Auswirkungen von Flavonoiden auf die Haut nach ihren strukturellen Eigenschaften: Eine Übersicht

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Abstrakt:Hintergrund: Beim Myokardinfarkt (MI) gehen Milliarden von Kardiomyozyten verloren. Die optimale Therapie sollte geschädigte Kardiomyozyten effektiv ersetzen, möglicherweise durch Stammzellen, die in der Lage sind, sich in erwachsene funktionelle Kardiomyozyten einzupflanzen und zu differenzieren. Als solche sind Vorhofohrstammzellen (CASCs) geeignete Kandidaten. Das Vorhandensein erhöhter Konzentrationen von fortgeschrittenen Glykationsendprodukten (AGEs) in Herzregionen, in die CASCs transplantiert werden, kann jedoch ihr regeneratives Potenzial beeinträchtigen. In dieser Studie untersuchen wir, ob und wie AGEs die Eigenschaften von CASCs in vitro verändern. Methoden und Ergebnisse: CASCs in Kultur wurden verschiedenen AGE-Konzentrationen (50 ug/ml bis 400 ug/ml) ausgesetzt. Das Überleben, die Proliferation und die Migrationskapazität von CASCs waren nach 72-stündiger AGE-Exposition signifikant verringert. Die Apoptose nahm mit steigender AGE-Konzentration signifikant zu. Die schädlichen Wirkungen dieser AGEs wurden teilweise durch Vorinkubation mit einem Rezeptor für AGEs (RAGE)-Inhibitor (25 μM FPS-ZM1) abgeschwächt, was auf die Beteiligung von RAGE an den beobachteten negativen Wirkungen hinweist. Schlussfolgerung: AGEs haben einen zeit- und konzentrationsabhängigen negativen Effekt auf CASCs Überleben, Proliferation, Migration und Apoptose in vitro, teilweise vermittelt durch RAGE-Aktivierung. Ob Anti-AGE-Therapien eine wirksame Behandlung im Rahmen der Stammzellentherapie nach MI darstellen, erfordert weitere Untersuchungen.

Schlüsselwörter:Stammzellen; Aldehyddehydrogenase; CASCs; glykierte Proteine; Advanced Glycation End-Produkte; Proliferation; Apoptose; Migration; RAGE-Hemmung

1. Einleitung

Die koronare Herzkrankheit (KHK) bleibt weltweit die Hauptursache für Mortalität und Morbidität, wobei der Myokardinfarkt (MI) die häufigste Form der KHK ist [1]. MI resultiert aus dem vollständigen oder teilweisen Verschluss einer Koronararterie. Im ischämischen Bereich sind Sauerstoff und Nährstoffe eingeschränkt, was zum Absterben der Myokardzellen führt. Die Infarktgröße hängt von mehreren Faktoren ab, wie z. B. der Größe des ischämischen Risikobereichs, dem Ort und der Dauer des Koronarverschlusses und der Menge des verbleibenden kollateralen Blutflusses [1,2]. Da adulte Kardiomyozyten minimale regenerative Eigenschaften haben, bleibt eine intrinsische Reparatur des beschädigten Gewebes schwer fassbar. Die Suche nach einem therapeutischen Ansatz, der die myokardiale Narbe effektiv durch funktionelles kontraktiles Gewebe ersetzt, ist die einzige Option, um verlorenes Herzgewebe wiederherzustellen.wie viel cistanche zu nehmenEs wurde viel Forschungsaufwand betrieben, um das therapeutische Potenzial und die Mechanismen der Zelltherapie mit Knochenmarkszellen (BMCs) aufzudecken. Knochenmark enthält hämatopoetische Stammzellen (HSCs), endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) und mesenchymale Stammzellen (MSCs)[3]. Klinische Studien mit mononukleären BMCs und MSCs brachten keine signifikanten Verbesserungen der Herzfunktion nach MI. Da mononukleäre BMCs und MSCs nicht in Kardiomyozyten differenzieren, werden die beobachteten begrenzten Verbesserungen wahrscheinlich auf parakrine Mechanismen zurückgeführt [4,5]. Um die Herzfunktion nach einem Herzinfarkt deutlich zu verbessern, verlagerte sich der Forschungsschwerpunkt auf residente kardiale Stammzellen (CSCs) wie c-kit plus , Sca-1 plus , Isl-1 plus -Zellen und Kardiosphären, die wahrscheinlich vorprogrammiert sind, um Kardiomyozyten zu werden. Ihr Erfolg bei der Herzregeneration ist jedoch gering [6].

