Das Targeting von Laktatdehydrogenase A mit Catechin resensitiviert SNU620/5FU-Magenkrebszellen gegenüber 5-Fluorouracil Teil 1

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Abstrakt:Resistenzen gegen Krebstherapeutika treten bei praktisch jeder Krebsart auf und werden zu einer Hauptschwierigkeit bei der Krebsbehandlung. Obwohl 5-Fluorouracil (5FU) die erste Wahl der Krebstherapie bei Magenkrebs ist, ist seine Wirksamkeit aufgrund von Arzneimittelresistenzen begrenzt. Vor kurzem wurde ein veränderter Krebsstoffwechsel, einschließlich des Warburg-Effekts, einer Bevorzugung der Glykolyse gegenüber der oxidativen Phosphorylierung zur Energieerzeugung, als zentraler Mechanismus zur Regulierung der Resistenz gegen Chemotherapie akzeptiert. Daher untersuchten wir den detaillierten Mechanismus und die mögliche Nützlichkeit von Antiglykolytika bei der Verbesserung der 5FU-Resistenz unter Verwendung etablierter Magenkrebszelllinien, SNU620 und SNU620/5FU. SNU620/5FU, eine Magenkrebszelle mit Resistenz gegen 5FU, zeigte eine viel höhere Laktatproduktion und -expression vonGlykolyse-verwandte EnzymeB. Laktatdehydrogenase A (LDHA), als die der SNU620-Elternzellen. Um die Glykolyse zu begrenzen, haben wir Catechin und seine bekannten Derivate untersuchtAntiphlogistikumund Antikrebs-Naturprodukte, da Epigallocatechingallat zuvor als Unterdrücker der LDHA-Expression beschrieben wurde. Catechin, die einfachste Verbindung unter ihnen, hatte die stärkste hemmende Wirkung auf die Laktatproduktion und LDHA-Aktivität. Darüber hinaus zeigte die Kombination von 5FU und Catechin zusätzliche Zytotoxizität und induzierte durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) vermittelte Apoptose in SNU620/5FU-Zellen. Daher schlagen wir basierend auf diesen Ergebnissen Catechin als Kandidaten für die Entwicklung eines neuartigen adjuvanten Medikaments vor, das die Chemoresistenz gegen 5FU reduziert, indem es LDHA einschränkt.

Schlüsselwörter:5-Fluorouracil;chemoresistent; Glykolyse; Laktatdehydrogenase; Catechin

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1. Einleitung

Bemerkenswerte Fortschritte wurden bei der Behandlung von Magenkrebs mit chirurgischer Resektion des Primärtumors und 5-Fluorouracil (5FU)-basierter kombinierter Chemotherapie wie Epirubicin, Cisplatin und Fluorouracil und Docetaxel, Oxaliplatin und 5FU[1 ,21 Bis heute bleibt 5FU, ein Analogon von Uracil, das die DNA-Synthese durch Hemmung der Thymidylat-Synthase blockiert [3], ein häufig verwendetes Chemotherapeutikum zur Behandlung von Magenkrebs [1, A4]. Die klinische Wirksamkeit der Chemotherapie war jedoch aufgrund des Rückfalls von primärem oder metastasiertem Krebs im Zusammenhang mit der Arzneimittelresistenz unbefriedigend [1,5].

