ziel, „Legehennen 100 Wochen lang zu füttern, um 500 Eier zu produzieren“ [ 1, 2]. Das Erreichen dieses Ziels wurde jedoch durch den allmählichen Rückgang der Eierschalenqualität und -physiologie im Zusammenhang mit der Alterung der Hühner eingeschränkt, was zu einem erhöhten Eierschalengewicht, einer helleren Eierschalenfarbe und gesprenkelten Eierschalen führte [3]. Der rotbraune Fleck, ein wichtiges Qualitätsmerkmal der Eierschale, erscheint oft am stumpfen Ende der braunen Eierschale und beeinflusst das Aussehen des Eies und die Präferenz des Kunden erheblich. Der Grad der Fleckenbildung auf der Eierschale wird mithilfe einer Bewertungsmethode bewertet. Speckles können nach Pigmentintensität, Verteilung und Speckle-Größe bewertet werden [4]. Darüber hinaus liegt die Erblichkeit gesprenkelter Eierschalen zwischen 0,15 und 0,2, was auf eine genetische Determination hinweist [5]. Darüber hinaus ergab eine frühere Studie, dass ältere Hühner häufiger gesprenkelte Eierschalen aufweisen als jüngere Hühner und nach der 60. Lebenswoche 20 % erreichen [6]. Die Eierschalendrüse ist ein Eibildungsorgan, das eine entscheidende Rolle bei der Struktur und Farbbildung der Eierschale spielt. Während der Eibildung wandert das Eigelb durch das Infundibulum, das Magnum und den Isthmus und erreicht die Eierschalendrüse, die eine große Menge an Kalzium, Pigment, Nagelhaut und anderen Substanzen absondert und so eine vollständige Eierschalenstruktur und eine äußere Nagelhaut bildet [7–9]. ]. Jede Veränderung oder Beschädigung der Eierschalendrüse beeinflusst die Strukturbildung und Pigmentierung der Eierschale [10–12]. Die DNA-Methylierung ist einer der frühesten bekannten Modifikationswege und beinhaltet die Übertragung von Methylgruppen auf die fünfte Kohlenstoffstelle von Cytosin, um 5-Methylcytosin zu bilden [13]. Die DNA-Methylierung spielt eine wichtige Rolle im Alterungsprozess von Tieren und reguliert die altersbedingte Genexpression sowie die Ätiologie neurologischer, immunologischer und metabolischer Erkrankungen [14–17]. Darüber hinaus kann die DNA-Methylierung in Kombination mit Umweltfaktoren während des Alterns zu unterschiedlichen Phänotypen führen [18]. Mehrere komplexe Nutztierphänotypen wurden mit der DNA-Methylierung in Verbindung gebracht [19, 20]. In jüngster Zeit hat sich die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) als nützlich erwiesen, um die Gene und Signalwege aufzudecken, die Merkmalen auf Transkriptionsebene zugrunde liegen [21–24], wie z. B. embryonale Muskelentwicklung, Futtereffizienz und Wurfgröße. Unsere vorherige Studie hat gezeigt, dass das Auftreten von gesprenkelten Eierschalen zwar keinen Einfluss auf die Leistung von Legehennen hat (unveröffentlichte Daten), dass Flecken jedoch das Aussehen von Eiern beeinträchtigen und deren wirtschaftlichen Wert erheblich verringern können. Darüber hinaus sind die molekularen Mechanismen der Bildung gesprenkelter Eier nur unzureichend verstanden. Daher zielte diese Studie darauf ab, den Mechanismus der Bildung gesprenkelter Eierschalen mithilfe transkriptomischer und DNA-Methylierungstechniken aufzuklären. Da gesprenkelte Eierschalen vererbbar und altersbedingt sind, verwendeten wir eine Kombination aus Transkriptom- und DNA-Methylierungsanalysen, um die Schlüsselgene und -wege zu untersuchen, die an der Bildung gesprenkelter Eierschalen beteiligt sind. Es wird erwartet, dass die Ergebnisse dieser Studie das Verständnis des molekularen Mechanismus der Bildung von Eierschalenmerkmalen verbessern werden, was für die Tierzucht nützlich wäre.

