TEIL 2 Echinacosid hemmt die Glutamatfreisetzung durch Unterdrückung des spannungsabhängigen Ca2 plus-Eintritts und der Proteinkinase C in zerebrokortikalen Nervenenden von Ratten

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3. Diskussion

In dieser Studie wurde Echinacosid, ein Wirkstoff inHerba Cistanche, hemmte die durch 4-Aminopyridin hervorgerufene Glutamatfreisetzung in den Nervenenden der Großhirnrinde der Ratte. Die möglichen zugrunde liegenden Mechanismen für die Echinacosid-vermittelte Hemmung der Glutamatfreisetzung werden hier weiter untersucht und diskutiert.

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3.1. Mechanismen, die der durch Echinacosid vermittelten Hemmung der Glutamatfreisetzung zugrunde liegen Glutamatfreisetzung

hervorgerufen durch 4--Aminopyridin besteht aus zwei Komponenten: einer physiologisch relevanten Ca2+-abhängigen Komponente, die durch Exozytose von Glutamat enthaltenden synaptischen Vesikeln produziert wird; und eine Ca2+-unabhängige Komponente, die von einer verlängerten Depolarisation herrührt, die eine Membranpotential-vermittelte Verschiebung des Glutamat-Transporters im Steady-State nach außen verursacht und somit den zytosolischen Glutamat-Efflux beeinflusst [31]. Hier haben wir das beobachtetEchinacosidhemmten die durch 4-Aminopyridin hervorgerufene Glutamatfreisetzung in Gegenwart eines Ca2+-freien Mediums (Ca2+-unabhängige Freisetzung) nicht signifikant. Darüber hinaus die beobachtetEchinacosid-vermittelte Hemmung der durch 4--Aminopyridin hervorgerufenen Glutamatfreisetzung wurde durch Bafilomycin A1 (das den Glutamatgehalt synaptischer Vesikel verringert), aber nicht durch DL-TBOA (das nichtselektiv alle exzitatorischen Aminosäuretransporter-Subtypen hemmt) verhindert. Darauf deuten diese Ergebnisse hinEchinacosidbeeinflusst die Ca2 plus -abhängige Exozytose der Glutamatfreisetzung, ohne den Ca2 plus -unabhängigen zytosolischen Ausfluss von Glutamat durch die Umkehrung des Plasmamembran-Glutamattransporters der Nervenenden zu beeinflussen. In synaptischen Terminals stabilisiert die Hemmung des Na-plus-Kanals oder die Aktivierung des K-plus-Kanals die Membranerregbarkeit und reduziert folglich den evozierten Ca2-plus-Eintrag und die Freisetzung von Neurotransmittern [32,33]. Daher liegt der mögliche Mechanismus zugrundeEchinacosid-vermittelte Hemmung der Glutamatfreisetzung beinhaltet eine Verringerung der synaptosomalen Erregbarkeit. Diese Möglichkeit ist jedoch aufgrund von zwei Beobachtungen unhaltbar: (1) Die durch 4--Aminopyridin hervorgerufene Membranpotentialdepolarisation, gemessen mit dem membranpotentialempfindlichen Farbstoff DiSC3(5), wurde durch die Zugabe von nicht beeinflußtEchinacosid; und (2) Echinacosid beeinflusste nicht die durch 4--Aminopyridin hervorgerufene Ca2 plus -unabhängige Glutamatfreisetzung, eine Freisetzungskomponente, die nur vom Membranpotential abhängt [31]. Wenn die Wirkung nicht durch die Unterdrückung der synaptosomalen Erregbarkeit verursacht wird, kann sie sich durch eine Verringerung der Aktivität von Ca2 plus-Kanälen Cav2.2 (N-Typ) und Cav2.1 (P/Q-Typ) in Verbindung mit einer Glutamat-Exozytose in manifestieren Nervenendigungen [34–36]. Durch die Verwendung von fura-2 demonstrieren wir diesEchinacosidreduziert signifikant den durch 4-Aminopyridin hervorgerufenen Anstieg der Ca2+-Konzentration. Darüber hinaus zeigen unsere Daten, dass die hemmende Wirkung vonEchinacosidauf 4--Aminopyridin evozierte Glutamatfreisetzung sank von 42,4 Prozent ˘ 2,3 Prozent auf 12,1 Prozent ˘ 3,9 Prozent nach Exposition gegenüber einem Blocker von Cav2.2 (N-Typ) und Cav2.1 (P/Q-Typ) Ca2 plus Kanäle. Außerdem haben wir das beobachtetEchinacosidweiterhin signifikant die durch 4-Aminopyridin hervorgerufene Glutamatfreisetzung in Gegenwart von Inhibitoren der intrazellulären Ca2-Plus-Freisetzung. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die gleichzeitige Unterdrückung von Cav2.2 (N-Typ) und Cav2.1 (P/Q-Typ) Ca2 plus Kanalaktivität der zugrunde liegende potenzielle Mechanismus istEchinacosid-vermittelte Hemmung der Glutamatfreisetzung. Jedoch konnte die kombinierte Aktivierung von Cav2.2 (N-Typ) und Cav2.1 (P/Q-Typ) Ca2 plus Kanalaktivität die Wirkung von Ca2 nicht blockierenEchinacosidvollständig. Daher können andere, nicht identifizierte Arten von Ca2+-Kanälen oder andere präsynaptische Wege an der Hemmung beteiligt sein. Beispielsweise sind GABAA-Rezeptoren auf präsynaptischer Ebene vorhanden, und ihre Aktivierung hemmt nachweislich den Ca2-plus-Einstrom und die Glutamatfreisetzung [37]. In der vorliegenden Studie blockierten die GABAA-Rezeptorantagonisten SR95531 und Bicucullin nicht die Echinacosid-vermittelte Hemmung der Glutamatfreisetzung, was darauf hindeutet, dass GABAA-Rezeptoren nicht an der Verringerung der spannungsabhängigen Ca2-plus-Kanalaktivität und an der anschließenden Hemmung der Glutamatfreisetzung beteiligt sind.