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In den letzten Jahren entdeckte unsere Forschungsgruppe eine neue Art von Herzstammzellen namens „Cardiac Atrial Stem Cells“ (CASCs). Im Gegensatz zu anderen Stammzellen weisen CASCs außergewöhnliche kardiomyogene Differenzierungseigenschaften auf, was sie zu einem vielversprechenden Kandidaten für die Herzregeneration macht [4]. Die Isolierung dieser Stammzellpopulation aus Vorhofohren basiert auf einer hohen Aktivität der Aldehyddehydrogenase (ALDH). Eine hohe ALDH-Aktivität wurde auch bei anderen Stammzelltypen wie MSCs, HSCs und neuralen und Krebsstammzellen unter anderem berichtet [7-9]. Da sich ALDH als kardioprotektiv erwiesen hat und das Zellüberleben unter Stressbedingungen fördert, kann die Verwendung einer ALDH plus Stammzellpopulation bei ischämischen Bedingungen in diesem Zusammenhang vorteilhaft sein [4,10]. CASCs können auf klinisch relevante Zahlen erweitert werden, ohne dass grundlegende Eigenschaften wie ALDH-Aktivität, Oberflächenantigenprofil und kardiomyogene Differenzierungskapazität verloren gehen [11]. Diese Gegebenheit ist entscheidend für die Übersetzung dieses therapeutischen Ansatzes in die Klinik. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die autologe CASCs-Transplantation zu einer verbesserten linksventrikulären Funktion führt, die aus einer angemessenen Stammzelltransplantation und einer weiteren CASCs-Differenzierung resultiert [4,12].

Bei MI-Patienten sind die Spiegel fortgeschrittener Glykationsendprodukte (AGEs) erhöht [13]AGEs sind Proteine ​​und/oder Lipide, die durch Glykation irreversibel geschädigt werden, ein Prozess, bei dem reduzierende Zucker nicht-enzymatisch mit Aminogruppen in Lipiden oder Proteinen reagieren . Neben der Glykation führt auch oxidativer Stress durch die Oxidation von Proteinen und/oder Lipiden zur Bildung von AGEs [14]. AGEs werden endogen gebildet und reichern sich auf natürliche Weise im Körper mit der Seneszenz oder in pathologischen Situationen wie MI an, wenn der Grad an oxidativem Stress erhöht ist [15-17].was ist eine cistancheDarüber hinaus hat frühere Forschung gezeigt, dass AGEs verschiedene Arten von Stammzellen in vitro beeinflussen [18-20]. Die Fähigkeit von Stammzellen zu proliferieren wird durch AGEs reduziert und die Apoptoserate wird durch die Anwendung von AGEs erhöht. Diese Wirkungen könnten durch mehrere Mechanismen ausgeführt werden, einschließlich der Aktivierung des apoptotischen Signalwegs, RAGE oder übermäßiger ROS-Bildung [20]. Ob AGEs auch die Eigenschaften von CASCs beeinflussen, bleibt unbekannt. Diese Ergebnisse werfen die Frage auf, ob AGEs die therapeutische Wirksamkeit von CASCs, die zur Behandlung von MI eingesetzt werden, negativ beeinflussen könnten. Das Ziel dieser Studie ist es daher, die In-vitro-Effekte von AGEs und die mögliche Aktivierung seines Rezeptors RAGE auf die Proliferation, das Überleben und die Migration von CASCS zu untersuchen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Tierversuche

Tierversuche wurden gemäß der EU-Richtlinie 2010/63/EU für Tierversuche durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission für Tierversuche (UHasselt, Belgien, Diepenbeek; ID 201919K) genehmigt. Alle Tiere wurden in einer temperaturkontrollierten Umgebung (21 Grad, 60 Prozent Luftfeuchtigkeit) mit einem 12-Stunden--12-Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Sie wurden mit einer Standard-Pelletdiät mit Wasser, das nach Belieben verfügbar war, gefüttert. Insgesamt wurden 62 weibliche Sprague-Dawley-Ratten (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Frankreich) verwendet.