Abb. 1 Normale und gesprenkelte Eier von alten Legehennen. A normales Ei, B gesprenkeltes Ei

Tabelle 1 Biochemische Serumparameter der Normal- und Speckle-Gruppe

Ergebnisse

Biochemische Parameter im Serum

A typical egg and speckled egg are shown in Fig. 1. Serum antioxidant and immune indices were measured to determine the physiological status of the laying hens. Serum biochemical parameters are listed in Table 1. Serum levels of immunoglobulin G (IgG) and immunoglobulin A (IgA) are common indicators of humoral immune function. Birds in the normal group had a higher (p = 0.028) IgA content than those in the speckle group. Superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), total antioxidant capacity (T-AOC), glutathione (GSH), and glutathione peroxidase (GSH-PX) are important antioxidant enzymes in the body. MDA is one of the products formed by the reaction of lipids with oxygen radicals, and its content represents the degree of lipid peroxidation. These indices are important in evaluating the oxidative stress process. However, there were no differences (p >0.05) in den Antioxidationsparametern zwischen der Normal- und der Speckle-Gruppe.

Transkriptomprofil der Eierschalendrüse

Sechs cDNA-Bibliotheken wurden aus den Speckle- und Normalgruppen konstruiert. Nach der Qualitätskontrolle wurden insgesamt 615.170.158 Raw-Reads und 604.275.600 Clean-Reads erhalten (98,22 % der Raw-Reads). Nach dem Alignment mit der HISAT2-Software betrug die Kartierungsrate 90,75–93,18 % und die eindeutige Kartierungsrate in allen Proben war größer als 73,47 % (Ergänzungstabelle S3). Die Genexpressionsniveaus werden mithilfe einer Cluster-Heatmap und einer Hauptkomponentenanalyse (PCA) veranschaulicht. Es gab keine signifikanten Unterschiede in den Genexpressionsprofilen der Proben aus der Speckle- und der Normalgruppe, da die Proben keine unterschiedlichen Cluster bildeten (Abb. 2A, B). Insgesamt wurden sieben differentiell exprimierte Gene (DEGs) zwischen der Normal- und der Speckle-Gruppe identifiziert (S<0.05, |log2 Fold Change|>1), darunter zwei hochregulierte und fünf herunterregulierte Gene (Tabelle 2). Die Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) zeigte, dass vier Signalwege durch die exprimierten Gene signifikant angereichert wurden (Ergänzungstabelle S4). Negative normalisierte Anreicherungswerte (NES) deuteten auf niedrigere Expressionsniveaus für einige Signalwege in der normalen Gruppe im Vergleich zu denen der Speckle-Gruppe hin, wobei der Calcium-Signalweg, die neuroaktive Ligand-Rezeptor-Interaktion, die fokale Adhäsion und der MAPK-Signalweg die Wege mit dem sind niedrigster Ausdruck (Abb. 2C). Durch RNA-Sequenz identifizierte Baum-DEGs (BFSP2, IQSEC, TMOD4) wurden mithilfe quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) verifiziert. Eine ähnliche Expression der drei Gene war bei Verwendung von RNA-Seq und qRT-PCR offensichtlich, und der Bestimmungskoeffizient (R2) erreichte 0.93 (Abb. 2D), was darauf hinweist, dass die RNA-Seq-Daten zuverlässig waren.

