Wirkung von Cistanche Tubulosa-Extrakten auf die männliche Fortpflanzungsfunktion bei Streptozotocin-Nicotinamid-induzierten diabetischen Ratten-Ⅰ

1. Einleitung

Diabetes mellitus (DM) ist eine Erkrankung, bei der es vermehrt zu Diabetes mellitus (DM) kommtGlukosespiegelim Blut aufgrund der Unfähigkeit der Bauchspeicheldrüse, ausreichend Insulin zu produzieren, oder der Unfähigkeit des Körpers, es effektiv zu nutzen. Nach Angaben der WHO stieg die Zahl der Menschen mit Diabetes von 108 Millionen im Jahr 1980 auf 422 Millionen im Jahr 2014 [1]. Es gibt vier Hauptkategorien: Prädiabetes (ein Stadium vor Diabetes), Typ 1 (bei dem die Bauchspeicheldrüse kein Insulin produziert), Typ 2 (der Körper kann kein Insulin verwenden) und Schwangerschaftsdiabetes (der während der Schwangerschaft auftritt). Oxidativer Stress entsteht durch das Ungleichgewicht zwischen der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und Antioxidantien [2] und führt schließlich zu Diabetes. Zu den Komplikationen von Diabetes zählen Nierenversagen, Nervenschäden, Blindheit, Schlaganfall, Herzinfarkt, Tod des Fötus und Unfruchtbarkeit. [1]. Studien zeigen, dass Spermienkerne, Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Mitochondrien bei männlichen Diabetikern erheblich geschädigt waren [3]. Oxidativer Stress während des Spermientransports verändert den Prozess des männlichen Fortpflanzungssystems [4,5].

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Der Prozess der Spermatogenese wird durch die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse (HPG) gesteuert. Das vom Hypothalamus produzierte Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) stimuliert die Produktion von luteinisierendem Hormon (LH) und follikelstimulierendem Hormon (FSH). Leydig-Zellen befinden sich neben dem Samenkanälchen undTestosteron produzierenunter der Kontrolle von LH. FSH löst die Produktion von Antigen-bindendem Protein (ABP) aus, das bei der Ausschüttung des männlichen Hormons hilft. Daher entstehen Unfruchtbarkeit und andere Probleme hauptsächlich aufgrund der Störungen, die in der HPG-Achse auftreten. Die Verabreichung der Kombination Streptozotocin-Nicotinamid löst bei Versuchsratten Diabetes aus. Streptozotocin ist eine chemische Verbindung, die für insulinproduzierende Zellen in der Bauchspeicheldrüse toxisch ist, und Nicotinamid ist ein wasserlösliches Vitamin, das die Zellen vor vollständiger Schädigung schützt [6].

Cistanche tubulosa ist eine Wüstenpflanzenart, die auch als „Rou Cong-Rong“ bekannt ist [7]. Es handelt sich um eine nicht-chlorophylle Parasitenpflanze, die hauptsächlich an der Wurzel des Calotropis procera-Baums wächst und in den trockenen Gebieten Gansu, Qinghai, Xinjiang, der Mongolei, Iran und Indien weit verbreitet ist. Der gebräuchliche Name für Cistanche tubulosa ist „Wüstenhyazinthe“. Es ist in der traditionellen chinesischen Medizin weithin anerkannt und trägt den Namen „Ginseng der Wüste“. Im medizinischen Bereich wird es häufig zur Behandlung von krankhaftem Leukorrhoe, starker Metrorrhagie, chronischen Nierenerkrankungen, Verstopfung, Impotenz und Unfruchtbarkeit eingesetzt. Chemische Bestandteile vonCistanche tubulosa besteht aus nichtflüchtigen Phenylethanoidglykosiden(PHGs), Iridoide, Lignane, ätherische Öle, Alditole, Oligosaccharide und Polysaccharide [8]. Das zeigen StudienEchinacosidaus diesem Kraut schützt den beschädigten Fibroblasten, indem es den ROS-Spiegel reguliert [9]. Diese Verbindung erzeugt antioxidative, gefäßentspannende und entzündungshemmende Aktivitäten zusammen mit Neuroprotektion und Osteoporoseprävention [10,11].