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Mehrere zelluläre Prozesse werden als Schlüsselmechanismen angesehen, die der Chemoresistenz zugrunde liegen, darunter die Aktivierung oder Inaktivierung von Arzneimitteln, die Reparaturmaschinerie von DNA-Schäden, Modifikationen von Arzneimittelzielen, die Inaktivierung apoptotischer Signalwege und eine erhöhte Autophagie [6,7]. Krebs ist heterogen und verschiedene Krebsarten nutzen sowohl die Glykolyse als auch die oxidative Phosphorylierung für den Energiestoffwechsel [8]. Es wurde jedoch berichtet, dass eine metabolische Reprogrammierung, insbesondere eine abnormale aerobe Glykolyse, eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung einer Resistenz gegen Chemotherapeutika, einschließlich 5FU, bei Magenkrebs spielt [9]. Laktatdehydrogenase A (LDHA) und Pyruvatdehydrogenasekinasen (PDKs) sind als Schlüsselregulatoren der aeroben Glykolyse bekannt, die Laktat aus Pyruvat produziert [10,11]. Die Kombination von Dichloracetat, einem etablierten Inhibitor von PDK, stellt die Empfindlichkeit gegenüber 5FU wieder her [12]. Darüber hinaus wurde LDHA, ein Schlüsselenzym, das die Umwandlung von Pyruvat in Laktat katalysiert, als potenzielles Ziel für die Behandlung von Magenkrebs beschrieben [13,14]. Die Unterdrückung der LDHA-Expression in Krebszellen hemmt die Tumorentstehung durch Erhöhung der mitochondrialen Atmung und Verringerung der Zelllebensfähigkeit [15]. Mehrere LDHA-Inhibitoren wie FX11, PSTMB und GSK 2837808A verringern die ATP-Spiegel und erzeugen oxidativen Stress und verursachen schließlich den apoptotischen Zelltod [16-18]. Obwohl eine Studie gezeigt hat, dass die Hemmung von LDHA durch microRNA-34a die Resistenz gegen 5FU bei Dickdarmkrebs wiederherstellt [19], hat keine frühere Studie die Auswirkungen genetischer oder pharmakologischer LDHA-Inhibitoren auf die Chemoresistenz berichtet.

Polyphenole aus grünem Tee, darunter Catechin (CA), Epicatechin (EC), Gallocatechin (GC), Epigallocatechin (EGC), Epicatechin-3--Gallat (ECG) und Epigallocatechin-3--Gallat (EGCG), fördern den Menschen Gesundheit durch Vorbeugung und Behandlung verschiedener Krankheiten, darunter Entzündungen, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und bösartiger Krebs [20,21]. Unter den Polyphenolen verstärkt EGCG die 5FU-Chemosensitivität in Darmkrebs- und hepatozellulären Karzinomzellen, indem es die AMPK-Wege aktiviert und die Krebsstammbildung einschränkt [22,23]. Darüber hinaus wurde berichtet, dass EGCG LDHA hemmt, indem es seine Expression in den Brust- und Bauchspeicheldrüsenkrebszellen unterdrückt [24,25].

In dieser Studie stellten wir die Hypothese auf, dass CA ein Kandidat für ein adjuvantes Medikament zur Verringerung der Resistenz gegen 5FU in Magenkrebszellen sein könnte. Es wurde untersucht, dass die inhibitorische Wirkung von CA und/oder seiner Kombination mit 5FU auf die LDHA-Aktivität dadurch mitochondriale reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und apoptotischen Zelltod in 5FU-resistenten Zellen induzierte.