Tabelle 2 Differenziell exprimierte Gene (DEGs) zwischen den Hühnern, die Speckle-Eier legten, und den normalen Eiern

Abb. 2 Das Transkriptomprofil der Eierschalendrüse. A Heatmap der Genexpressionsniveaus, B Hauptkomponentenanalyse aller Gene unter Verwendung normalisierter DEseq2-Expressionswerte, C Drei repräsentative Gensätze aus den Ergebnissen der Gensatzanreicherungsanalyse, D Die qPCR-Verifizierungsergebnisse unterschiedlich exprimierter Gene

DNA-Methylierungsprofil der Eierschalendrüse

A total of 564,415,302 and 581,414,308 clean reads were obtained from the speckle and normal groups, respectively, after quality control (Supplementary Table S5), of which 73–78% were uniquely mapped to the converted chicken reference genome (GRCg6a). The cytosine (C) methylation rate of the six eggshell gland samples was approximately 3.4%, and the cytosine site methylation of CpG ranged from 55.5–to 63.9% in the two groups. The cytosine site methylation of CHH and CHG (H represents A, C, or T) was detected at a low proportion (0.3–0.4%) (Supplementary Table S5). Pearson correlation analysis of the CpG bases suggested that all samples were highly correlated (r>{{0}}.89) (Abb. 3A). PCA zeigte, dass sich die Proben aus den beiden Gruppen nicht signifikant unterschieden, da sie keine separaten Cluster bildeten (Abb. 3B). Es gab keine signifikanten Unterschiede im Methylierungsgrad von CG, CHG und CHH zwischen den beiden Gruppen (Abb. 3C). Allerdings zeigte die Speckle-Gruppe einen höheren CG-Methylierungsgrad als die normale Gruppe. Die Wiederholungs- und Exonregionen wiesen die höchsten CG-Methylierungsgrade auf, wohingegen die 5'-UTR-Region die niedrigsten CG-Methylierungsgrade aufwies (Abb. 3D). Zwischen der Normal- und der Speckle-Gruppe wurden insgesamt 2788 differenziell methylierte Regionen (DMRs) identifiziert. Die DMRs befanden sich hauptsächlich in den Introns (47,45 %), gefolgt von der intergenen Region (36,05 %), dem Exon (8,29 %), dem Promotor (5,95 %), 3′-UTR (1,18 %) und 5′-UTR ( 0,97 %) Regionen (Abb. 4). Darüber hinaus wurden 282 differentiell methylierte Gene (DMGs) identifiziert, darunter 172 hypermethylierte und 74 hypomethylierte Gene in der Promotorregion. Darüber hinaus wurden 36 DMGs im Genkörper gefunden, darunter 30 hypermethylierte Gene und sechs hypomethylierte Gene. Wir haben DMGs in ihre menschlichen Orthologen umgewandelt und 158 Gensymbole erhalten, die zur funktionalen Annotation, Genontologie (GO) und Signalweganalyse in Metascape hochgeladen wurden. Die Gene wurden in 176 biologischen GO-Prozessen angereichert, einschließlich der Regulierung der zellulären Reaktion auf Wachstumsfaktorreize und der T-Zell-vermittelten Immunität, der Reaktion auf oxidativen Stress und der zellulären Reaktion auf DNA-Schädigungsreize.

Abb. 3 Der Gesamtmethylierungsgrad bei Hühnern, die Speckleier und normale Eier legen. Eine Korrelationsanalyse der Methylierungsgrade zwischen Proben aus den beiden Gruppen. B Hauptkomponentenanalyse des Methylierungsgrads aller Proben. C Histogramm des Methylierungsniveaus der Cytosinstelle in den beiden Gruppen. D Liniendiagramm der Methylierungsgrade verschiedener Genomregionen. Die genomischen Regionen jedes Gens wurden in 20 Bins unterteilt; Anschließend wurde der Methylierungsgrad der Cytosinstelle der entsprechenden funktionellen Regionen aller Gene gemittelt.