Der Eintritt von Ca2 plus durch spannungsabhängige Ca2 plus-Kanäle aktiviert mehrere Proteinkinasen, die mit der Glutamatfreisetzung in Nervenenden verbunden sind, einschließlich der mitogenaktivierten Proteinkinase, Proteinkinase C und Proteinkinase A. Hier zeigen wir, dass Proteinkinase-C-Inhibitoren dieEchinacosid-vermittelte Hemmung der Glutamatfreisetzung; dennoch war der mitogenaktivierte Proteinkinase-Inhibitor PD98059 oder der Proteinkinase-A-Inhibitor H89 unwirksam. Außerdem das. J.Mol. Wissenschaft. 2016, 17, 1006 8 von 13 4-aminopyridin-induzierter Phosphorylierung von Proteinkinase C nahm in Synaptosomen nach Vorbehandlung mit abEchinacosidin einer Konzentration, die zur Hemmung der Glutamatfreisetzung wirksam ist. Daher ist der Signalweg derEchinacosid-vermittelte Hemmung der Glutamatfreisetzung kann Proteinkinase C beinhalten. Proteinkinase C ist ein wichtiges intrazelluläres Signalsystem, das auf präsynaptischer Ebene vorhanden ist und eine entscheidende Rolle bei der Exozytose von Neurotransmittern spielt. Zum Beispiel werden mehrere synaptische Proteine, die am Transport von synaptischen Vesikeln oder an der Rekrutierung und Exozytose beteiligt sind, wie das myristoylierte Alanin-reiche C-Kinase-Substrat, durch Proteinkinase C phosphoryliert [38,39]. Dieser Phosphorylierungsprozess kann durch depolarisationsstimulierten Ca2+-Eintrag gesteigert werden, was die Glutamatfreisetzung erleichtert [40]. Daher können wir vernünftigerweise spekulieren, dass die hemmende Wirkung vonEchinacosidDer hier beobachtete Ca2 plus-Eintrag kann die Proteinkinase-C-Aktivität und folglich die Glutamatfreisetzung verringern.