Ziel dieser Studie war es, die Wirkung von zu untersuchenCistanche tubulosa-Extraktmit ECH zur Fortpflanzungsstörung der Streptozotocin-Nicotinamid-induzierten diabetischen Ratte.

2. Materialien und Methoden

2.1. Materialien

ECH und CTE wurden von Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan) gekauft. Advanced Glycation End Products (AGEs) wurden von Biovision (San Francisco, CA, USA) bezogen. LC-540- und TM3-Zelllinien wurden vom Food Industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taiwan) erworben. Fünf Wochen alte männliche Sprague-Dawley (SD)-Ratten wurden vom National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) gekauft. Feed Lab Diet® wurde von PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan) gekauft. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) wurde von Sigma (St. Louis, MO, USA) erhalten. Methanol und 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) wurden ebenfalls von Sigma bezogen. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium/F12 und Trypsin-EDTA wurden von GIBCO (New York, NY, USA) bezogen. 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT), Dichlor-dihydro-fluoresceindiacetat (DCFH-DA), Dimethylsulfoxid (DMSO) und Nitroblautetrazolium (NBT) wurden von Sigma bezogen. Glucose-Enzym-Kits wurden von Kyokutoseiyaku, Tokio, Japan, bezogen. Insulin-ELISA-Kits wurden von Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Schweden) gekauft. Das T-PER-Gewebeprotein-Extraktionsreagenz wurde von Thermo Scientific (Chicago, IL, USA) erworben. Polyklonale Anti-Mensch-/Maus-/Ratten-Kernfaktor-Kappa-B-NF-κB-Antikörper wurden von Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, erworben. Polyklonale Antikörper gegen den Maus-/Rattenrezeptor für fortgeschrittene Glykationsendprodukte (RAGE), polyklonale Anti-Mensch-/Maus-/Ratten-StAR-Antikörper und monoklonale Anti-Mensch-/Maus-/Ratten-Cytochrom-P450 17A1-Antikörper wurden von Gene erworben Tex (Irvine, CA, USA). Polyklonale Antikörper gegen Mensch/Maus/Ratte CYP11A1 wurden von Cell Signaling Technology (Beverly, PA, USA) erhalten. Das Easy-Blue-Reagenz wurde von Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA) gekauft. Agarose und DNA-Marker 100 bp wurden von Promega, Corporation (Madison, WI, USA) erhalten. Das RNeasy Lipid Tissue Mini Kit wurde von QIAGEN, Hilden, Deutschland, erworben.

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2.2. Methoden

2.2.1. In-vitro-Analyse

LC{{0}}- und TM3-Zellkultur: Die LC-540-Zelllinien wurden bei 37 °C in Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)-Medium, ergänzt mit Natriumbicarbonat (1,5 g/L), kultiviert. L-Glutamin (2 mM), nicht-essentielle Aminosäuren (0,1 mM), Natriumpyruvat (1,0 mM) und fötales Rinderserum (FBS) (10 %) in a 5 % CO2-Inkubator (CO2-Inkubator, Napco 5410, Taiwan). Die TM3-Zelllinie wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit Glucose (4,5 g/L), Natriumpyruvat (0,5 mM), L-Glutamin (2,5 mM), Natriumbicarbonat (1,2 g/L), {{ 28}}(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES, 15 mM) und fötales Kälberserum (FCS, 10 %) oder Pferdeserum (5 %) bei 37 °C in einer 5 %igen Lösung. CO2-Inkubator.