2.2.Rat CASCs Isolierung und Erweiterung

CASCs wurden aus den rechten Vorhofohren geerntet, wie zuvor beschrieben [4]Kurz, Ratten wurde Heparin injiziert (1000 Einheiten/kg, intraperitoneal (ip) und mit einer Überdosis eingeschläfert). Natriumpentobarbital (Dolethal, Vetoquinol, Aartselar Belgium, 200 mg/kg, ip). Die Herzen wurden geerntet und mit einer normalen Tyrode-Lösung (137 mM NaCl, 5,4 mMKCl, 0,5 mMMgClz, 1 mMCaClz, 11,8 mMNa-HEPES, 10 mMglu-case, 20 mM Taurin) perfundiert , pH 7,4), und die rechten Vorhofohren wurden gesammelt.Das extrahierte rechte Vorhofohrgewebe wurde in Stücke von ~1 mm³ zerkleinert,mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und für 30 min in Hank'sBalanced Salt Solution enzymatisch dissoziiert enthaltend 0,6 WU/ml Kollagenase NB 4 (Serva, Heidelberg, Deutschland) und 20 mM Carly.BioflavonoideALDHt-Zellen wurden gemäß dem Aldefluor-Kit (STEMCELL Technologies, Evergem, Belgien) gefärbt. ALDHt-Zellen wurden als CASCs definiert und wurden in X-VIVO 15-Medium (Lonza, Basel, Schweiz), ergänzt mit 20 Prozent fötalem Kälberserum (FCS) und 2 Prozent Penicillin/Streptomycin (P/S), durchflusssortiert (BD FACS Aria). . Isolierte CASCs wurden in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 60,000 Zellen pro Well ausgesät und bei 37 Grad in einem befeuchteten Inkubator mit einer 5-prozentigen CO2-Atmosphäre inkubiert. Das Medium wurde alle 2 bis 3 Tage gewechselt. Als CASCs 80 Prozent Konfluenz erreichten, wurden sie unter Verwendung von Trypsin geerntet. Für alle Experimente wurden CASCs der Passage 1 verwendet.

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2.3.AGEs Vorbereitung

AGEs wurden wie zuvor beschrieben hergestellt [21]. Kurz gesagt wurde Rinderserumalbumin (BSA; 7 mg/ml) mit Glykolaldehyd-Dimeren (9 0 mM; Sigma-Aldrich, Diegem, Belgien) in sterilem PBS (pH 7,4) für 5 Tage bei 37 Grad inkubiert. Diese Lösung wurde gegen PBS dialysiert, zweimal für 2 h und über Nacht bei 4 Grad, um nicht umgesetztes Glykolaldehyd zu entfernen (3,4 kDa Ausschlussgrenze. AGEs wurden filtriert (0,2 um Filter, Sarstedt, Antwerpen, Belgien). BSA in PBS (7 mg/ml) inkubiert ) wurde als Kontrolllösung verwendet.

2.4. Proliferations- und Überlebensassay

Proliferations- und Überlebensassays wurden durchgeführt, mit einem Propidiumiodid (PI)-Assay, wie zuvor von Gervois et al. beschrieben. und Lo Monaco et al.[22,23]. Kurz gesagt, CASCs wurden in einer 96--Well-Platte in X-VIVO-Medium mit 10 % FCS und 2 % P/S ausgesät. Für Proliferationsassays wurden 5000 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Für Überlebensassays wurden 100 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Nach 24 h wurden dem Medium fünf verschiedene Bedingungen zugesetzt: 400 ug/ml BSA, 50 ug/ml, 100 ug/ml, 200 ug/ml und 400 ug/ml AGEs. Um die Proliferation zu messen, wurden BSA oder AGEs zu X-VIVO-Medium mit 2 Prozent FCS und 2 Prozent P/S gegeben.Cistanche kaufenUm das Überleben zu messen, wurden BSA oder AGEs zu X-VIVO-Medium mit 0 Prozent FCS und 2 Prozent P/S gegeben. Nach drei verschiedenen Zeitpunkten (24, 48 und 72 h) wurde das Medium durch Lysepuffer A100 (ChemoMetec, Kaiserslautern, Deutschland) ersetzt, gefolgt von einer gleichen Menge Stabilisierungspuffer B (ChemoMetec), ergänzt mit PI (10 ug/ ml, Sigma). Nach einer Inkubationszeit von 15 min im Dunkeln wurde die Fluoreszenz mit dem Plattenlesegerät Fluostar Optima (BMG Labtech, Ortenberg, Deutschland) bei einer Anregung von 540 nm, einer Emissionswellenlänge von 612 nm und einer Verstärkung von 2000 gemessen. Es wurden Experimente durchgeführt in dreifacher Ausführung. Die Daten wurden auf Daten normalisiert, die mit 400 ug/ml BSA erhalten wurden.

