Auswirkungen der Gesamtglykoside von Cistanche Deserticola auf Verletzungen durch oxidativen Stress und Zellapoptose bei Ratten mit zerebraler Ischämie-Reperfusion Ⅰ

Abstakt

Ziel: Untersuchung der Auswirkungen und möglichen Mechanismen vonCistanche deserticola Gesamtglykoside(GCs) über Schäden durch oxidativen Stress und Apoptose von Nervenzellen bei Ratten mit zerebralemIschämie-Reperfusionsschaden(CIRI).

Methoden: Das Modell für den Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO) wurde an Modellratten unter Verwendung der Nahtembolisationsmethode konstruiert. Nachdem das Modell erfolgreich etabliert worden war, erhielten die Ratten in der Arzneimittelgruppe (GCs) an 14 aufeinanderfolgenden Tagen GCs mit 50 mg/(kg·d) per Sonde; Den Ratten in der Scheinoperationsgruppe (Sham) und der Modellgruppe (Model) wurde das gleiche Volumen normaler Kochsalzlösung verabreicht. Orale Verabreichung. Nach der Verabreichung wurde die Longa-Score-Methode zur Bewertung des neurologischen Defizits verwendet; Anschließend wurden die Ratten getötet und eine TTC-Färbung durchgeführt, um den Prozentsatz der Hirninfarktfläche zu berechnen. Zum Nachweis des Serums wurde die ELISA-Methode verwendetMalondialdehyd(MDA)-Inhalte,Hyperventilieren(SOD) undGlutathionperoxidase (GSH-Px)Aktivität; Western Blot zum Nachweis von Kernfaktor E2-verwandtem Faktor 2 (Nrf2), Hämoxygenase-1 (HO-1) und B im HirngewebeZelluläres Lymphom/Leukämie-2 (Bcl-2), Bcl-2-assoziiertes X-Protein (Bax) und Caspase-3 (Caspase-3)-Expression.

Ergebnisse: Im Vergleich zur Scheingruppe wies die Modellgruppe einen höheren neurologischen Defizit-Score, einen erhöhten Prozentsatz der Hirninfarktfläche underhöhter MDA-Gehalt, verringerte SOD- und GSH-Px-Aktivitäten und verringerte Expressionsniveaus der Proteine ​​Nrf 2, HO -1 und Bc l{3}} Die Proteinexpressionsniveaus von Bax und Caspase-3 stiegen; Im Vergleich zur Modellgruppe verringerte sich der neurologische Defizit-Score der Ratten in der GCs-Gruppe, der Prozentsatz der Hirninfarktfläche verringerte sichDer MDA-Gehalt nahm ab, SOD- und GS-H-Px-Aktivität nimmt zu, die Proteinexpressionsniveaus von Nrf 2, HO -1 und Bcl - 2 nahmen zu und die Proteinexpressionsniveaus von Bax und Caspase - 3 nahmen ab. Schlussfolgerung: GCs können zerebrale Ischämie-Reperfusionsschäden wirksam reduzieren, und ihr Mechanismus könnte mit der Aktivierung des Nrf 2 / HO - 1-Signalwegs zusammenhängen, wodurch der oxidative Stress reduziert und die Apoptose von Nervenzellen gehemmt wird.

[Schlüsselwörter]Cistanche deserticola Gesamtglykoside; zerebrale Ischämie-Reperfusionsschädigung; oxidativen Stress; Zellapoptose

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Zerebrale Ischämie-Reperfusion,

CIS ist eine Krankheit mit extremhohe Morbidität, BehinderungUndSterblichkeitsraten. Gehirnzellen reagieren äußerst empfindlich auf Ischämie und Hypoxie. Daher ist die schnellstmögliche Rekanalisierung der Gehirnblutgefäße die wirksamste Methode zur Behandlung eines akuten ischämischen Schlaganfalls. Die intravenöse Thrombolyse und die mechanische Thrombektomie sind derzeit weit verbreitete Methoden, die jedoch aufgrund ihrer relativen Wirksamkeit relativ hoch sind

Nur aufgrund des engen Zeitfensters und anderer unkontrollierbarer Faktoren<10% of stroke patients can achieve vascular recanalization within an effective time. Zerebrale Ischämie-Reperfusion, CIRI ist eine Art der Wiederherstellung zerebraler Blutgefäße nach einer Stenose. Eine überlagerte pathologische Schädigung, die während des Blutflusses auftritt. Man geht derzeit davon aus, dass sein pathologischer Mechanismus mit der Toxizität erregender Aminosäuren, einer Kalziumüberladung, der Freisetzung von Entzündungsfaktoren und der Ansammlung freier Sauerstoffradikale aufgrund von Mitochondrienschäden zusammenhängt [1], was letztendlich zur Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke und zu Störungen der Mikrozirkulation führt , Nervenzell-Apoptose und Nekrose [1] 2] und eine Reihe von Reaktionen, wodurch sich die neurologischen Defizite weiter verschlimmern.