Bestimmung der Zelllebensfähigkeit vonEchinacosid (ECH): 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Reagenz wurde für den Zelllebensfähigkeitstest verwendet. Die Zellkonzentration wurde in einer 96-Well-Platte auf 2 × 105 Zellen/ml eingestellt. Dann wurden 20 µL ECH (verdünnt in 2 % des Mediums) hinzugefügt und 24 Stunden lang bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator inkubiert. Später wurden 100 µL MTT-Reagenz hinzugefügt und 4 Stunden lang bei 37 °C unter dunklen Bedingungen inkubiert. Die Absorption wurde bei 570 nm gemessen (ELISA-Lesegerät, Dynatech MR5000, Kloten, Schweiz).

Relative Lebensfähigkeit der Zellen (%)=[(Asample bei 570 nm − Leer bei 570 nm)]/[(AKontrolle bei 570 − Leer bei 570)] × 100.

Nitroblau-Tetrazolium (NBT)-Reduktionsassay und 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)-Assay: Die Anzahl der Zellen wurde auf 1× 1{{10}}6 Zellen/ ml. Dann wurden 5 0 mg/ml ECH, Resveratrol (RES) und fortgeschrittene Glykationsendprodukte (AGEs) (Kontrolle) zugegeben und 18 Stunden lang bei 37 °C co-kultiviert. Dann wurden 0,3 ml NBT-Lösung (0,1 mg/ml NBT, 5 % FBS und 3 % Dimethylsulfoxid (DMSO), gelöst in 10 ml DMEM) zugegeben und 1 Stunde lang bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert. Nach der Zentrifugation (bei 800 × g für 3 Minuten) wurde der Überstand entfernt und 200 µL DMSO hinzugefügt und 5 Minuten lang in einem Ultraschalloszillator (Delta Ultraschallreiniger D 200, Keelung, Taiwan) geschüttelt. Die Absorption wurde bei 630 nm gemessen. Für den DPPH-Radikaltest wurde Trolox (in 95 % Alkohol) als Standard verwendet. Dann wurden 75 µL einer 0,5 mM DPPH-Lösung mit 25 µL Proben gemischt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur an einem dunklen Ort reagieren gelassen. Die Mischung wurde geschüttelt und die Absorption wurde bei 517 nm gemessen.

Analyse des Gehalts an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS): Die Zellzahl wurde auf 2 × 105 Zellen/ml in einer 12-Well-Platte mit 2 % FBS eingestellt. Dann wurden 50 µL/ml ECH, RES und AGEs zur Platte gegeben und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach 24 Stunden wurde 20,{9}}Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) zugegeben und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Nach Zentrifugation (400 x g, 5 min) wurde der Überstand entfernt und die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in 1 ml PBS suspendiert und die ROS-Spiegel mit einem Durchflusszytometer (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA) bestimmt.

Identifizierung und quantitative Analyse von Proteinen: Proteine ​​wurden mithilfe eines Proteinextraktionsreagenzes (T-PER) extrahiert. Die Zelldichte wurde auf 2 × 105 Zellen/ml in einer 12--Wellplatte eingestellt und 50 µL/ml ECH, RES und ein Rezeptor für den RAGE-Antagonisten (Advanced Glycation Endproduct) sowie AGEs wurden hinzugefügt und inkubiert bei 37 ◦C in einem 5 % CO2-Inkubator für 24 Stunden. Danach wurden 400 µL T-PER hinzugefügt, von den Zellen abgekratzt und 20 Minuten lang bei 125,000× g (4 °C) zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und zur weiteren Analyse bei –80 °C (–80 °C Gefrierschrank, Nuaire, Plymouth, MN, USA) gelagert. Zur Proteinquantifizierung wurde ein Bicinchoninsäure (BCA)-Kit verwendet. Dann wurden 10 µL Standard-Zelllösung und 200 µL BCA-Reagenz zu den 8-Well-Platten gegeben und 30 Minuten lang bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator inkubiert. Die Absorption wurde bei 562 nm gemessen. Die Proteinidentifizierungsanalyse wurde mittels Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) durchgeführt. Die Proben wurden durch Zugabe von Proteinlysat zu einem Proteinladepuffer vorbereitet und eine Western-Blot-Analyse durchgeführt, um die spezifischen Proteine ​​nachzuweisen.