2.5.Migrationsassay

CASCs wurden in einer {{0}}Well-Platte mit einer Dichte von 5000 Zellen pro Well in X-VIVO-Medium mit 10 Prozent FCS und 2 Prozent P/S ausgesät. Dem Medium wurden fünf Bedingungen hinzugefügt: 400 ug/ml BSA, 50 ug/ml, 100 ug/ml, 200 ug/ml und 400 ug/ml AGEs. Nach einer Inkubationszeit von 72 h wurden die konditionierten CASCs unter Verwendung von Trypsin geerntet und für einen Transwell-Migrationsassay verwendet. In den ThinCerts (Greiner Bio-One, Vilvoorde, Belgien) mit einer porösen Membran von 8 μm Porengröße wurden 100.000 Zellen pro Bedingung in X-VIVO-Medium mit 0 Prozent FCS und 2 Prozent P/S ausgesät. ThinCerts wurden auf 24--Well-Platten platziert, die X-VIVO-Medium mit 2 % FCS und 2 % P/S enthielten. Nach 24 Stunden Migration wurden die ThinCerts mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 15 Minuten fixiert und mit 0,1 inkubiert Prozent Kristallviolett für 30min. Nicht migrierte Zellen wurden an der Oberseite der ThinCerts entfernt, wonach die Menge der transmigrierten CASCs mit der Software AxioVision 4.6 (Carl Zeiss, Zaventem, Belgien) quantifiziert wurde. Die Daten wurden auf Daten normalisiert, die mit 400 ug/ml BSA erhalten wurden.

2.6. Apoptose-Assay

CASCs wurden in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 10,00 Zellen pro Well in X-VIVO-Medium mit 2 % FCS und 2 % P/S ausgesät. Zur Untersuchung der Apoptose wurde ein Caspase-Assay mit dem IncuCyte8 Caspase-3/7 Green Apoptosis Assay Reagent (verdünnt 1/100, Sartorius, Schaarbeek, Belgien) durchgeführt. Dem Medium wurden fünf Bedingungen hinzugefügt: 400 ug/ml BSA, 50 ug/ml, 100 ug/ml, 200 ug/ml und 400 ug/ml AGEs. CASCs, die in X-VIVO-Medium ohne FCS und 2 Prozent P/ S wurden als Positivkontrolle verwendet. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt. Bilder wurden nach 24, 48 und 72 h Inkubation mit dem IncuCyte@S3Live-Cell Analysis System (Sartorius, Schaarbeek, Belgien) aufgenommen. Die Analyse des von apoptotischen Zellen besetzten Bereichs wurde mit dem IncuCyte* SX1 Live-Cell Analysis System (Sartorius, Schaarbeek, Belgien) durchgeführt. Die Daten wurden auf die Positivkontrolle (plus, X-VIVO-Medium ohne FCS) normalisiert.

2.7.In-vitro-RAGE-Hemmung

RAGE wurde gehemmt, um den Beitrag der RAGE-Aktivierung zur Proliferation, zum Überleben und zur Migration von CASCs zu bewerten. Kurz gesagt, CASCs wurden bei 37 Grad in einem Inkubator mit 5 % CO 2 mit dem RAGE-Antagonisten FPS-ZM1 (10 und 25 &mgr;M, Calbiochem/Merck, Overijse, Belgien) vorinkubiert. Nach 2 h Vorinkubation wurden 400 ug/ml AGEs zugegeben.Cistanche AustralienNach 24 48 und 72 h wurden Proliferation und Überleben wie oben beschrieben bewertet. Nach 72 h Inkubation wurden vorkonditionierte CASCs geerntet und für einen Transwell-Migrationsassay wie oben beschrieben verwendet.

2.8.Statistiken

Statistische Analysen wurden mit der Software GraphPad Prism 9.0.0 durchgeführt.ZistanchDie Normalverteilung der Daten wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test bewertet. Normalverteilte Daten wurden einem Einweg-ANOVA-Test mit wiederholten Messungen unterzogen, gefolgt von einem Holm-Sidak-Mehrfachvergleichstest. Wenn die Daten nicht normalverteilt waren, wurde der nicht-parametrische Friedman-Test verwendet, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichstest. Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ausgedrückt. Ein Wert von p<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Ergebnisse

3.1.AGEs-Exposition wirkt sich negativ auf die Proliferation und das Überleben von CASCs aus

Wie in Abbildung 1 gezeigt, verringerten AGEs die CASCs-Proliferation im Laufe der Zeit signifikant und allmählich. Der negative Einfluss von AGEs auf die Proliferation von CASCs war ebenfalls konzentrationsabhängig. Nach 72 h reduzierten Konzentrationen von 100 ug/ml, 200 ug/ml und 400 ug/ml AGEs sig die CASCs-Proliferation im Vergleich zu BSA signifikant (Abbildung 1C; 80 Prozent ± 7n100 ug/ml, 74 Prozent ± 3 in 200 ug/ml, und 65 Prozent ± 4 in 400 ug/ml AGEs）. Die Anwendung von BSA allein hatte keinen Einfluss auf die Proliferationskapazität von CASCs (Abbildung S1 in Supplementary Materials). Wie in Abbildung 2 gezeigt, wirkten sich steigende Konzentrationen von AGEs negativ auf das Überleben von CASCs im Laufe der Zeit aus. Signifikante Wirkungen von AGEs wurden nach 48 (Abbildung 2B) und 72 h (Abbildung 2C) beobachtet; 85 Prozent ± 3 bei 100 ug/ml, 73 Prozent ± 3 bei 200 ug/ml und 64 Prozent ± 4 bei 400 ug/ml AGEs) .Die Anwendung von BSA allein hatte keinen Einfluss auf die Überlebensfähigkeit von CASCs (Abbildung S1).