Abb. 4 Histogramm der Annotation von differentiell methylierten Regionen (DMRs) in genomischen Funktionsregionen

Abb. 5 A GO-Begriffe von DMGs. B Die Beziehung zwischen Genexpression und DNA-Methylierungsgraden in der Speckle-Gruppe. C Die Beziehung zwischen Genexpression und DNA-Methylierungsgraden in der normalen Gruppe. D Venn-Diagramm überlappender Gene zwischen DEGs und DMGs

Die Signalweganalyse zeigte, dass die Gene in 19 Signalwegen der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) angereichert waren, darunter RNA-Abbau, Entzündungsmediator-Regulierung von TRP-Kanälen und der TNF-Signalweg. Darüber hinaus wurden 25 Gensätze nachgewiesen, darunter die Signalübertragung durch Rho-GTPasen, den RHO-GTPase-Zyklus und den CDC42-GTPase-Zyklus. Die Top 20 der angereicherten Ontologiecluster sind in Abb. 5A dargestellt. Von den 158 homologen menschlichen Genen standen 15 im Zusammenhang mit Alterung oder Langlebigkeit (Ergänzungstabelle S6). Eine integrative Analyse der Daten zur Bisulfitsequenzierung des gesamten Genoms (WGBS) und der RNA-Seq wurde durchgeführt, um die Beziehung zwischen DNA-Methylierung und Genexpressionsniveaus zu bestimmen (Abb. 5B und C). Es gab eine negative Korrelation zwischen DNA-Methylierung und Genexpressionsniveaus stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle (TSS) und stromabwärts der Transkriptionsterminationsstelle (TTS); Es gab jedoch keine Korrelation zwischen der DNA-Methylierung und den Genexpressionsniveaus im Genkörper. Das Venn-Diagramm zeigte, dass BFSP2 das einzige überlappende Gen zwischen DMGs und DEGs war (Abb. 5D).

Diskussion

Mehrjährige Studien haben gezeigt, dass die Bildung von Flecken auf Eierschalen vererbbar ist und dass ältere Legehennen häufiger gesprenkelte Eierschalen produzieren als jüngere Hühner [6]. Das Altern von Legehennen geht häufig mit chronischen Entzündungen und oxidativem Stress einher [25, 26]. Die Blutparameter von Tieren spiegeln ihren physiologischen und Ernährungszustand wider. SOD, GSH-PX, GSH, CAT und T-AOC sind Bestandteile des antioxidativen Abwehrsystems. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie deuten darauf hin, dass es keinen signifikanten Unterschied in der antioxidativen Kapazität älterer Hühner zwischen der Speckle- und der Normalgruppe gab, was im Widerspruch zu den Erkenntnissen von Moreno und Osorno steht [27]. Moreno berichtete, dass Vögel, die Eier mit gesprenkelten Schalen legen, aufgrund der prooxidativen Funktion der Hauptkomponente der Sprenkel unter physiologischem Stress leiden können und eine höhere Toleranz gegenüber oxidativem Stress haben [28]. Die Unterschiede in den Ergebnissen könnten auf die unterschiedlichen Arten zurückgeführt werden, die in den Studien verwendet wurden.