Die Gesamtglykoside von Cistanche deserticola (Glykoside von Cistanche, GCs) werden aus der traditionellen chinesischen Medizin Herba Cistanche gewonnen. Der Hauptwirkstoff wird aus den Stängeln und Wurzeln von Cistanche gewonnen. Frühere Studien haben gezeigt, dass GCs die Lipidperoxidation wirksam hemmen, die Mitochondrienfunktion verbessern, überschüssige freie Sauerstoffradikale abfangen, die Freisetzung entzündlicher Zytokine hemmen, die Zytotoxizität reduzieren, die Thrombozytenaggregation hemmen, die Zellproliferation hemmen, die neuronale Apoptose hemmen und den Hormonspiegel senken können. Dadurch wirkt es Anti-Aging, Anti-Tumor, Anti-Depression, stärkt die Immunität, verbessert ischämische Herz-Kreislauf- und zerebrovaskuläre Erkrankungen, verbessert Lern- und Gedächtnisfähigkeiten sowie kognitive Funktionen und verbessert die Fortpflanzung [3].

Studien haben gezeigt, dass GCs oxidative Schäden an Zellen reduzieren und die Integrität der Blut-Hirn-Schranke aufrechterhalten können.

[4]; GCs können die Lebensfähigkeit der Zellen wirksam verbessern und Entzündungen und Apoptose blockieren, die nach Ischämie-Reperfusion induziert werden [5]; Nrf 2 spielt eine wichtige Rolle bei entzündungshemmenden und antioxidativen Prozessen [6]. Basierend auf dem oben genannten Hintergrund zielt dieser Artikel darauf ab, die Auswirkungen und möglichen Wege von GCs auf oxidativen Stress und Apoptose nach CIRI durch Replikation des CIRI-Modells weiter zu untersuchen.

1 Materialien und Methoden

1. 1 Medikamente und Reagenzien GCs (SN-5692, Reinheit 98 %, Western

Anshenong Biotechnology Co., Ltd.), 2 %ige Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Farbstofflösung (Beijing Solebao Technology Co., Ltd.), ELISA-Kit (Beijing Boosen Co., Ltd.), Kit zur quantitativen BCA-Proteinanalyse (USA Cell Signaling). Technology Company), Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper Bcl-2, Bax, Caspas-Antikörper wie e-3, Nrf 2, HO-1 und Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper wurden alle von gekauft Proteintech Company aus den Vereinigten Staaten.

1. 2 Instrumente

Zentrifuge (Modell: TDL-40B, Shanghai Anheng Scientific Instrument Factory), Mikroplatten-Lesegerät (Modell: Max-M5, American Molecular Devices Company), SDS-PAGE-Elektrophoresegerät (Modell: DYY-7C, Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. Company), Gelscanner (Modell: 4466611, US BIO-RAD Company).

1. 3 Tiere

Männliche Wistar-Ratten [SCXK (Beijing) 2019-0010], reiner Zustand, 8 Wochen alt, Körpergewicht 250-280 g.

1. 3 Methoden

1. 3. 1 Gruppierung und Modellierung

Die Ratten wurden mithilfe einer einfachen Randomisierungsmethode in eine Scheingruppe (Sham), eine Modellgruppe (Model) und eine Arzneimittelgruppe (GCs) eingeteilt. In jeder Gruppe befanden sich 15 Ratten. Sie wurden eine Woche lang adaptiv aufgezogen und dann modelliert. Die Modellgruppe und die GCs-Gruppe nährten strikt und fasteten 12 Stunden vor der Operation und verwendeten die Naht-Embolisationsmethode [7], um einen Verschluss der mittleren Hirnarterie (Verschluss der mittleren Hirnarterie) zu erzeugen. Okklusion, MCAO) Rattenmodell, die Entfernung des Embolus wurde nach 2 Stunden Ischämie durchgeführt, um eine Reperfusion zu erreichen. , notieren Sie den Startzeitpunkt der Reperfusion. Die Wunde wurde genäht, die Haut mit Jodophor desinfiziert und die Tiere wurden in den Käfig zurückgebracht, aufgezogen und anschließend 24 Stunden lang perfundiert. Der Vorgang für die Ratten in der Scheingruppe war derselbe wie für die Modellratten, es wurde jedoch kein Stopfen durchgeführt. Schließlich wurden 10 Ratten in jeder Gruppe für nachfolgende Experimente zurückbehalten.

1. 3. 2. Verabreichungsmethode

Nehmen Sie GC-Pulver und geben Sie reines Wasser hinzu, um eine 15 mg/ml-Lösung herzustellen. Vorläufige Studien haben gezeigt, dass die Dosis von 50 mg/(kg·d) besser ist als andere Dosisgruppen [8], sodass die für dieses Experiment gewählte Dosis dieselbe ist wie zuvor. Ratten in der GCs-Gruppe erhielten GCs per Sonde nach 24 Stunden Ischämie und Reperfusion, und Ratten in der Sham-Gruppe und der Modellgruppe erhielten 14 Tage lang per Sonde ein gleiches Volumen normaler Kochsalzlösung.