3.2. Erhöhte AGE-Konzentrationen erhöhen die Apoptose von CASCs

Um die Wirkung verschiedener AGE-Konzentrationen (50, 100, 20 und 400 ug/ml) auf die CASC-Apoptose aufzuklären, wurde ein Caspase-Assay durchgeführt. Der Prozentsatz der Zellen, die Caspase 3/7 exprimieren, wurde zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen: 24 (Abbildung 3A), 48 (Abbildung 3B) und 72 (Abbildung 3C) h. Die Apoptoserate nahm im Laufe der Zeit allmählich mit erhöhten AGE-Konzentrationen zu (Fig. 3C, 72 h; 77 % ± 17 in 400 ug/ml AGEs vs. 18 % ± 3 in BSA).

3.3.AGEs-Exposition verringert die Migrationskapazität von CASCs

Die Migrationskapazität von CASCs wurde mit einem Transwell-Migrationsassay nach 72 h Inkubation mit verschiedenen AGE-Konzentrationen bewertet. In Abbildung 4-E sind repräsentative Beispiele der CASC-Migration nach Inkubation mit BSA und verschiedenen AGE-Konzentrationen (50.100, 200 und 400 ug/ml) dargestellt. Die Quantifizierung der Migration ist in Abbildung 4Fdargestellt. Im Vergleich zu BSA wurde eine signifikante Verringerung der Migration beobachtet, wenn CASCs mit 400 ug/ml AGEs inkubiert wurden (Abbildung 4E, F; 75 Prozent ±5 in 400 ug/ml AGEs).

3.4. Schädliche Wirkungen von AGEs in CASCs werden durch RAGE-Aktivierung vermittelt

Um den Beitrag der RAGE-Aktivierung zu den beobachteten schädlichen Wirkungen von AGEs zu bewerten, wurden Proliferation, Überleben und Migration von CASCs nach der Inkubation mit dem RAGE-Antagonisten FPS-ZM1 bewertet. Vor der Exposition gegenüber 400 ug/ml AGEs wurden CASCs für 2 h mit 10 oder 25 uM FPS-ZM1 vorinkubiert. Die alleinige Anwendung von FPS-ZML (10 und 25 uM) beeinflusste weder die Proliferationsfähigkeit noch das Überleben von CASCs (Abbildung S2). Die Proliferation von CASCs (Abbildung 5A-C) wurde nach 24 (A), 48 (B) und 72 (C) h bewertet. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wird die negative Auswirkung auf die Proliferation von CASCs durch AGEs nach der Vorinkubation mit 25 uM FPS-ZM1 deutlich abgeschwächt (Abbildung 5A-C). Tatsächlich war die Proliferation von CASCs nach 24 und 48 h signifikant verbessert, mit 400 ug/ml AGEs-Exposition (24 h, Abbildung 5A); 104 Prozent β8 in 25 μM FPS-ZM1 vs. 79 Prozent ±5 in 400 ug/ml AGEs; 48 h, Abbildung 5B; 95 Prozent ± 5 in 25 μM FPS-ZM1 vs. 70 Prozent ± 4 in 400 ug/ml AGEs）. Nach 72 h wurde der gleiche Trend beobachtet. Die Proliferation verbesserte sich tendenziell, wenn RAGE gehemmt wurde (Abbildung: 80 % ± 8 in 25 μMFPS-ZM1 vs. 67 % ± 5 in 400 ug/ml AGEs, p =0 0,06). Das Überleben (Abbildung 6A-C) wurde nach 24 (A), 48 (B) und 72 (C) h bewertet. Der negative Einfluss auf das Überleben von CASCs durch AGEs (Abbildung 2) wird nach Vorinkubation mit 25 μM FPS-ZM1 deutlich verbessert (Abbildung 6A–C). ZM1 vs. 91 Prozent ± 4 in 400 ug/ml AGEs) Dieser Trend wurde auch nach 48 h beobachtet (Abbildung 6B; 91 Prozent ± 5 in 25 μM FPS-ZM1 vs. 81 Prozent ± 5 in 400 ug/ml AGEs, p =0.07). Repräsentative Beispiele für die Migration von CASCs nach 72-stündiger Inkubation mit 400 ug/ml AGEs und FPS-ZMI sind in Abbildung dargestellt und in Abbildung quantifiziert. Abbildung 7B; 98 Prozent ±6 in 25 μM FPS-ZM1 vs. 7 Prozent ±8 in 400 ug/ml AGEs, p=0.07）.