3.2. Therapeutische Implikationen

Exzitotoxizität, ein pathologischer Prozess, der durch übermäßige Glutamatfreisetzung und Glutamatrezeptoraktivierung verursacht wird, ist die Hauptursache für neuronalen Tod bei akuten und chronischen Hirnerkrankungen wie Schlaganfall, traumatischen Hirnverletzungen, Parkinson- und Alzheimer-Krankheiten [13,41] und therapeutischen Strategien die Hemmung der Glutamatfreisetzung beinhalten, könnten vielversprechende neuroprotektive Strategien zur Behandlung solcher Krankheiten sein.EchinacosidEs wurde bestätigt, dass es die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​durchdringt und neuroprotektive Wirkungen in verschiedenen In-vivo-Modellen der Neurotoxizität zeigt [8,10–12,42]. Obwohl der Mechanismus dieser neuroprotektiven Wirkungen nicht vollständig verstanden ist, wurde über mehrere mögliche Mechanismen berichtet, darunter die Hemmung der Entzündungsreaktion, die Stabilisierung der mitochondrialen Funktion, die Antioxidation, das Einfangen freier Radikale und die Nachahmung neurotropher Funktionen [5,9,12,42]. In der aktuellen Studie könnte die Fähigkeit von Echinacosid, die Glutamatfreisetzung aus den Nervenenden zu reduzieren, auch teilweise seinen neuroprotektiven Mechanismus erklären. Ob diese Wirkung jedoch zu dem offensichtlichen therapeutischen Potenzial von Echinacosid bei Hirnerkrankungen im Zusammenhang mit Glutamat-Exzitotoxizität beiträgt, rechtfertigt weitere Forschung.

4. Materialien und Methoden

4.1. Chemikalien

Fura-2-acetoxymethylester (Fura-2-AM) und 3',3',3'-Dipropylthiadicarbocyaniniodid [DiSC3(5)] wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) gekauft. ω-Conotoxin MVIIC, Rottlerin,2-[1-(3-Dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(Indol-3-yl) Maleimid ( GF109203X), 5,6,7,13-tetrahydro-13-methyl-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pyrrolo[3,{ {27}}c]Carbazol-12-propannitril (Go6976) und N-[2-(p-Bromocinnamylamino)ethyl]-5-isochinolinsulfonamid (H89) wurden von TocrisBioscience (Bristol, UK) bezogen. Echinacosid, Dantrolen, DL-threo-beta-Benzyloxyaspartat (DL-TBOA), 7-Chlor-5-(2-Chlorpheny)-1,5-Dihydro -4,1-Benzothiazepin-2(3H)-on (CGP37157), 2-(2-amino-3-methoxyphenyl)-4 H-1-Benzopyran-4-one) (PD98059), Ethylenglykolbis(-aminoethylether)-N,N,N1,N1-tetraessigsäure (EGTA) und alle anderen Reagenzien wurden gekauft von Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA).

4.2. Tiere

Es wurden zwei Monate alte männliche Sprague-Dawley-Ratten verwendet. Die Tiere wurden unter standardisierten Umgebungsbedingungen (22 ˘ 1 ˝C; 50 % relative Luftfeuchtigkeit; 12 h Hell-Dunkel-Zyklus) gehalten und hatten uneingeschränkten Zugang zu Futter und Wasser. Die Tiere wurden durch Enthauptung getötet und die Großhirnrinde wurde schnell bei 4 °C entfernt. Die experimentellen Verfahren wurden vom Fu Jen Institutional Animal Care and Utilization Committee (A10259) in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals genehmigt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren und eine minimale Anzahl von Tieren zu verwenden, die erforderlich ist, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen.

4.3. Synaptosomale Präparate

Synaptosomen wurden aus der Großhirnrinde von Ratten auf diskontinuierlichen Percoll-Gradienten gereinigt, wie zuvor beschrieben [43,44]. Kurz gesagt, das Gewebe wurde in einem Medium homogenisiert, das 0.32 M Saccharose (pH 7,4) enthielt, das Homogenat wurde 10 min bei 3000ˆ g (5{{25 }}00 rpm in einem JA 25.5 Rotor; Beckman Coulter, Inc., Miami, FL, USA) und 4 ˝C, und der Überstand wurde erneut für 12 min bei 14.500 ˆ g zentrifugiert ( 11,000 U/min in einem JA 25.5 Rotor). Das Pellet wurde vorsichtig in 0,32 M Saccharose (pH 7,4) resuspendiert, und ein Aliquot dieser synaptosomalen Suspension (2 ml) wurde auf einen 3 ml diskontinuierlichen Percoll-Gradienten gegeben, der 0,32 M Saccharose, 1 mM EDTA, 0,25 mM DL-Dithiothreitol und enthielt 3 Prozent, 10 Prozent und 23 Prozent Percoll (pH 7,4). Nach 7-minütiger Zentrifugation bei 32.500 g (16.500 U/min in einem JA 20.5-Rotor) bei 4 °C wurden die Synaptosomen zwischen den 10-prozentigen und den 23-prozentigen Percoll-Banden gewonnen und auf ein Endvolumen von 30 ml verdünnt HEPES-Puffermedium (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2¨ 6H2O, 1,2 mM Na2HPO4, 10 mM Glucose und 10 mM HEPES (pH 7,4)). Nach weiterer 10-minütiger Zentrifugation bei 27,000ˆ g (15.000 U/min in einem JA 25.5) wurde das Synaptosomen-Pellet in 3 ml HEPES-Puffermedium resuspendiert und der Proteingehalt mit einem Bradford-Assay bestimmt. Schließlich wurden 0,5 mg der Synaptosomen-Suspension in 10 ml HEPES-Puffermedium verdünnt und bei 3000°g (5000 U/min in einem JA 20.1-Rotor) für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Pellets mit den Synaptosomen wurden auf Eis gelagert und innerhalb von 4–6 h verwendet.