2. Ergebnisse

2.1. Glykolytische Eigenschaften von 5FU-resistenten Zellen

Eine verstärkte Proliferation ist ein Merkmal der Chemoresistenz, einschließlich 5FU-resistenter Krebszellen [26,27]. Zunächst bestätigten wir die Resistenz gegenüber 5FU und die langfristigen Wachstumsraten von SNU620- und SNU620/5FU-Zellen. Wenn diese Zellen mit den angegebenen Konzentrationen von 5FU für 48 Stunden kultiviert wurden, war die geschätzte Dosis, die eine 50-prozentige Wachstumshemmung (Gl50) in SNU620/5FU-Zellen (100,63 uM) verursachte, viel höher als die, die GIso in ihren elterlichen SNU620-Zellen verursachte (28,88 μM). ）（Abbildung 1A und ergänzende Abbildung S1）. Darüber hinaus waren die Wachstumsraten von SNU620/5FU-Zellen schneller als die von SNU620-Zellen (Abbildung 1B und ergänzende Abbildung S2). Da Chemoresistenz und schnell wachsende Eigenschaften mit erhöhten glykolytischen Eigenschaften in Magenkrebszellen zusammenhängen könnten [28], wurden die extrazellulären Ansäuerungsraten (ECAR) und Sauerstoffverbrauchsraten (OCR) in beiden Zellen in Gegenwart von Oxamat, einem bekannten Oxamat, gemessen Glykolysehemmer oder nicht. Die Ergebnisse zeigten, dass SNU620/5FU-Zellen signifikant mehr Laktat absonderten als SNU620-Zellen und anschließend das Kulturmedium ansäuerten (Abbildung 1C und ergänzende Abbildung S3). Zwischen diesen Zellen wurde jedoch keine signifikante Änderung der OCR beobachtet (Abbildung 1D). Die mRNA- und Proteinexpressionsniveaus von LDHA wurden gemessen. Die LDHA-Expression war in SNU620/5FU-Zellen höher als in SNU620-Zellen (Abbildung 1E, F). Darüber hinaus untersuchten wir die mRNA- und Proteinexpressionsniveaus von PDK-Isotypen und stellten fest, dass die von PDK2 und PDK3 in SNU620/5FU-Zellen höher waren als in SNU620-Zellen (ergänzende Abbildung S4A, B). Die Phosphorylierung der E1-Untereinheit der Pyruvatdehydrogenase (PDHA1), die durch PDKs erhöht wurde, wurde ebenfalls bewertet, und es wurde festgestellt, dass sie in SNU620 / 5FU-Zellen höher war als in SNU620-Zellen (ergänzende Abbildung S4C). Außerdem verwendeten wir Oxamat als LDHA-Inhibitor zur Überwindung der 5FU-Resistenz in SNU620/5FU-Zellen. Diese Verbindung hemmte das Zellwachstum sowohl in SNU620- als auch in SNU620/5FU-Zellen (ergänzende Abbildung S5). Darüber hinaus unterdrückte die gleichzeitige Behandlung mit Oxamat und 5FU das Zellwachstum im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Oxamat oder 5FU in SNU620/5FU-Zellen (Abbildung 1G). Diese Daten legen nahe, dass SNU620/5FU-Zellen LDHA stark exprimieren und die Hemmung der LDHA-Aktivität die Resistenz von SNU/5FU-Zellen gegenüber 5FU überwinden kann.

Abbildung 1. Den Ergebnissen zufolge haben 5-Fluorouracil (5FU)-resistente Zellen eine erhöhte glykolytische Eigenschaft: (A)SNU620- und SNU620/5FU-Zellen wurden 48 Stunden lang mit den angegebenen Konzentrationen von 5FU behandelt. Die Lebensfähigkeit dieser Zellen wurde mittels MTT-Assay bewertet; (B) Wachstumsniveaus von SNU620- und SNU620/5FU-Zellen wurden jeden Tag für 4 Tage mit MTT-Assay gemessen; (C, D) SNU620- und SNU620/5FU-Zellen wurden mit Oxamat behandelt ( 5 mM) oder nicht für 24 h, und die ECAR- und OCR-Werte wurden mit dem Seahorse XF-Analysator ausgewertet; (E, F) die Expression von LDHA in SNU620- und SNU620/5FU-Zellen wurde über qRT-PCR und Western-Blot-Analyse nachgewiesen; (G) SNU620- und SNU620/5FU-Zellen wurden 48 Stunden lang mit Oxamat (25 mM) und/oder 5FU (10 μM) behandelt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM dargestellt.**S<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