4. Diskussion

Unsere Studie ist die erste, die zeigt, dass AGEs die Eigenschaften von CASCs beeinflussen, nämlich Überleben, Proliferation, Migration und Apoptose in vitro. Unsere Daten zeigen, dass diese Wirkungen teilweise dosisabhängig durch die RAGE-Aktivierung vermittelt werden.

4.1. Die Rolle von AGEs bei MI

Die Kreislauf-AGE-Spiegel sind bei Patienten mit akutem MI signifikant erhöht [24,25]. Wie sie jedoch an der Pathophysiologie des MI beteiligt sind, bleibt unklar. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) tragen hauptsächlich zur Synthese von AGEs bei. Oxidativer Stress kann die Bildung von reaktiven Carbonylverbindungen und die Glyoxidation von Amadori-Produkten in der Maillard-Reaktion induzieren. Als solche werden AGEs nach MI irreversibel gebildet und im Herzen angesammelt und es wird angenommen, dass sie den nachteiligen kardialen Phänotyp möglicherweise weiter verschlechtern [26,27]. Darüber hinaus tragen Neutrophile und aktivierte Makrophagen, die am Entzündungsprozess bei MI beteiligt sind, maßgeblich zur AGE-Synthese bei[28,29]. Diese Immunzellen sezernieren AGEs und gelten als Schlüsselinduktoren der AGEs-Bildung bei MI. 4.2. Physiologische Relevanz von AGE-Konzentrationen

In unserer Studie haben wir einen breiten Bereich von AGE-Konzentrationen getestet (50 bis 400 ug/ml). Die AGE-Konzentration, die in anderen In-vitro-Studien zur Untersuchung der Wirkung von AGE auf Stammzellen verwendet wurde, reicht von 15 bis 500 ug/ml 【20】. Es gibt eine signifikante Variabilität der verwendeten Konzentrationen, aber höhere AGE-Spiegel spiegeln im Allgemeinen die physiologischen Plasmaspiegel wider, die bei Patienten gefunden werden, die an mehreren Krankheiten leiden. Tatsächlich wurde gezeigt, dass die AGEs-Albumin-Konzentration bei Diabetikern im Bereich von 50 bis 400 ug/ml liegt[30]. AGE-Spiegel können bei Patienten mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen auf Konzentrationen von bis zu 200 ug/ml ansteigen [31,32]. Bei Patienten mit Alzheimer im Frühstadium werden auch niedrigere AGE-Konzentrationen im Nanobereich berichtet [33]. Aufgrund der unterschiedlichen Analysemethoden, die zur Messung von AGEs verwendet werden, und der Heterogenität verschiedener Arten von AGEs bleibt die Schätzung zuverlässiger AGE-Konzentrationen in vivo jedoch technisch anspruchsvoll und ist wahrscheinlich eine Unterschätzung [34].

4.3.AGEs wirken sich negativ auf die Eigenschaften von CASCs aus

Auch wenn die CASC-Transplantation ein vielversprechendes Potenzial für die Herzregeneration nach einem MI zeigt, bleiben das Überleben und die Regenerationsfähigkeit der Zellen ein Problem. Ischämische Bereiche sind bekanntermaßen eine feindliche Umgebung mit erhöhtem oxidativem Stress, Entzündungen und Fibrose in Kombination mit erhöhten AGE-Gewebespiegeln. Ob AGEs die Regenerationsfähigkeit von CASCs beeinflussen würden, war unbekannt, könnte aber eine wichtige Erkenntnis im Zusammenhang mit der Herzregeneration und den vielversprechenden Regenerationsfähigkeiten von CASCs sein[12]. In unserer Studie zeigen wir, dass AGEs das Überleben, die Proliferation und die Migration von CASCs in vitro beeinträchtigen, konzentrations- und zeitabhängig. Darüber hinaus führt die Exposition gegenüber AGEs zu einem allmählichen Anstieg der Apoptose von CASCs. Unsere Daten stimmen mit Studien überein, die die Wirkung von AGEs auf mehrere Arten anderer Stammzellen untersuchen, in denen die Proliferationsfähigkeit verändert und die Apoptose erhöht wird [20]. Tatsächlich zeigten Zhu et al. eine signifikante Abnahme der EPC-Proliferation nach Exposition gegenüber verschiedenen AGE-Konzentrationen[16]. Der gleiche Effekt wurde von Sun et al. auch in EPCs, wo eine Erhöhung der Apoptoserate durch die Aktivierung des p38-MAPK-Signalwegs vermittelt wurde [35]. NSCs, die AGEs ausgesetzt waren, führten zu einer dosisabhängigen Reduktion der Stammzellproliferation, vermittelt über den PPARy-Weg [36]. In aus Fettgewebe stammenden Stammzellen (ADSCs) führt eine Erhöhung der Caspase-3-Aktivierung zu einer erhöhten Apoptoserate [37]. Yanget al. berichteten über geringere Proliferations- und Migrationskapazitäten in MSCs in Abhängigkeit von der AGE-Konzentration. Dieser Effekt wurde über eine übermäßige ROS-Produktion vermittelt[18]. Ob die schädlichen Wirkungen auf CASCs, eine ganz andere Stammzellpopulation kardialen Ursprungs, auch durch eine übermäßige ROS-Produktion vermittelt werden, bleibt abzuwarten.

