Teil 1 Echinacosid erhöht die Spermienmenge bei Ratten, indem es auf den Androgenrezeptor des Hypothalamus abzielt

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2

Männliche Unfruchtbarkeit ist ein großes Gesundheitsproblem mit einer geschätzten Prävalenz von 4,2 Prozent der männlichen Unfruchtbarkeit weltweit. Unsere frühen Arbeiten haben das gezeigtCistanche-ExtrakteSchutz vor Spermienschäden bei Mäusen und so weiterEchinacosid(ECH) ist eine der wichtigsten aktiven Komponenten. Hier berichten wir über eine wesentliche Rolle von ECH, einem Naturprodukt, das Oligoasthen-Aspermie bei Ratten umkehrt oder davor schützt. ECH wurde durch HPLC getestet, die Quantität und Qualität der Spermien wurden bewertet und die Hormonspiegel wurden durch einen Radioimmunosorbent-Assay bestimmt. ECH reduzierte die Konzentrationen des Androgenrezeptors (AR) und wichtiger steroidogener Gene, wie durch Western Blot und qPCR-Analyse bestimmt. Die Wechselwirkung zwischen ECH und AR wurde durch indirekten ELISA und molekulares Docking bewertet. Die Ergebnisse zeigen, dass ECH in Kombination mit hypothalamischem AR in der Tasche von Met-894 und Val-713 den Transfer von AR aus dem Zytoplasma in die Kerne im Hypothalamus hemmt. Während die negative Rückkopplung der Sexualhormonregulation gehemmt wurde, wurde die positive Rückkopplung stimuliert, um die Sekretion von luteinisierendem Hormon und Testosteron zu erhöhen, wodurch die Spermienmenge erhöht wurde. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass ECH die AR-Aktivität im Hypothalamus blockiert, um die Spermienmenge zu erhöhen und Ratten vor Oligoasthenospermie zu schützen.

Die Produktion von Testosteron in Hodenzellen wird stark durch die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse (HPG) reguliert, indem sie eine homöostatische Rückkopplungsschleife bildet1. Das vom Hypothalamus ausgeschüttete Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) kann die Ausschüttung des luteinisierenden Hormons (LH) aus der Hypophyse stimulieren, was eine weitere Stimulierung bewirktTestosteronProduktion in testikulären Leydig-Zellen. Testosteron wird durch eine Reihe von steroidogenen Enzymen biosynthetisiert. Als einer der Hauptwege kann das steroidogene akute regulatorische Protein (StAR) Cholesterin aus intrazellulären Quellen in die Mitochondrien2 transportieren, wo es dem Cholesterin-Seitenkettenspaltungsenzym (CYP11A1), 3 -Hydroxysteroiddehydrogenase (HSD3), { {6}}Hydroxylase (CYP17A1) und 17 -Hydroxysteroiddehydrogenase (HSD 17 ), die die Umwandlung von Cholesterin in Testosteron katalysieren3,4. Testosteron koppelt sich dann negativ an das HPG-Element zurück, um die weitere LH-Sekretion dosisabhängig herunterzuregulieren. Die Wirkung von Testosteron auf die Rückkopplungsschleife der HPG-Achse erfolgt durch Bindung an den Androgenrezeptor (AR), der sich sowohl im Hypothalamus als auch in der Hypophyse befindet5. Bei den Mäusen führt die Ablation des AR und die minimale Testosteronproduktion zu einem Anstieg des LH- und des follikelstimulierenden Hormons (FSH)6, was darauf hindeutet, dass AR an der Regulierung der negativen Feed-Loop beteiligt ist. Der klassische genomische Mechanismus vonTestosteronDie Signalübertragung erfolgt, wenn Testosteron in die Zelle diffundiert und an den AR bindet. Dieser Ligand-Rezeptor-Komplex wandert dann in den Zellkern, wo er an Androgen-Response-Elemente (AREs) in den regulatorischen Regionen Testosteron-responsiver Gene bindet, um deren Translokation zu modifizieren. Testosteron induziert auch den nicht-klassischen Weg der Steroidhormonwirkung, der durch schnelle Ereignisse gekennzeichnet ist, die zur Aktivierung von zytosolischen Signalkaskaden führen, die normalerweise durch Wachstumsfaktoren ausgelöst werden7,8. Klassische und nicht-klassische Testosteronwege tragen beide zur Aufrechterhaltung der Spermatogenese und Fruchtbarkeit bei. Die Funktion des AR ist jedoch im klassischen Weg wichtiger, da Testosteron die Spermienqualität erhöht. Echinacosid (ECH) ist eine der bioaktiven Komponenten, die aus der Heilpflanzenart Echinacea9 und gewonnen wirdCistanche10. Mit einem breiten Spektrum an pharmakologischen Aktivitäten sind Echinacea-Extrakte 1 Research Center of Modern Biotechnology, School of Biotechnology and Food Engineering, Anyang Institute of Technology, Anyang, Henan, 455000, China. 2 College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling, Shaanxi, 712100, China. 3Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph, Guelph, Ontario, N1G 2W1, Kanada. Korrespondenz und Materialanfragen sind an XZ zu richten