4.4. Glutamat-Freisetzung

Die Glutamatfreisetzung wurde wie zuvor beschrieben durch Online-Fluorimetrie untersucht [45,46]. Synaptosomale Pellets wurden in HEPES-Puffermedium (0,5 mg/ml) resuspendiert und bei 37 °C für 10 min in Gegenwart von 16 µM Rinderserumalbumin vorinkubiert, um alle freien Fettsäuren zu binden, die während der Vorinkubation aus Synaptosomen freigesetzt wurden. Ein 2--ml-Aliquot der Synaptosomen wurde in eine gerührte Küvette überführt, die 2 mM NADP plus , 50 Einheiten Glutamatdehydrogenase und 1,2 mM CaCl2 enthielt, und die FL-Fluoreszenz von NADPH wurde in einem Perkin-Elmer LS{{ 14}} Spektrofluorimeter (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, USA) bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 340 bzw. 460 nm. Da Synaptosomen einer elektrischen Stimulation nicht zugänglich sind, wurde der Kaliumkanalblocker 4-Aminopyridin verwendet, um die Glutamatfreisetzung zu stimulieren. 4--Aminopyridin destabilisiert das Membranpotential und es wird angenommen, dass es eine repetitive spontane Na+-Kanal-abhängige Depolarisation verursacht, die der in vivo-Depolarisation des synaptischen Endes sehr nahe kommt, die zur Aktivierung von spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen und zur Freisetzung von Neurotransmittern führt [47 ]. Die Daten wurden in 2-s-Intervallen erhalten. Am Ende jedes Experiments wurde ein Standard von exogenem Glutamat (5 nmol) hinzugefügt. Der Wert der durch die Standardaddition erzeugten FL-Fluoreszenzänderung wurde verwendet, um das freigesetzte Glutamat als Nanomol Glutamat pro Milligramm synaptosomales Protein (nmol/mg) zu berechnen. Die im Text angegebenen Freisetzungswerte sind Werte, die im Steady-State nach 5 min Depolarisation erreicht werden (nmol/mg/5 min). Kumulative Daten wurden mit Lotus 1-2-3-Tabellenkalkulationen (IBM, White Plains, NY, USA) und MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA) analysiert.

4.5. Plasmamembranpotential

Das Plasmamembranpotential wurde mit einem Membranpotential-empfindlichen Farbstoff, DiSC3(5) [48] bestimmt. Synaptosomen wurden in HEPES-Puffermedium resuspendiert und 2-ml-Aliquots wurden in eine gerührte Küvette mit 5 µM DiSC3(5) bei 37 °C in einem Perkin-Elmer-LS-55-Spektrofluorometer (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, USA). Nach 3-minütiger Äquilibrierung der Mischung wurde die FL-Fluoreszenz bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 646 bzw. 674 nm bestimmt. Die Daten wurden in 2-s-Intervallen gesammelt. Kumulative Daten wurden mit MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA) analysiert und in FL-Fluoreszenzeinheiten ausgedrückt.