Es wurde gezeigt, dass die zugrunde liegenden Mechanismen, in denen AGEs ihre negativen Auswirkungen auf die Organfunktion ausüben, abhängig und/oder unabhängig von der Aktivierung des RAGE-Rezeptors sind [15]. Studien an vielen Stammzelltypen zeigen, dass AGEs ihre Wirkung hauptsächlich durch die Aktivierung von RAGE oder anderen apoptotischen Signalwegen vermitteln[20]. Die RAGE-Aktivierung durch AGEs bewirkt die Aktivierung von MAPK, was zur Phosphorylierung von JNK und p38 führt. Diese phosphorylierten Proteine ​​erhöhen die Transkription verschiedener pro-apoptotischer Transkriptionsfaktoren im Zellkern, was zu einer Zunahme der Apoptose führt. Daneben können Caspase-Signalwege aktiviert werden, was zu AGEs-induzierter Apoptose führt[39]. Folgestudien bleiben notwendig, um die molekularen Mechanismen aufzuklären, durch die die nachgelagerten Wirkungen von AGEs in CASCs induziert werden. Wir haben jedoch gezeigt, dass nach RAGE-Blockierung durch FPS-ZM1 die beobachteten Wirkungen von AGEs auf CASCs abgeschwächt wurden. Daher weisen unsere Daten stark darauf hin, dass AGEs ihre Wirkungen auf CASCs wahrscheinlich durch Bindung und Aktivierung von RAGE vermitteln. Ob Jak/STAT, PI3K/Akt, MAPK, übermäßige ROS-Produktion oder andere Signalwege beteiligt sind, muss weiter identifiziert werden. Unsere Daten stimmen auch mit der von Zhang et al. beschriebenen Arbeit überein, wo FPS-ZML auch die negativen Auswirkungen von AGEs in ADSCs umkehrte, indem es RAGE blockierte, was die wichtige Rolle der RAGE-Aktivierung als Mediator der durch verursachten schädlichen Wirkungen weiter bestätigt ALTER[40].

4.4. Zukunftsperspektiven für Anti-AGEs-Therapien für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und aktuelle Einschränkungen