2.2.2. In-vivo-Analyse

Tiermodelldesign: Sechzig {{0}} Wochen alte männliche Sprague-Dawley (SD)-Ratten wurden vom National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) gekauft. Jede Ratte wurde einzeln in desinfizierenden Edelstahlkäfigen bei kontrollierter Temperatur (23 ± 1 °C) und Luftfeuchtigkeit (40–60 %) mit einem 12-Stunden-Licht-/12-Stunden-Dunkel-Zyklus gehalten. Futter und Wasser wurden nach Belieben zur Verfügung gestellt. Jede Ratte wurde in der ersten Woche domestiziert und erhielt als Hauptnahrung Labornagerfutter 5001. Alle Verfahren folgten dem Standard des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-Zulassungsnummer 101026) der National Taiwan Ocean University, Taiwan. Nach der Domestizierung wurden die Ratten in zwei Gruppen eingeteilt: die Kontrollgruppe (Con), die mit der Labordiät 5001 gefüttert wurde, und die Diabetikergruppe, die während des gesamten Experiments mit einer fettreichen Diät (HFD, 40 %) gefüttert wurde. Nach vierwöchiger Fütterung mit HFD wurde den Ratten der Diabetikergruppe Streptozotocin (65 mg/kg) (STZ) injiziert, um Diabetes mellitus (DM) auszulösen. Innerhalb von 15 Minuten nach der Injektion von STZ wurde Nicotinamid (230 mg/kg Körpergewicht) injiziert. Eine Woche nach der Injektion wurde ein oraler Glukosetoleranztest (OGTT) durchgeführt, um die erfolgreiche Induktion von Diabetes mellitus (DM) festzustellen. Danach wurden die Tiere in sechs Gruppen eingeteilt: die Kontrolle (gefüttert mit Labordiät 5001); DM-Gruppe (DM + 45 % HFD); DMR-Gruppe (DM + Rosiglitazon: 0,571 mg/kg KG) + 45 % HFD; DME1-Gruppe (DM + CTE: 80 mg/kg KG) + 45 % HFD; DME2-Gruppe (DM + CTE: 160 mg/kg KG) + 45 % HFD; und DME4-Gruppe (DM + CTE: 320 mg/kg KG) + 45 % HFD. Als Positivkontrolle wurde Rosiglitazon (RSG) verwendet. Drei CTE-Dosen (80, 160 und 320 mg/kg) wurden gemäß der Empfehlung der Richtlinien zur funktionellen Bewertung gesunder Lebensmittel der Taiwan Food and Drug Administration (TFDA) verwendet. Die Behandlungen wurden bis zum Ende des Experiments durchgeführt. Alle Versuchsratten wurden nach 6 Wochen getötet. Das den Ratten entnommene Blut wurde 15 Minuten lang bei 3000 U/min und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde für die folgende Analyse untersucht:

Gesamtglukose-, Triglycerid- und Cholesterinbestimmung: Die Glukosebestimmung wurde mit Glukose-Enzym-Kits durchgeführt. Dann wurden 20 µL Blutplasmaproben zu den Reagenzien gegeben und 5 Minuten lang bei 37 °C gehalten. Die Gesamttriglyceride und die Gesamtcholesterinkonzentration wurden mithilfe von Triglycerid- und Cholesterin-Enzym-Kits bestimmt. Anschließend wurden den Reagenzien 10 µL Blutplasma zugesetzt und das Experiment gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Absorption wurde bei 510 nm gemessen.

Gesamtglukose/Triglycerid/Cholesterin im Plasma (mg/dl)=(Asample − ABlank)/(Astandard − ABlank) × 200.

Asample: Absorption von Blutproben, ABlank: Absorptionswert von Kits ohne Probe, Astandard: Absorptionswert des Standardreagenzes, 200: Standardreagenzien bei einer Konzentration von 200 mg/dL.

