Verstärkung der anti-angiogenen Wirkung von Delphinidin, wenn es in kleine extrazelluläre Vesikel eingekapselt wird Teil 2

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3.2. Delphinidin-Metaboliten in sEVs

Zusätzlich zu Delphinidin (Abbildung 2A), Peonidin-3-Galaktosid(Retentionszeit=11.11 min, [M]' m/z=463.12404)(Abbildung 2B) undDelphinidin3-O- -rutinosid (Retentionszeit=12.34 min, [M] m/z=611.16121)(Abbildung 2C) wurden unter diesen experimentellen Bedingungen in sEVs nachgewiesen . Spuren dieser Metaboliten wurden auch in der Delphinidin-Standardlösung nachgewiesen. Die Analyse basierte auf der genauen Masse, obwohl eine authentische Standardlösung notwendig ist, um diese Beobachtung zu bestätigen.

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3.3. Wirkungen von Delphinidin und sEV-beladenem Delphinidin auf die HAoEC-Proliferation

Delphinidin allein oder geladen in sEVs veränderte die Lebensfähigkeit von HAoECs für 24 Stunden bei Konzentrationen von 1 bis 10 ug/ml nicht (Abbildung 3A).

VEGF (20 ng/ml), verwendet als Positivkontrolle, erhöhte die Proliferation von Endothelzellen nicht signifikant (Abbildung 3B). Native sEVs (10 ug/mL) hatten keine Wirkung. Delphinidin hemmte die Endothelzellproliferation auf konzentrationsabhängige Weise, wobei eine maximale Wirkung bei 10 ug/ml erreicht wurde (Abbildung 3B). Auf die gleiche Weise induzierte sEV-beladenes Delphinidin eine konzentrationsabhängige Hemmung vonendothelialZellvermehrung. Interessanterweise wurde die maximale Hemmung bei einer Konzentration von 5 ug/ml sEV-beladenem Delphinidin erreicht, einer Konzentration, die zweimal geringer ist als die für Delphinidin allein. Diese Ergebnisse legen nahe, dass sEV-beladenes Delphinidin zweimal wirksamer war alsDelphinidinallein.

3.4. Wirkungen von Delphinidin und sEV-beladenem Delphinidin auf die NO-Produktion

Wie in Abbildung 4 gezeigt, induzierte ATP (10 μM) einen Anstieg von DAF-2FluoreszenzVeranschaulichung der NO-Produktion in Endothelzellen. Native sEVs beeinflussten den NO-Spiegel nicht. Delphinidin allein erhöhte die NO-Produktion konzentrationsabhängig, wobei die maximale Wirkung bei 10 ug/ml erreicht wurde. Mit Delphinidin beladene sEVs lösten auch eine konzentrationsabhängige Steigerung der endothelialen NO-Produktion aus. Interessanterweise wurde die maximale Wirkung von sEV-beladenem Delphinidin bei 1 ug/ml erreicht, während das freie Delphinidin diese Wirkung bei 10 ug/ml erreichte. Somit war sEV-beladenes Delphinidin bei der Steigerung der NO-Produktion 10-mal wirksamer als Delphinidin allein.

3.5. Wirkungen von Delphinidin und sEV-beladenem Delphinidin auf die Angiogenese

HAoECs restrukturierten und bildeten kapillarähnliche Strukturen (Abbildung 5A,B). Native sEVs hatten keinen Einfluss auf die Bildung von kapillarähnlichen Strukturen. Wie zuvor beschrieben [6] reduzierte Delphinidin allein die Anzahl der Verzweigungen kapillarähnlicher Strukturen konzentrationsabhängig, wobei die maximale Wirkung bei 10 ug/mL mit einer 40-prozentigen Reduktion erreicht wurde. Interessanterweise übten Delphinidin-beladene sEVs eine starke Verringerung der Anzahl von Kapillarverzweigungen aus. Delphinidin mit 0,1 ug/ml, das in sEVs geladen wurde, verringerte bereits die Anzahl der Verzweigungen um 60 Prozent, und dieser Effekt war größer als der, der mit 10 ug/ml Delphinidin allein erzielt wurde. Somit war sEV-beladenes Delphinidin bei der Hemmung der Angiogenese mehr als 100-mal wirksamer als Delphinidin allein.