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eines der beliebtesten pflanzlichen Nahrungsergänzungsmittel in Europa und den USA, hauptsächlich aufgrund ihrer antioxidativen Eigenschaften11 und ihrer Fähigkeit, Erkältungen vorzubeugen12. Interessant,CistancheExtrakte und ECH werden in der traditionellen chinesischen Medizin traditionell als Stärkungsmittel zur Heilung von Fortpflanzungsstörungen und zur Steigerung der männlichen sexuellen Aktivität verwendet10. Einige OTC-Produkte vonCistanche-Extraktionwurden als Nahrungsergänzungsmittel entwickelt und erfreuen sich auf den Märkten für gesunde Lebensmittel in China und einigen anderen asiatischen Ländern zunehmender Beliebtheit (China Food and Drug Administration)13. Die zugrunde liegenden Mechanismen der ECH-Wirkung bleiben jedoch unklar. Männliche Unfruchtbarkeit ist ein großes Gesundheitsproblem mit einer geschätzten Prävalenz von 4,2 Prozent der männlichen Unfruchtbarkeit weltweit14. Die Diagnose männlicher Unfruchtbarkeit basiert derzeit auf der Untersuchung der Spermienqualität, einschließlich der Analyse von Samenparametern wie Spermienkonzentration, -beweglichkeit und -morphologie15. Das östrogenähnliche Bisphenol A (BPA) ist ein weit verbreiteter Umweltschadstoff, dessen Auswirkungen auf die männliche Fruchtbarkeit bei mehreren Tier- und Menschenarten untersucht wurden16. BPA stört die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse, hemmt die Expression testikulärer steroidogener Enzyme und die Synthese von Testosteron bei männlichen Welpen17, was einen Zustand des hypogonadotropen Hypogonadismus verursacht18. In dieser Studie untersuchen wir die Auswirkungen von ECH auf die Spermienqualität und den Hormonspiegel. Darüber hinaus wurde BPA als Modellmittel für Spermienverletzungen ausgewählt, um die Schutzwirkung von ECH gegen schlechte Spermienqualität weiter zu untersuchen.

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Ergebnisse

ECH erhöht die Spermienmenge.

Die Anzahl der Spermien in der Cauda epididymis, die Lebensfähigkeit der Spermien und die Beweglichkeit der Spermien sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Behandlung mit 80 mg/kg ECH und 15 mg/kg Testosteronpropionat (TP) erhöhte die Anzahl der epididymalen Spermien signifikant. Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied in der Spermienlebensfähigkeit und Spermienmotilität.

ECH erhöht die Testosteron- und LH-Spiegel im Serum, Gehirn plus Hypophyse und Hoden.

Die ECH-Behandlung erhöhte die LH-Spiegel im Serum, Enzephalon plus Hypophyse und Hoden merklich (Fig. 1A). In der ECH(H)-Gruppe erhöhten sich die LH-Spiegel signifikant um das 1,1--Fache im Serum, um das 1,4--Fache im Gehirn plus Hypophyse und um das 1,2--Fache in den Hoden. Testosteron war signifikant um das 1,5- und 1,3--fache im Enzephalon plus Hypophyse bzw. Hoden erhöht, jedoch nicht im Serum nach der ECH(H)-Behandlung. Nach der TP-Behandlung waren die Testosteronspiegel signifikant um das 1,6-, 1,8- und 1,4--fache im Serum, Gehirn plus Hypophyse und Hoden erhöht.

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ECH erhöhte die Genexpression des steroidogenen Enzyms.

EMdie Expression wichtiger steroidogener Enzyme im Hoden signifikant erhöht (Abb. 1B). Die mRNA-Spiegel von CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 und HSD17 in der ECH(H)-Gruppe waren mehr als 3--fach erhöht, während die StAR-mRNA-Spiegel bei allen keine signifikanten Unterschiede zeigtenEMtreatments (p>0.05). TP veränderte die Expression von CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 und HSD17 nicht signifikant. Dies spiegelt sich in einer umfassenden Heatmap-Analyse der Wirkung von ECH auf die Expression von steroidogenen Enzymen wider, die darauf hinweistEMsignifikant erhöhte mRNA-Spiegel von CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 und HSD17 und insbesondere HSD3 1/2 (Fig. 1C).

ECH kann die Blut-Hirn-Schranke und in geringerem Maße die Blut-Hoden-Schranke passieren.

Um die Androgen-Rückkopplungsschleife an der HPG-Achse zu bewerten, ist die Fähigkeit vonEMEintritt in den Hypothalamus wurde in einer Reihe von PK-Studien untersucht.EMKonzentrationen wurden im Hypothalamus nach 12 Stunden einmaliger oraler Verabreichung von 30 mg/kg ECH nachgewiesen, und ECH zeigte eine ausgeprägte Hypothalamus-Penetranz mit einem mittleren Hypothalamus/Plasma-Verhältnis von 33,92 Prozent (Abb. 2A). Te T1/2-Werte betrugen 2,61 ± 0,42 h und 1,88 ± 0,22 h im Plasma bzw. im Hypothalamus (Abb. 2B). Unter Verwendung von HPLC wurde jedoch ein sehr begrenzter Zugang von ECH in die Hoden festgestellt. Die Konzentrationen von ECH in Hoden waren 0.{{20}}83 ug/ml, 0,043 ug/ml und 0,028 ug/ml jeweils 0,5 h, 1 h und 1,5 h nach der Behandlung.