4.6. Zytosolische Ca2 plus Konzentration ([Ca2 plus ]C)

Das [Ca2 plus ]C wurde mit dem Ca2 plus Indikator fura-2 gemessen. Synaptosomen (0,5 mg/ml) wurden in HEPES-Puffermedium mit 5 µM Fura-2 und 0,1 mM CaCl2 für 30 min bei 37 °C in einem gerührten Test vorinkubiert Rohr. Nach Fura-2-Beladung wurden Synaptosomen in einer Mikrozentrifuge für 30 s bei 3000ˆ g (5000 U/min) zentrifugiert. Die synaptosomalen Pellets wurden in einem HEPES-Puffermedium resuspendiert, und die synaptosomale Suspension wurde in einer thermostatisierten Küvette in einem Perkin-Elmer LS-55-Spektrofluorometer (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, USA) gerührt. CaCl 2 (1 mM) wurde nach 3 min zugegeben und weitere Zugaben wurden nach weiteren 10 min vorgenommen. Fluoreszenzdaten wurden bei Anregungswellenlängen von 340 und 380 nm (Emissionswellenlänge 505 nm) in Intervallen von 2 s akkumuliert. [Ca2 plus ]C (nM) wurde unter Verwendung von Kalibrierungsverfahren [49] und zuvor beschriebenen Gleichungen [50] berechnet. Kumulative Daten wurden mit MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA) analysiert.

4.7. Western-Blotting

Synaptosomen wurden in einem Lysepuffer (10 mM HEPES-Puffer, pH 7,4), 1 Prozent Triton X-100 und einer Protease-Inhibitor-Mischung homogenisiert. Lysate wurden durch Zentrifugation geklärt, und die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines Protein-Assay-Kits (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) bestimmt. Gleiche Proteinmengen wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt und auf die Nitrozellulosemembran übertragen. Die Membranen wurden mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 5 % fettarme Milch enthielt, blockiert und mit einem geeigneten primären Antikörper (Phosphoproteinkinase C (pan), 1:3000, NOVUS Biologicals Inc., Beverly, MA, USA) über Nacht inkubiert 4˝C. Nach dreimaligem Waschen in Tris-gepufferter Kochsalzlösung wurde die Membran dann mit dem sekundären Meerrettichperoxidase-konjugierten Antikörper (1:3000) für 1 h bei Raumtemperatur behandelt. Die Membranen wurden dann mindestens dreimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und unter Verwendung des verstärkten Chemilumineszenzsystems (Amersham, Buckinghamshire, UK) sichtbar gemacht. Ein Aliquot von Proben wurde geladen und mit einem Anti-PKC-Antikörper zum Nachweis von PKC als Ladekontrolle sondiert. Der Grad der Expression oder Phosphorylierung wurde anhand der Bandendichte bewertet, die durch Densitometrie quantifiziert wurde. Die densitometrische Quantifizierung der Banden wurde unter Verwendung der Syngene-Software (Synoptics, Cambridge, UK) analysiert.

4.8. Statistische Analyse

Die Daten wurden von einem einzigen synaptosomalen Präparat erhalten und waren nicht unabhängig voneinander. Um die Signifikanz der Wirkung eines Arzneimittels gegenüber einer Kontrolle zu testen, wurde ein zweiseitiger Student's t-Test verwendet. Wenn ein zusätzlicher Vergleich erforderlich war (z. B. ob eine zweite Behandlung die Wirkung von Echinacosid beeinflusste), wurde eine einfache ANOVA gefolgt von Tukey-Test verwendet. Die Analyse wurde über die Software SPSS (17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA) durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ˘ SEM ausgedrückt; die Signifikanz wurde bei p < 0,05="" für="" alle="" statistischen="" maße="">

5. Schlussfolgerungen

Das ist die erste Studie, die das belegtEchinacosidhemmt die Glutamatfreisetzung aus zerebrokortikalen Synaptosomen der Ratte, indem es den Einstrom von Ca2 plus durch Cav2.2- und Cav2.1-Kanäle reduziert, und diese Freisetzungshemmung ist wahrscheinlich zumindest teilweise von der Unterdrückung des Proteinkinase-C-Wegs abhängig. Der vorliegende Befund ist wertvoll, weil er einen neuen Einblick in die Wirkungsmechanismen von Echinacosid im Gehirn liefert.

Danksagungen:Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (MOST 103-2320-B-030-001 MY3) unterstützt.

Autorenbeiträge:Tzu Yu Lin und Su Jane Wang konzipierten und gestalteten die Experimente; Cheng Wei Lu führte die Experimente durch; Cheng Wei Lu und Shu Kuei Huang analysierten die Daten; Su Jane Wang schrieb die Zeitung.

Interessenskonflikte:Die Autoren geben keine Interessenkonflikte an.

Interessenkonflikte: Die Autoren geben keine Interessenkonflikte an.

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