Abbildung 5. In-vitro-Angiogenese-Assay. (A)Repräsentative Phasenkontrastmikrographien von röhrenförmigen Strukturen in kultivierten HAoEC, die 24 h Delphinidin oder sEVs ausgesetzt waren, die mit Delphinidin in verschiedenen Konzentrationen beladen waren. Vergrößerung: 40-fach. Vier Bereiche von jedem Bohrloch wurden analysiert. (B) Das Balkendiagramm veranschaulicht die signifikante Abnahme des Prozentsatzes an Verzweigungspunkten nach der Behandlung im Vergleich zu PBS-behandelt (Kontrolle). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM von sechs unabhängigen Experimenten im Vergleich zur Kontrolle gezeigt: a: p<0.0001><0.0001 vs.del=""><0.0001 vs.="" del=""><0.001 vs.=""><><0.05vs.del5;g:><0.05 vs.sev=""><0.001 vs.sevdel0.5="" and=""><0.0001 vs.sevdel="">

4. Diskussion

Die aktuelle Studie zeigt, dass das in sEVs geladene Delphinidin hinsichtlich seiner Fähigkeit, endotheliales NO freizusetzen, die Endothelproliferation zu hemmen und kapillarähnliche Strukturen zu reduzieren, offensichtlich wirksamer war als freies Delphinidin. Zusätzlich zu Delphinidin, das in sEVs gefunden wurde, zeigte die Analyse von Delphinidin-Metaboliten in den sEVs das Vorhandensein von zwei Metaboliten (d. h.Delphinidin3-O--rutinosid und Peonidin-3-galactosid) in Delphinidinproben vorhanden. So wurde Delphinidin in seiner freien Form oder bei Beladung in sEVs zu den gleichen Metaboliten abgebaut; diese wirkten jedoch stärker auf Endothelzellen. Von Bedeutung ist, dass Delphinidin (das als Oberbegriff verwendet wird und die natürlichen Metaboliten Delphinidin 3-O-ß-Rutinosid und Peonidin-3-Galactosid umfasst) bei Einkapselung in sEVs 2--fach, {{8 }}-fach und 100--fach stärker als freies Delphinidin in Bezug auf Endothelproliferation, endotheliale NO-Produktion und kapillarähnliche Bildung. Somit übt sEV-beladenes Delphinidin Wirkungen auf verschiedene Schritte aus, die zur Angiogenese führen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass sEVs als vielversprechende Verabreichung von Delphinidin als innovativer Ansatz zur Bekämpfung von Krankheiten angesehen werden können, die mit erhöhter Angiogenese einhergehen, darunter Krebs, Atherosklerose und diabetische Retinopathien.