Insulin-, Leptin- und homöostatische Modellbewertung – Bestimmung der Insulinresistenz (HOMA-IR):Der Insulinspiegel wurde mit Insulin-ELISA-Kits bestimmt. Hier, 25µL Blutplasma wurde zugegebenReagenzien, und die Absorption wurde bei 450 nm gemessen. Der Gesamtleptingehalt wurde unter Verwendung von a bestimmtImmunometrisches Leptin-Enzym-Assay-Kit.Dann 100µL Plasma wurde analysiert und die Absorption bestimmtwurde bei 450 nm mit einem ELISA-Lesegerät gemessen. Das gesamte Experiment wurde gemäß durchgeführtdie Anweisungen des Herstellers. Der HOMA-IR-Wert wurde anhand des Homöostasemodells ermitteltBewertungsgleichung=Nüchternplasma-Insulinkonzentration (mg/ml)× Nüchtern-PlasmaglukoseKonzentrationen (mmol/L)/22,5.

Plasmalipidperoxidation: Hier wurden {{0}},5 ml Blutplasma mit 1 ml Reagenz (15 %, w/v Trichloressigsäure in 0,25 N Salzsäure (HCl) gemischt ) und 0.375 %, w/v Thiobarbitursäure in 0,25 N HCl) und 15 Minuten lang in ein Wasserbad (Wasserbad, BÜCHI 461, Zürich, Schweiz) bei 100 ◦C gegeben. Nach dem Abkühlen wurde 1 ml n-Butanol zugegeben, kräftig geschüttelt und 10 Minuten lang bei 1500 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und die Absorption bei 532 nm gemessen [12].

Malondialdehyd (MDA)-Konzentration (nM/ml)=[(Eine Probe bei 532 nm – Leer bei 532 nm)/ (Ein Standard bei 532 nm – Leer bei 532 nm)] × 5.

Standard bei 532 nm – Leerzeichen bei 532 nm)] × 5. Bestimmung der Plasmatestosteron- und luteinisierenden Hormonspiegel (LH): Das Testosteron-ELISA-Kit wurde verwendet, um den Testosteronspiegel im Blutplasma zu messen. Zur Bestimmung der LH-Konzentration wurde ein RIA-Kit verwendet. Dann wurden 50 µL Plasma hinzugefügt und die Berechnungen basierten auf der Konzentration des Hormons LH-RP-3 (Standard). Die weiteren Schritte erfolgten gemäß den Herstellerangaben.

Bestimmung der Tumornekrosefaktor (TNF)- und Interleukin-6 (IL-6)-Konzentration: Der eingefangene Antikörper wurde 250-fach in Beschichtungspuffer verdünnt und zu einer 96- Well-Platte (100 µL/Well) und über Nacht bei 4 ◦C aufbewahrt. Der Überstand wurde abgesaugt und fünfmal mit Waschpuffer (1 Mal PBS, 0,05 % Tween 20) gewaschen. Nach der Inkubation (1 Stunde) mit 200 µg Assay-Verdünnungsmittel wurden die Zellen fünfmal mit Waschpuffer gewaschen und 100 µL TNF-Standardlösung oder Testproben in jede Vertiefung gegeben und 2 Stunden lang inkubiert. Nach dem Waschen wurden 100 µL IL-6-detektierte Antikörper hinzugefügt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überstand wurde abgesaugt und fünfmal gewaschen. Anschließend wurden 480 µL des Enzyms Avidin-Meerrettich-Peroxidase (HRP) zugegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überstand wurde abgesaugt und fünfmal mit einem Waschpuffer gewaschen. Dann wurden 100 µL Substratlösung zugegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Später wurden 50 µL Stopplösung (1 M Phosphorsäure) in jede Vertiefung gegeben und die Absorption bei 450 nm gemessen.