Die In-vivo-Bestätigung der Verwendung von Anti-AGEs-Therapien und ihres potenziellen Mehrwerts für die Stammzelltransplantation nach MI muss in einem Tiermodell bestätigt werden, bevor dies in die Klinik übertragen werden kann. In mehreren In-vitro-Studien wurde gezeigt, dass der PPARy-Inhibitor Rosiglitazon [41,42], MAPK-Inhibitoren [18,35,43] oder Antioxidantien [4] die AGE-vermittelten Wirkungen auf Stammzellen abschwächen können. Ihr Einfluss in vivo als therapeutische Intervention in Kombination mit einer Stammzelltransplantation wurde jedoch bisher nie thematisiert. Es gibt mehrere Strategien, um die AGE-Spiegel im Körper zu senken. Pyridoxamin (PM) ist ein Inhibitor der AGE-Bildung, indem es die Umwandlung von Amadori in AGEs verringert und Carbonylverbindungen abfängt. Die Wirksamkeit sowie die Sicherheit der PM-Behandlung wurden in klinischen Studien mit Diabetikern nachgewiesen [45]. Eine klinische Studie mit NephroGenex im Jahr 2014, in der Pyridorin [(dh PM) als antidiabetische Therapie getestet wurde, wurde jedoch aufgrund finanzieller Probleme abgebrochen [46]. Keine anderen klinischen Studien untersuchen derzeit PM als Therapie. Die Hemmung der Bildung von AGEs mit PM könnte jedoch eine Strategie sein, um das Potenzial von Stammzellen für kardiale Regenerationszwecke zu verbessern. Darüber hinaus könnten in Zukunft andere Inhibitoren der AGE-Bildung, wie Aminoguanidin, verwendet werden, um die AGE-Spiegel nach MI zu senken. Die klinische Studie ACTION II zeigte die Wirksamkeit von Aminoguanidin bei Diabetikern. Während Aminoguanidin bei diesen Patienten den primären Endpunkt der Verdopplung der Zeit bis zum Erreichen der maximalen Serumkreatininspiegel nicht signifikant reduzierte, wurden andere klinisch wichtige Wirkungen auf die Komplikationen von Diabetes gezeigt, wie etwa eine Verringerung der Proteinurie und der Lipidkonzentrationen im Kreislauf. Aufgrund reversibler Nebenwirkungen wie der Induktion von Autoantikörpern, grippeähnlichen Symptomen und Anämie wurde diese Studie jedoch beendet und die Übertragung in die Klinik bleibt begrenzt [47,48]. Darüber hinaus könnte die Verwendung von Antioxidantien wie N-Acetyl-L-Cystein (NAC) oder Glutathion als Nahrungsergänzung einige positive Ergebnisse für die Stammzelltherapie liefern, da sie die genomische Stabilität erhöhen, die Adhäsion verbessern und die Stammzellproliferation stimulieren [ 49]. Die zellspezifischen Wirkungen unterscheiden sich jedoch zwischen den Stammzelltypen, und es sind klinische Dosis-Wirkungs-Studien erforderlich, um ihre therapeutische Wirksamkeit bei Verwendung in Kombination mit einer Stammzelltransplantation zu bewerten. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, AGEs mit der ALT-71-Therapie abzubauen. ALT-711 ist in der Lage, Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen zwischen Carbonylen zu spalten, wodurch Quervernetzungen in AGEs-Molekülen aufgebrochen werden. Mehrere klinische Studien konnten jedoch die in Tierversuchen beobachteten vorteilhaften Wirkungen von ALT-711 nicht bestätigen. Darüber hinaus können Inhibitoren von RAGE (wie FPS-ZM1) oder Inhibitoren nachgeschalteter Moleküle im RAGE-Signalweg in die AGEs/RAGE-Zellsignalachse eingreifen und dadurch AGEs-vermittelte Wirkungen in Stammzellen blockieren. Die Wirksamkeit verschiedener Arten von kleinen Molekülen und Inhibitoren zur Blockierung von AGEs in Stammzellen wurde in mehreren In-vitro-Experimenten nachgewiesen [18,35,44], wurde jedoch noch nie zuvor in Tiermodellen getestet. Daher können wir nur die Hypothese aufstellen, dass diese Inhibitoren AGEs in einer In-vivo-Situation wirksam blockieren, aber Proof-Concept-Experimente sind erforderlich. Schließlich ist eine weitere Möglichkeit, AGEs in Kombination mit einer Stammzelltherapie zu blockieren, die genetische Veränderung von Stammzellen selbst. Es ist bekannt, dass die Überexpression von sRAGE das Abfangen von AGEs (und anderen RAGE-Liganden wie Amyloid-) verstärkt, um die Wirksamkeit der Zelltherapie zu verbessern. Dies wurde in sRAGE-sezernierenden MSCs als Therapie für die Alzheimer-Krankheit [50,51], Arthritis [52] und die Parkinson-Krankheit [53] gezeigt. sRAGE-sezernierende MSCs überlebten länger, hatten eine verbesserte Migrationskapazität, waren besser vor Apoptose geschützt und hatten entzündungshemmende Eigenschaften. Auch die Herunterregulierung von RAGE, wodurch die Stammzellen für AGEs desensibilisiert werden, könnte eine Option sein, um die Funktionalität der Zellen zu verbessern. Ob diese Strategien auch in der Einstellung von MI und Herzreparatur anwendbar sein könnten, bleibt zu untersuchen. Zusammenfassend zielen all diese Strategien darauf ab, AGEs zu bekämpfen, um die Funktionalität und Retention von Stammzellen zu verbessern. Diese therapeutischen Optionen bleiben jedoch hypothetisch und müssen in vivo in Kombination mit der CASC-Therapie untersucht werden, bevor sie in die klinische Anwendung überführt werden können. 5. Schlussfolgerungen

Wir fanden heraus, dass AGEs eine zeit- und konzentrationsabhängige, allmähliche Wirkung auf die Eigenschaften von CASCs hatten, indem sie die Apoptose erhöhten und das Überleben, die Proliferation und die Migration in vitro reduzierten. Die Wirkmechanismen hinter diesen Effekten müssen weiter untersucht werden, obwohl wir gezeigt haben, dass die RAGE-Aktivierung einen wichtigen Beitrag zu diesen AGE-bezogenen negativen Effekten leistet. Ob das Targeting von AGEs in vivo die therapeutische Kapazität von CASCs nach MI verbessern könnte, muss weiter untersucht werden.

Dieser Artikel ist aus J. Clin. Med. 2021, 10, 2964. https://doi.org/10.3390/jcm10132964 https://www.mdpi.com/journal/jcm