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Immunglobuline sind Proteine, die an entzündungshemmenden Prozessen beteiligt sind und eine regulatorische Rolle bei Entzündungsreaktionen spielen [29]. Eine frühere Studie zeigte, dass Blaumeisenvögel, die gesprenkelte Eier legen, niedrige Gesamtimmunglobulinwerte aufweisen [30]. In ähnlicher Weise zeigten die Ergebnisse der vorliegenden Studie, dass Vögel in der Speckle-Gruppe im Vergleich zu denen in der normalen Gruppe wesentlich niedrigere Serum-IgA-Spiegel aufwiesen, was darauf hindeutet, dass Hühner in der Speckle-Gruppe möglicherweise eine geringere entzündungshemmende Fähigkeit haben, was mit dem übereinstimmt Erkenntnisse von Martínez und Merino [30]. IgA hat als einer der wichtigen Indikatoren bei der Bewertung der humoralen Immunfunktion von Geflügel antivirale, antibakterielle und antitoxinbezogene Funktionen [31]. Studien haben gezeigt, dass eine Nahrungsergänzung mit Hefe-Glucan den IgA-Gehalt im Serum erhöhen kann. Der erhöhte IgA-Gehalt kann die Fähigkeit einer Person, die Immunhomöostase aufrechtzuerhalten, verbessern, was möglicherweise zu gesundheitlichen Vorteilen führt [32]. Studien haben auch gezeigt, dass mit zunehmendem Alter die Resistenz von Legehennen gegenüber äußeren Krankheitserregern abnimmt [33]. Wenn Krankheitserreger in den Körper älterer Legehennen gelangen, kann das Schleimhautabwehrsystem des Eileitergewebes aufgrund der damit einhergehenden Abnahme der Immunität geschädigt werden [34]. Ein höherer IgA-Spiegel kann jedoch die Fähigkeit des Körpers erhöhen, die Immunhomöostase aufrechtzuerhalten, wodurch das Eindringen von Krankheitserregern in das Submukosagewebe des Eileiters verhindert und so eine gute Eierschalenqualität aufrechterhalten wird. Darüber hinaus identifizierte die RNA-Seq-Analyse sieben DEGs zwischen der Speckle- und der Normalgruppe, darunter IQSEC3, BFSP2, TMOD4, LOC112530987, GABRA2, TRIQK und ein Pseudogen. IQSEC3, ein Mitglied der Familie der Brefeldin A-resistenten ARF-Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) [35, 36], fördert die Entwicklung inhibitorischer Synapsen durch Bindung an Gephyrin [37]. IQSEC3 ist funktionell wichtig für die Aufrechterhaltung der Netzwerkaktivität in vivo. Der Abbau von IQSEC3 im Gyrus dentatus des Hippocampus bei Nagetieren verringert die Dichte der GABAergen Synapsen und erhöht die Anfälligkeit für schwere Anfälle [38]. Es liegen jedoch keine Studien zur Funktion von IQSEC3 bei Geflügel vor.

Gamma-Aminobuttersäure (GABA) ist der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im Zentralnervensystem von Wirbeltieren [39] und kann die Struktur des Rezeptors und die Ionenpermeabilität des entsprechenden Rezeptors verändern [40]. GABA kann durch GABAA-R oder GABAB-R, die sich an der Eileiterwand befinden und an der Regulierung der tubulären Kontraktilität bei Kaninchen [39], Menschen [41] und Ratten [42] beteiligt sind, direkt auf tubuläre glatte Muskelzellen wirken. Studien haben gezeigt, dass GABRA1 eine wichtige Rolle bei der Eiproduktion spielt. Hohe Expressionsniveaus von GABRA1 können die Proliferation von Granulosazellen hemmen, die Zellapoptose verstärken und die Synthese und Sekretion von Progesteron hemmen, was zu einer verringerten Eiproduktion führt [43–45]. Der Legerhythmus von Legehennen ist ein neuromodulatorischer Prozess [46, 47]. Basierend auf diesen Ergebnissen spekulieren wir, dass es einen subtilen Zusammenhang zwischen der Bildung von Eierschalenflecken und dem Nervensystem gibt, obwohl der genaue Zusammenhang weiterer Untersuchungen bedarf.