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Analyse der Spermien- und Hodenparameter

Sammlung von Samenproben: Die Sammlung von Samenproben wurde gemäß der zuvor in [13] beschriebenen Methode durchgeführt. Aus dem Überstand wurden die Spermien gesammelt und zur weiteren Analyse verwendet.

Die Anzahl der Spermien, die Beweglichkeit der Spermien und abnormale Spermien: Die Anzahl der Spermien wurde mit dem Hämozytometer und Trypanblau-Lösung berechnet. Dann wurden 100 µL Spermienflüssigkeit mit Trypanblau-Lösung gemischt und die Anzahl der Spermien, die Beweglichkeit und die abnormalen Spermien mithilfe eines Hämozytometers und eines Mikroskops berechnet [14].

Nitroblau-Tetrazolium-NBT-Reduktion und Lipidperoxidation von Spermien und Hoden: Die Lipidperoxidation und die NBT-Reduktion wurden nach dem gleichen Verfahren der Plasmaanalyse analysiert.

Bestimmung der Superoxiddismutase (SOD)- und Katalaseaktivität: Die Superoxiddismutase (SOD)-Aktivität wurde mit dem RANSEL-Kit analysiert. Hier wurden {{0}}.05 ml Hodenhomogenate zu 1,7 ml Reaktionslösung (0,05 mM Xanthin, 0,025 mM 2-({ {9}}Iodphenyl)- 3-(4-Nitrophenol)-5-Phenyltetrazoliumchlorid (INT)). Nach dem Mischen wurden 0,25 ml Xanthinoxidase (80 U/L) zugegeben und 30 s lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Absorption wurde bei 505 nm gemessen. Die Proteinkonzentration des Hodenhomogenats wurde mit dem Bio-Rad DC Protein Assay Kit bestimmt und seine spezifische Aktivität (U/mg Protein) berechnet. Die Katalase (CAT)-Aktivität wurde nach einer zuvor veröffentlichten Methode bestimmt [15].

H&E-Färbung (Hämatoxylin und Eosin).

Der Hoden wurde 24 Stunden lang in 10 % Formalin eingeweicht und bei 4 °C gelagert. Die Gewebe hatten Mikrogröße und waren auf dem Objektträger befestigt. Nach der Fixierung (95 % Methanol + 5 % Essigsäure) wurden die Objektträger 3 Minuten lang in Hämatoxylin getaucht, 5 Minuten lang mit fließendem Wasser gewaschen und dann mit 50 %, 70 % und 90 % Alkohol getränkt eine Minute. Danach wurden die Objektträger 10 Sekunden lang mit Eosin gefärbt und eine Minute lang in 100 %igem Alkohol eingeweicht, bis die Farbe verblasste. Abschließend wurde der Objektträger eine Minute lang in Xylol eingeweicht. Später wurde der Objektträger luftgetrocknet und versiegelt. Das gefärbte Röhrchen wurde in ein Umkehrphasenkontrastmikroskop (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokio, Japan) gegeben, um die Morphologie zu beobachten.