1. 3. 3 Bewertung des neurologischen Defizits

Die Longa-Bewertungsmethode [7] wurde zur Bewertung 24 Stunden nach der Operation verwendet und Modellratten mit Werten von 1 bis 3 wurden für nachfolgende Experimente zurückbehalten. Punkte nach der letzten Dosis. 0 Punkte: Keine

Neurologische Symptome; 1 Punkt: leichtes neurologisches Defizit, das kontralaterale Vorderbein beugt und hebt sich, wenn der Schwanz angehoben wird, und die Schulter ist adduziert; 2 Punkte: mäßiges neurologisches Defizit, die kontralaterale Vorderextremität beugt und hebt sich, wenn der Schwanz angehoben wird, Schulteradduktion, drehen sich beim Gehen im Kreis auf die gegenüberliegende Seite der Läsion; 3 Punkte: schweres neurologisches Defizit, beim Gehen auf die gegenüberliegende Seite der Läsion neigen; 4 Punkte: unbewusste und autonome Aktivitäten.

1. 3. 4 Bestimmung des prozentualen Anteils der Hirninfarktfläche

Nach der letzten Verabreichung wurden 4 Ratten aus jeder Gruppe zufällig ausgewählt, tief betäubt, enthauptet und ihre Gehirne wurden schnell entfernt.

Frieren Sie das Gehirngewebe schnell 20 Minuten lang in einem Kühlschrank mit -20 Grad ein. Nachdem das Gehirngewebe relativ fixiert ist, nehmen Sie es heraus. Schneiden Sie das Rattenhirn entlang der Koronalebene ab, beginnend am Schnittpunkt des vorderen Pols des Gehirns mit dem Chiasma opticum und von der Stirn bis zum Hinterkopf. In 5 2 mm dicke Hirnscheiben schneiden, in 2 %ige TTC-Lösung eintauchen, zum Färben 15 Minuten in ein 37-Grad-Wasserbad legen, umdrehen und weitere 15 Minuten färben. Abschließend wurden die Hirnschnitte in 4 %ige Paraformaldehydlösung getaucht und 12 Stunden lang fixiert, bevor sie fotografiert wurden. Normales Hirngewebe wurde in Rot und infarziertes Hirngewebe in Weiß dargestellt. Verwenden Sie Bildsoftware, um die Infarktrate jeder Gehirnscheibe zu analysieren und zu berechnen. Infarktrate=Infarktfläche/Gesamtfläche der Hirnscheibe × 100 %.

1. 3. 5 Erkennung von Indikatoren im Zusammenhang mit oxidativem Stress

Betäuben Sie die Ratte, nehmen Sie 4 ml Bauchaortenblut, teilen Sie es in saubere EP-Röhrchen auf und stellen Sie es für 0 in einen 4-Grad-Kühlschrank. Zentrifugieren Sie bei 3 500 U/min für 5 Stunden bei 4 Grad für 15 Minuten, nehmen Sie den Überstand und bewahren Sie schließlich das Serum von 3 Ratten in jeder Gruppe auf. Der Gehalt an Malondialdehyd (MDA) und Superoxiddismutase (Superoxiddismutase) wurde gemäß der Arbeitsmethode des ELISA-Kits bestimmt. e Dismutase,

SOD), Glutathionperoxidase (Glutathionperoxidase, GSH-Px) Aktivität.

1. 3. 6 Western-Blot-Detektion

Oxidativer Stress und Apoptose-bezogene Proteine ​​wurden gemessen, um die Expression der Proteine ​​Nrf 2, HO -1, Bcl -2, Bax und Caspase -3 im Gehirngewebe zu messen. Aus jeder Gruppe wurden drei Ratten ausgewählt und eine entsprechende Menge Großhirnrinde aus dem erkrankten Bereich entnommen, mit Lyselösung versetzt und nach der Proteinextraktion die Proteinkonzentration berechnet. Nach der Protein-Gelelektrophorese, der Übertragung auf die Membran, dem Blockieren mit Blockierungslösung für 2 Stunden, dem Spülen und der anschließenden Inkubation mit primärem Antikörper bei 4 Grad über Nacht wurde am nächsten Tag das TBST entfernt, gespült und sekundärer Antikörper zur Inkubation für 2 hinzugefügt H. Legen Sie das Zielband auf den Bildanalysator, um den Grauwert zu analysieren. Berechnen Sie den relativen Streifengrauwert, den relativen Streifengrauwert=den Zielstreifengrauwert / den internen Referenzstreifengrauwert.

1. 4 Statistische Analysemethoden

Datenanwendung SPSS 25. 0 Software zur Datenanalyse, und die statistischen Diagramme in diesem Artikel wurden mit der Software GraphPad Prism 8 erstellt. Datenergebnisse, die mit der Normalverteilung übereinstimmen, werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Für Vergleiche zwischen mehreren Stichproben wurde eine Ein-Faktor-Varianzanalyse verwendet, und für Vergleiche zwischen zwei unabhängigen Stichproben wurde LSD-t verwendet. Test, mit P < 0. 05 gibt an, dass der Unterschied statistisch signifikant ist.