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Die Verkapselung von Polyphenolen zum Schutz vor Abbau ist ein natürliches Phänomen. Tatsächlich wurde gezeigt, dass Pflanzen, die reich an Polyphenolen sind, Elektrofahrzeuge produzieren, die diese Moleküle tragen. Beispielsweise werden das Flavonoidglykosid Naringin und sein Metabolit Naringenin in aus Grapefruits gewonnenen Elektrofahrzeugen gefunden [12]. Darüber hinaus können aus Pflanzen gewonnene Nanopartikel als Vektoren für andere interessierende Moleküle verwendet werden. Tatsächlich wurde berichtet, dass von Grapefruit abgeleitete Nanopartikel, die mit einem STAT3-Inhibitor beladen sind, STAT3 in GL26-Tumorzellen inaktivieren und die Überlebensraten von Mäusen verbessern [19]. Eine weitere Strategie zur Einkapselung von Polyphenolen ist die Verwendung von Vesikeln, die aus Säugerzellen stammen. Ein kürzlich erschienener Bericht bewertete die exosomale Formulierung von Anthocyanidinen gegen verschiedene Krebsarten [19]. Aus roher Rindermilch gewonnene sEVs, die mit einer Mischung aus Cyanidin, Delphinidin, Petunidin, Peonidin und Malvidin beladen sind, erhöhen die antiproliferative Aktivität von Anthocyanidinen gegen sechs verschiedene Arten von Krebszellen über die Hemmung der TNFo-induzierten Aktivierung von NF-kB [20] . Tatsächlich sind die Wirkungen von sEVs, die mit Anthocyanidinen beladen sind, effektiver als diejenigen, die durch freie Anthocyanidine erzielt werden. Dieses Verfahren hat Vorteile; es bleibt jedoch riskant. Tatsächlich kann die Verwendung von EVs aus Säugerzellen Immunreaktionen hervorrufen. sEVs, die aus unreifen menschlichen dendritischen Zellen stammen, induzierten keine Toxizität, und die unreife Natur dendritischer Zellen induzierte eine geringe Immunogenität [21,22]. Unseres Wissens ist dies das erste Mal, dass eine Beladungseffizienz für Delphinidin innerhalb von JAWS ⅡI sEVs beschrieben wurde. Das Laden von Delphinidin in die sEVs (9 Prozent) schützt und begrenzt wahrscheinlich seinen Abbau zu Metaboliten unter den verwendeten experimentellen Bedingungen. Die beteiligten Mechanismen bedürfen weiterer Untersuchungen. Die in den sEVs gefundenen Metaboliten wie Delphinidin 3-O- -rutinosid oder Peonidin-3-galactosid werden auch in In-vivo-Experimenten mit Delphinidin gefunden 14,15]. Frühere Arbeiten haben berichtet, dass Abbauprodukte von Delphinidin starke biologische Aktivitäten haben, einschließlich krebshemmender und entzündungshemmender Aktivitäten [20]. Gallussäure wird unter den Phenolsäuren hauptsächlich durch den Abbau von Delphinidin in Kulturmedien gebildet [23]. In der vorliegenden Studie fanden wir heraus, dass die in sEV-beladenem Delphinidin nachgewiesenen Metaboliten identisch mit denen waren, die in freiem Delphinidin nachgewiesen wurden [18]. Obwohl der genaue Anteil der in diesen sEVs eingekapselten Metaboliten nicht bestimmt wurde, waren sie auf Zielzellen wirksamer als Metaboliten allein. Daher waren Delphinidin und seine Metaboliten wahrscheinlich stabiler und vor Abbau geschützt.

Wir berichteten zuvor, dass Delphinidin in Endothelzellen der Rinderaorta die NO-Freisetzung stimuliert, indem es die intrazellulären Ca2+-Konzentrationen über die Erhöhung der Bildung von Superoxidanionen erhöht. Dies war mit einer erhöhten Tyrosinphosphorylierung mehrerer intrazellulärer Proteine ​​verbunden, was zu einer Endothel-abhängigen Vasodilatation führte [24,25]. Delphinidin interagiert direkt mit der Aktivatorstelle von ER, was zur Aktivierung der endothelialen NO-Synthase, NO-Produktion und Endothel-abhängigen Vasorelaxation führt. daher wäre es wahrscheinlich wirksamer bei der Korrektur der NO-endothelialen Dysfunktion, die mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen, einschließlich Bluthochdruck, Schlaganfall oder Stoffwechselerkrankungen, verbunden ist [3].

Wir haben zuvor berichtet, dass die Hochregulierung des NO-Signalwegs nicht für die antiproliferative Wirkung von Delphinidin verantwortlich ist. Tatsächlich hemmt Delphinidin die Proliferation von Endothelzellen durch die Aktivierung des ERK{{0}}/-2-Signalwegs, was zu einem Stillstand des Zellzyklus und einer Akkumulation von Zellen in der G0/G1-Phase durch Herunterregulierung von führt Cyclin A- und D1-Expression und eine Hochregulierung von p27kip1 [6,7]. Wir fanden auch heraus, dass Delphinidin das Tumorwachstum von Melanomzellen in vivo reduziert, indem es spezifisch auf die Endothelzellproliferation über die Hemmung der VEGFR2-Signalübertragung, MAPK, PI3K und auf Transkriptionsebene auf CREB/ATF1-Faktoren und die Hemmung von Phosphodiesterase 2 einwirkt [9]. In der vorliegenden Studie waren Delphinidin-beladene sEVs bei der Hemmung der Endothelproliferation zweifach wirksamer als freies Delphinidin. Somit weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass mit Delphinidin beladene sEVs ein vielversprechender Ansatz sind, um Pathologien zu verhindern, die mit einer übermäßigen Endothelproliferation und damit der Bildung des Gefäßnetzwerks wie Plaqueentwicklung und -stabilität bei Atherosklerose und Tumorentwicklung bei Krebs verbunden sind.