Analyse des Hypothalamus

Die Maus-Gensequenzen KISS1, G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPR) 54, Suppressor des Zytokinsignals 3 (SOCS-3) und Sirtuin 1 (SIRT1) wurden aus der NCBI-Gendatenbank (National Center for Biotechnology Information) identifiziert und ein spezifischer Primer wurde unter Verwendung von Primer 5 entwickelt.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Die im Experiment verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Extraktion von Ribonukleinsäure (RNA) aus dem Hypothalamus. Die Extraktion von RNA aus dem Hypothalamus des Gehirns erfolgte mit dem RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. Die erhaltenen mRNAs wurden durch reverse Transkription (RT) und Polymerasekettenreaktion (PCR) quantitativ gemessen. Die aus der RT-Analyse erhaltene Komplementär-DNA wurde zur späteren Verwendung bei –20 °C gelagert. Die extrahierte DNA wurde einer Polymerase-Kettenreaktionsanalyse (PCR) unter Verwendung von Taq-Polymerase unterzogen. Dann wurden 5–10 µL des PCR-Produkts entnommen und durch Elektrophorese auf einem 1,5 %igen Agarkolloid analysiert. Das Bild wurde mit einem UVP BioDoc-It-Bildgebungssystem aufgenommen. Es wurde revers transkribierte komplementäre Desoxyribonukleinsäure (cDNA) entnommen und die PCR mit dem IQ SYBR Green Supermix Kit durchgeführt. Später wurde es mit der iQTM 5 Optical System Software analysiert. Proteine ​​wurden mithilfe eines Proteinextraktionsreagenzes (T-PER) extrahiert. Anschließend wurden 20 mg Hodenhomogenat zu 400 µL T-PER gegeben und bei 4 °C (125,{16}}× g zentrifugiert (Hochgeschwindigkeitszentrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Deutschland). ) für 20 Min. Die folgende Methode ähnelte der „Identifizierungs- und Quantifizierungsanalyse von Proteinen“ in der In-vitro-Analyse.

2.3. Statistische Analyse

Die experimentellen Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (Mittelwert ± SD) ausgedrückt und die Daten wurden mit der Software Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk, New York, NY, USA, analysiert. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) analysiert. Mehrere Vergleiche verschiedener Gruppen wurden mit dem Duncan-Test bei einem Wert von p < 0,05 als signifikantem Niveau analysiert.

3. Ergebnisse

3.1. In-vitro-Analyse

3.1.1. Vergleich der antioxidativen Aktivitäten von ECH, CTE und RES

Langfristig hHoher oxidativer Stress und chronische Entzündungen sind die Hauptursachen für DiabetesKomplikationen [16]. CTEs enthalten verschiedenePhenylethanoidglykoside wie Echinacosid(ECH) und Acteosid, mit dem Potenzial für antioxidative Aktivität [17]. DPPH-RadikalfängerEs wurde ein Test durchgeführt, um die antioxidative Aktivität von ECH zu bewerten. Trolox und Resveratrol(3,5,4'-Trihydroxystilben, RES) wurden als Standard bzw. Positivkontrolle verwendet. Wie gezeigtin Abbildung1ECH zeigte eine bessere Radikalfängeraktivität und die Aktivität war deutlich höherals die der Positivkontrolle (RES).

3.1.2. Zelllebensfähigkeit von ECH auf LC-540- und TM3-Leydig-Zellen

Der MTT-Assay wurde durchgeführt, um die Lebensfähigkeit der Zellen verschiedener ECH-Konzentrationen zu bewerten. LC-540-Leydig-Zellen und TM3-Leydig-Zellen zeigten nach der Behandlung mit ECH eine Lebensfähigkeit von mehr als 80 % (Abbildung 2). Im Vergleich zu den anderen Konzentrationen zeigte eine 100-µM-Konzentration (Verdünnungen von 100 µM in 2 % FBS) von ECH eine bessere Lebensfähigkeit der Zellen in TM3-Leydig-Zellen. Das Ergebnis zeigte, dass die erhöhte ECH-Konzentration keine signifikante Toxizität für die Zellen verursacht.

3.1.3. Wirkung von ECH auf die AGE-induzierte Superoxidproduktion durch NBT-Assay in LC-540- und TM3-Leydig-Zellen

AGEs verursachen oxidative Schäden im Körper durch die Oxidation von Glukose und die Bildung freier Radikale wie O2-, Hydroxylradikale und Carbonylgruppen [18]. Nach der Stimulation mit 50 μg/ml AGEs wurden die LC-540-Zellen (Abbildung 3a) und TM3-Zellen (Abbildung 3b) mit ECH und RES (jeweils 5 μM und 10 μM) behandelt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Produktion von Superoxidanionen in der Kontrollgruppe (stimulierte AGEs) erhöht war, die Produktion von Superoxidanionen jedoch nach der Kontrollgruppe (stimulierte AGEs) verringert war, die Produktion von Superoxidanionen jedoch nach der Superoxidproduktion abnahm und geschützt war die Zellen vor oxidativen Schäden. Im Fall von LC-540-Zellen zeigten 10 µM ECH eine fast ähnliche Aktivität wie die normale Gruppe. Die Superoxidproduktion in beiden Zellen nahm mit zunehmender Konzentration von ECH und RES ab.