TMOD4, ein Mitglied einer Familie von Proteinen, die die spitzen Enden von Aktinfilamenten bedecken [48], wird im Skelettmuskel und im Herzen exprimiert [49, 50]. Studien haben berichtet, dass TMOD4 in erwachsenen Hühnerlinsen, Erythrozyten und schnell zuckenden Skelettmuskelfasern vorhanden ist [51]. Es wurde festgestellt, dass TMOD4 am Zusammenbau, der Muskelkontraktion und der Differenzierung von Myofibrillen beteiligt ist [52–54]. Durch die Kontraktion des Eileitermuskels rotiert das Ei in der Gebärmutter, wodurch sich Pigmente gleichmäßig auf der Oberfläche der Eischale ablagern können. Wir spekulieren, dass die Bildung gesprenkelter Eier mit der Kontraktion der Eileitermuskulatur zusammenhängt, es sind jedoch weitere Untersuchungen erforderlich. GSEA wurde verwendet, um die biologische Funktion aller exprimierten Gene zu analysieren, um den Verlust einiger interessanter Gensätze durch die Cutof-Free-Strategie zu vermeiden. Die exprimierten Gene waren hauptsächlich im Calcium-Signalweg, der fokalen Adhäsion, dem MAPK-Signalweg und der neuroaktiven Ligand-Rezeptor-Interaktion angereichert. Es wurde berichtet, dass im Prozess der Eierschalenmineralisierung Gene, die mit dem Kalzium-Signalweg in Verbindung stehen, an der Absorption von Kalzium- und Karbonat-Ionen aus dem Blut beteiligt sind und über die Epithelzellen des Eileiters zur Gebärmutterflüssigkeit transportiert werden, um an der Eierschale teilzunehmen Mineralisierung [46, 55]. Wenn die Kalzium- und Karbonat-Ionen weiterhin in der Eischale mineralisieren, rotiert die Eizelle kontinuierlich in der Gebärmutter und der Eierschalenfarbstoff Protoporphyrin-IX kann sich gleichmäßig auf der Eierschalenoberfläche ablagern [56]. Wir spekulieren, dass der Unterschied in der Versorgung mit Carbonat- und Calciumionen zwischen den beiden Gruppen zu einer ungleichmäßigen Pigmentverteilung beim Ablagerungsprozess auf der Eierschalenoberfläche geführt haben könnte, was zu Eierschalenflecken führte.

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Fokale Adhäsionen sind makromolekulare Strukturen, die mechanische Verbindungen zwischen dem intrazellulären Aktin-Zytoskelett und extrazellulären Matrixkomponenten herstellen [57]. Es wurde gezeigt, dass fokale Adhäsionen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Morphologie und Funktion des Eileiters bei chinesischen Braunfröschen spielen [58], während fokale Adhäsionen auch am Mechanismus der Unterschiede in der Eiproduktion bei Jinghai-Gelb- und Nandan-Yao-Hühnern beteiligt sind Haushühner [59, 60]. In der aktuellen Studie waren fokale Adhäsionen an der Bildung von Eierschalenflecken beteiligt, der spezifische Beteiligungsmechanismus bedarf jedoch noch weiterer Untersuchungen. Der MAPK-Weg hat drei herausragende Mitglieder: p38-Mitogen-aktivierte Proteinkinase (p38 MAPK), Jun N-terminale Kinase (JNK) und extrazelluläre Antwortkinase (ERK), die zusammen Zellwachstum, Differenzierung, Apoptose, Entzündung und andere regulieren wichtige physiologische Reaktionen [61]. Es wurde gezeigt, dass der ERK 1/2 MAPK-Weg eine wichtige Rolle beim Wachstum, der Entwicklung und der Differenzierung des Eileiters und der Gebärmutter spielt [62]. Wang et al. verwendeten Vanadium, um das Wachstum von Eileiterepithelzellen zu induzieren, und stellten fest, dass Mitglieder der MAPK-Familie aktiviert wurden, was zu oxidativem Stress des Eileiters, verringerter Zellaktivität und Zellapoptose führte [63]. In der aktuellen Studie stellten wir fest, dass der MAPK-Signalweg in der gesprenkelten Gruppe erheblich angereichert war, und spekulieren daher, dass die Hühner, die gesprenkelte Eier legten, möglicherweise einem gewissen Stress ausgesetzt waren, der sich auf den Eileiter auswirkte. Neuroaktive Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen hängen mit der Steroidhormonsynthese in den Gonaden zusammen. Sie spielen eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der Eiproduktion und der Eierstockfunktion bei Geflügel [59, 64]. Das differentiell exprimierte Gen GABRA2 gehört ebenfalls zum neuroaktiven Ligand-Rezeptor-Interaktionsweg. Da Eierschalenflecken als Folge der Eierproduktion auftreten und die Eierproduktion ein rhythmischer Prozess ist, lässt die erhebliche Anreicherung neuroaktiver Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen in der gesprenkelten Gruppe vermuten, dass es Unterschiede in der Eierproduktionsleistung zwischen Hühnern geben könnte, die gesprenkelte Eier legen und Hühner, die normale Eier legen, aber dies erfordert weitere Untersuchungen.