In Übereinstimmung mit diesen Befunden zeigen wir, dass Delphinidin die kapillarartige Bildung in einem experimentellen Modell der Angiogenese verringert. Interessanterweise war Delphinidin, wenn es in sEVs eingekapselt war (selbst bei einer Beladung von nur 9 Prozent), 100-mal stärker als freies Delphinidin bei der Verringerung der kapillarähnlichen Bildung.

Einschränkung der Studie: Das anti-angiogenische Potenzial vieler natürlicher Verbindungen, die in vielen Bestandteilen der mediterranen Ernährung enthalten sind, einschließlich Delphinidin, macht dieses Ernährungsmuster als Quelle für chemopräventive Mittel, die im Rahmen der Angiopräventionsstrategie definiert sind, besonders interessant. Dies wurde kürzlich von Martinez-Podeva et al. [26]. Delphinidin scheint genauso stark wie andere Flavonoide bei der Induktion antiangiogener Eigenschaften zu sein. Obwohl in der Nahrung reichlich vorhanden, werden Anthocyane im Allgemeinen und Delphinidin im Besonderen schlecht absorbiert. Eine Folge der schlechten Bioverfügbarkeit von Anthocyanen ist, dass viele in vitro beobachtete Wirkungen (z. B. Hemmung von COX-2) wahrscheinlich nicht in vivo auftreten, was für Delphinidin nicht der Fall ist, basierend auf unseren früheren Studien [{{ 5}}]. Es sind jedoch zusätzliche Studien unter Verwendung von in sEV eingekapseltem Delphinidin erforderlich, um die Zunahme der anti-angiogenen Eigenschaften dieses Ansatzes in vivo zu bestätigen.

Zusammenfassend erhöhte sEV-beladenes Delphinidin die Wirksamkeit von Delphinidin 100--fach für die Proliferation, 10--fach für NO und 2--fach für die kapillarähnliche Bildung. Somit schützten sEVs Delphinidin und seine Metaboliten entweder vor Abbau oder einige nicht identifizierte Delphinidin-Metaboliten, die in den sEVs enthalten waren, waren wirksamer. Die unterschiedliche Potenz, die für Proliferation, NO-Produktion und Angiogenese erhalten wird, unterstützt die Hypothese, dass Delphinidin-beladene EVs Auswirkungen auf verschiedene Schritte ausüben, die zur Angiogenese führen. Nichtsdestotrotz liefern wir Beweise dafür, dass wir die Wirksamkeit von Delphinidin optimiert haben, wahrscheinlich indem wir seinen Abbau reduziert und seine Abgabe erhöht haben, wenn es in Elektrofahrzeuge eingekapselt ist. Daher stellen Delphinidin-beladene sEVs ein leistungsstarkes Abgabesystem dar, um die Angiogenese in Endothelzellen ohne unerwünschte Nebenwirkungen zu verringern, da die geringe Bioverfügbarkeit dieser Verbindung bekannt ist. Wir unterstreichen eine innovative therapeutische Strategie, die auf biotechnologisch hergestellten Elektrofahrzeugen als Vektoren von Delphinidin basiert, um dazu beizutragen, seinen potenziellen gesundheitlichen Nutzen zur Bekämpfung von Angiogenese-bedingten Krankheiten, einschließlich Krebs, zu erhöhen, die schließlich auf weitere Krankheiten mit übermäßiger Vaskularisierung ausgedehnt werden könnten.

Dieser Artikel ist extrahiert aus Nutrients 2021, 13, 4378. https://doi.org/10.3390/nu13124378 https://www.mdpi.com/journal/nutrients