ECH reduziert die hypothalamische AR-Translokation zum Kern.

Um die Wirkung zu testenEMBei der AR-Translokation wurde die Expression von AR im Zytoplasma und Kern von Hoden und Hypothalamus mittels Western-Blot-Analyse bestimmt. Wie in 3A gezeigt, regulierte ECH das AR-Protein in den Kernen des Hypothalamus im Vergleich zur Kontrollgruppe um das Fünffache herunter. Die Behandlung mit Enzalutamid, einem AR-Inhibitor, senkte die Spiegel des AR-Proteins in den Kernen des Hypothalamus um das 4,8--Fache. Bemerkenswerterweise war die zytoplasmatische AR bei der ECH-Behandlung und Enzalutamid-Behandlung höher als bei den Kontrollen, was darauf hindeutetEMblockiert den AR-Transport vom Zytoplasma zum Zellkern im Hypothalamus. Wie erwartet hemmt ECH den AR-Transport vom Zytoplasma zum Kern im Hoden nicht (Abb. 3B).

ECH erhöhte die Expression von HPG-Achsen-verwandten Genen.

EMerhöhte signifikant die Expression von LH, LHR, GnRH 1 und Gnrhr in den Mischungspools von Enzephalon plus Hypophyse, jedoch gab es keinen signifikanten Unterschied in den GnRH 1 -Spiegeln nach der TP-Behandlung. Die Heatmap-Analyse zeigt, dass die Expression von GnRH 1 und LH unter den HPG-Achsen-verwandten Genen am höchsten war.

AR ist ein Ziel von ECH.

Um die Beziehungen zwischen ECH und AR zu bestätigen, wurde ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) erfolgreich synthetisiert (Abb. 5A, B). Das Molekulargewicht von ECH-OVA ist größer als das von OVA, daher haben sie unterschiedliche Mobilitätsraten (Abb. 5A), und der Absorptionspeak von ECH-OVA liegt zwischen ECH und OVA (Abb. 5B).

was darauf hindeutet, dass ECH erfolgreich an OVA konjugiert wurde. Indirekte ELISA-Ergebnisse (Fig. 5C) zeigen, dass Anti-AR-Antikörper in der Lage ist, AR-Protein nachzuweisen, das in Vertiefungen vorhanden ist, die ECH-OVA enthalten (angezeigt durch Anti-OVA-Antikörper), was darauf hindeutet, dass ECH an AR-Protein binden kann.

ECH kombiniert mit AR-Pocket von Met-894 und Val-713.

Die Verbindung ECH wurde an die AF2-Stelle auf der Oberfläche des menschlichen AR angedockt, und der theoretische Bindungsmodus von ECH und AR wurde in Fig. 5D gezeigt. Die Verbindung ECH nahm eine kompakte Konformationsbindung an der Tasche des menschlichen AR an. Die beiden Phenylgruppen von ECH binden an die hydrophobe Domäne der AR-Tasche und halten enge hydrophobe Kontakte mit den Resten Leu-712, Val-716, Met-734, Ile-737 , Met-894 und Ile-898, während die anderen beiden Seiten von ECH am Eingang der Tasche positioniert waren und nur wenige Kontakte machten. Eine detaillierte Analyse zeigte, dass sowohl Met-894 (Bindungslänge: 2,4 Å) als auch Val-713 (Bindungslänge: 2,7 Å) Wasserstoffbrückenbindungen mit den Hydroxylgruppen des ECH bildeten, was die Hauptwechselwirkung zwischen ECH war und menschliche AR.

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ECH dämpft BPA-induzierte reproduktive Schäden.

Um die Wirkung von ECH auf reproduktive Schäden zu untersuchen, wurden die Spermienqualität und die Spiegel von Sexualhormonen und steroidogenen Enzymen bei BPA-induzierten Mäusen untersucht. Wie in Abb. 6 gezeigt, verringerte die BPA-Behandlung die Anzahl der Spermien und die Beweglichkeit der Spermien signifikant um 26,5 Prozent bzw. 39,2 Prozent. Die ECH-Verabreichung verhinderte die Abnahme der Spermienzahl und Spermienbeweglichkeit um 35,5 Prozent bzw. 30,1 Prozent. Die BPA-Verabreichung führte auch zu einer signifikanten Abnahme der LH- und T-Sekretion, und ECH erhöhte die LH- und T-Spiegel erheblich um 24,1 Prozent bzw. 18,3 Prozent im Vergleich zur BPA-Behandlung allein (Abb. 6A, B). Die mRNA-Spiegel von StAR, CYP17A1, 3 -HSD und 17 -HSD bei der BPA-ECH-Behandlung waren im Vergleich zur BPA-Behandlung signifikant erhöht (Fig. 6C, D).