Umweltfaktoren können die Genexpression über epigenetische Veränderungen beeinflussen. Die Kombination genetischer und epigenetischer Veränderungen könnte hilfreich sein, um den Entstehungsmechanismus komplexer Merkmale zu erklären [19, 65]. Der Zusammenhang zwischen genomweiter DNA-Methylierung und Genexpression wird seit Jahren untersucht [66, 67]. Im Allgemeinen unterdrückt die DNA-Methylierung die Genexpression [68]. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie stimmen insofern mit früheren Erkenntnissen überein, als hohe Genexpressionsniveaus mit einer geringen DNA-Methylierung in der Promotorregion verbunden sind (67, 68). Allerdings wurde in der Genkörperregion kein offensichtlicher Trend beobachtet, was daran liegen könnte, dass Genexpressionsmuster auch durch andere Faktoren reguliert werden [69, 70]. Die Analyse der funktionellen Anreicherung ergab, dass DMGs hauptsächlich bei der T-Zell-vermittelten Immunität, der Reaktion auf oxidativen Stress und der zellulären Reaktion auf DNA-Schadensreize angereichert waren und dass die meisten Wege mit dem Altern verbunden sind [71–73]. Es wurden auch andere altersbedingte Gene identifiziert, darunter GCLC (74), CAV1 (75) und LYN (76). Eine Kombination aus Transkriptom- und DNA-Methylierungsdaten zeigte, dass BFSP2 das einzige überlappende Gen war und sowohl auf DNA-Methylierungs- als auch auf transkriptomischer Ebene signifikant exprimiert wurde. BFSP2 war hypomethyliert und seine Expressionsniveaus waren in der Speckle-Gruppe niedrig, was darauf hindeutet, dass die Genexpression zusätzlich zur Methylierungsmodifikation durch andere Transkriptionsfaktoren reguliert wird. Darüber hinaus wurde BFSP2 als Kandidatengen bei autosomal-dominanten angeborenen Katarakten (77) und progressiver Katarakterkrankung (78) identifiziert. Obwohl gezeigt wurde, dass BFSP2 mit der Augenentwicklung bei Hühnern zusammenhängt [79], sind Studien zu anderen Funktionen bei Hühnern begrenzt. Daher sind weitere Studien erforderlich, um seine Rolle bei der Bildung gesprenkelter Eierschalen aufzuklären.

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Schlussfolgerungen

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Immunindizes im Serum darauf hinweisen, dass der IgA-Gehalt in der gesprenkelten Gruppe wesentlich niedriger war als in der normalen Gruppe, und wir spekulieren, dass eine verminderte Immunfunktion eng mit der Bildung von Eierschalen-Speckles zusammenhängt. Die Transkriptomanalyse ergab sieben DEGs zwischen der gesprenkelten und der normalen Gruppe, von denen IQSEC3, GABRA2 und BFSP2 als potenziell wichtige Gene identifiziert wurden, die mit der Bildung gesprenkelter Eier assoziiert sind. Die DNA-Methylierungsanalyse identifizierte DMGs, die mit der T-Zell-vermittelten Immunität, der Reaktion auf oxidativen Stress und der zellulären Reaktion auf einen DNA-Schadensreiz assoziiert sind. Von den 282 identifizierten DMGs waren 15 mit dem Altern verbunden. Eine integrative Analyse des Transkriptoms und der DNA-Methylierung ergab, dass das einzige überlappende Gen BFSP2 war, das bei Hühnern kaum untersucht wurde. Die hier präsentierten Daten legen nahe, dass die Immun- und Alterungsprozesse von Legehennen zur Bildung gesprenkelter Eierschalen beitragen können, was unser Verständnis des Mechanismus der Entstehung von Eierschalensprenkeln verbessert.

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