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3.1.4. Wirkung von ECH auf die H2O2-Produktion in AGE-stimulierten LC-540-Leydig-Zellen

Der DCFH-DA-Assay wurde durchgeführt, um das Vorhandensein oxidativer Spezies nachzuweisen. Nach dem Eindringen in die Zellen wird der Fluoreszenzfarbstoff DCFH-DA durch intrazelluläres H2O2 oxidiert und bildet Dichlorfluorescein (DCF). Wie in Abbildung 4 dargestellt, kam es in der AGE-stimulierten Gruppe (Kontrolle) zu einem signifikanten Anstieg der intrazellulären H2O2-Produktion, wohingegen die Zugabe von 10 µM ECH und RES die H2O2-Produktion in den Zellen deutlich reduzierte. Die Verabreichung von 10 µM ECH führte nur zu etwa 47,1 % der H2O2-Produktion, deutlich weniger als in der Kontrollgruppe.

3.1.5. Wirkung von ECH auf RAGE- und NF-κB-Proteinexpressionsniveaus in AGE-stimulierten LC-540-Leydig-Zellen

Eine Western-Blot-Analyse wurde durchgeführt, um das Vorhandensein von RAGE in LC-540-Leydig-Zellen zu bestätigen. Die Wirkung von ECH auf die Proteinexpressionsniveaus von RAGE (Abbildung 5a) und NF-κB (Abbildung 5b) in AGEs-stimulierten Leydig-Zellen ist in Abbildung 5 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Konzentration von 50 µg/ml an AGEs höhere RAGE- und NF-κB-Proteinexpressionsniveaus induzierte. Die κB-Expression in LC-540-Leydig-Zellen und eine 10 µM-Konzentration von ECH und RES reduzierten die Expression von RAGE und NF-κB signifikant. Die Expression von NF-κB war bei RES und ECH signifikant geringer als bei RAGE-Antagonisten. Die Ergebnisse bestätigten also, dass die ECH das Ausmaß der Entzündung reduzierte, indem sie den RAGE- und NF-κB-Spiegel senkte.

3.1.6. Wirkung von ECH auf den Testosteronsyntheseweg in AGE-stimulierten LC-540-Leydig-Zellen.

Der Prozess der Spermatogenese und der männlichen Unfruchtbarkeit hängt von der Anwesenheit von Testosteron ab. Wie in Abbildung 6 gezeigt, waren die Expressionen der Proteine ​​StAR (Abbildung 6a), CYP11A1 (Abbildung 6b), CYP17A1 (Abbildung 6c) und HSD17 3 (Abbildung 6d) in AGE-stimuliertem LC{{11) signifikant verringert }} Leydig-Zellen (Kontrollgruppe). Die Expression der Proteine ​​StAR, CYP11A1, CYP17A1 und HSD17 3 wurde signifikant erhöht, wenn der RAGE-Antagonist, RES und ECH hinzugefügt wurden. Die erhöhte Expression von StAR- und CYP11A1-Proteinen wurde sowohl in der ECH- als auch in der RES-behandelten Gruppe beobachtet. Das Expressionsniveau von CYP17A1 war in den RES- und ECH-Gruppen nahezu ähnlich. Die Expression des HSD17 3-Proteins in ECH-behandelten Leydig-Zellen war viel höher als die der mit RES- und RAGE-Antagonisten behandelten Zellen. Eine erhöhte Expression der Proteine ​​StAR, CYP11A1, CYP17A1 und HSD17 3 deutete auf eine normale Testosteronproduktion hin.