2.2. CA unterdrückt die LDHA-Aktivität

Die Laktatproduktion wurde mit CA und seinen Derivaten, einschließlich EC, GC, EGC und EGCG, in SNU620/5FU-Zellen analysiert. Im Vergleich zu diesen Derivaten reduzierte CA die Laktatproduktion effektiver (Abbildung 2A). Ferner wurde in vitro der LDHA-Aktivitätsassay bestätigt, und CA zeigte eine stärkere Hemmwirkung auf die LDHA-Aktivität als die seiner Derivate (Fig. 2B). Die inhibitorischen Wirkungen von CA auf die LDHA- und LDHB-Aktivitäten in vitro wurden dosisabhängig gemessen. CA hemmte die LDHA-Aktivität, ohne die LDHB-Aktivität zu beeinflussen (Abbildung 2C, D). Zusätzlich wurden die LDHA- und LDHB-Aktivitäten mit EGCG gemessen, von dem bekannt ist, dass es die LDHA-Aktivität hemmt, und es wurde festgestellt, dass es dosisabhängig abnahm (ergänzende Abbildung S6A, B). Darüber hinaus wurden intrazelluläre LDHA- und LDHB-Aktivitäten mit den angegebenen CA-Konzentrationen in SNU620/5FU-Zellen bewertet. CA hemmte die LDHA-Aktivität in einer dosisabhängigen Weise in vitro-Ergebnissen, aber nicht die LDHB-Aktivität (Fig. 2E, F). Die Proteinexpressionsniveaus von p-PDHA1, PDK2, PDK3 und LDHA wurden auch in SNU620/5FU-Zellen nach CA-Behandlung gemessen (ergänzende Abbildung S7), und wir stellten fest, dass diese durch diese Behandlung nicht beeinflusst wurden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass CA die LDHA-Aktivität reguliert, ohne ihre Expression zu beeinflussen.

2.3. Wirkungsweise der LDHA-Hemmung durch CA

Um den Hemmungsmechanismus der LDHA-Aktivität auf CA und seine Derivate zu analysieren, führten wir die molekulare Modellierung der Bindungswechselwirkung zwischen menschlichem rekombinantem LDHA und CA durch (Abbildung 3A,B). Die Ergebnisse zeigten, dass CA mit den Resten von T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192 und T247 von LDHA interagieren kann. Darunter sind R105, S136 und R168 entscheidend für die Substrat-(Pyruvat-)Bindung. Daher nahmen wir an, dass CA die Substratbindungsstellen stören könnte. Im Gegensatz dazu wird EGCG über eine andere Stelle an LDHA gebunden. Um die Wirkungsweise der LDHA-Hemmung durch CA weiter zu verifizieren, wurden die Michaelis-Menten- und Lineweaver-Burk-Plots mit verschiedenen Konzentrationen von Pyruvat und CA bestätigt. Die LDHA-Aktivität wurde in Abhängigkeit von der Pyruvat-Dosis erhöht. Dies wurde jedoch durch die Erhöhung von CA umgekehrt. Somit zeigten die Ergebnisse der Michaelis-Menten- und Lineweaver-Burk-Diagramme, dass die CA ein nicht kompetitiver Inhibitor von LDHA ist (Abbildung 3C, D). Darüber hinaus zeigten die Daten der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC), dass CA durch eine Kd physikalisch an LDHA bindet Wert von 197 uM (ergänzende Abbildung S8). Diese Ergebnisse liefern Einblicke, dass CA die LDHA-Aktivität unterdrückt, indem es an die Substratbindungsstelle von LDHA bindet.

2.4. CA sensibilisiert die 5FU-Resistenz durch Verringerung der LDHA-Aktivität

Wir bewerteten die zytotoxischen Wirkungen von CA auf SNU620- und SNU620/5FU-Zellen und stellten fest, dass CA das Wachstum in beiden Zellgruppen unterdrückte (Abbildung 4A). Um zu verifizieren, dass die Wachstumshemmung mit der Unterdrückung der LDHA-Aktivität zusammenhängt, wurde die Expression von LDHA durch kurze Haarnadel-Ribonukleinsäure (shRNA) für LDHA (shLDHA) aufgehoben und ihre Expression durch Transfektion von LDHA-exprimierendem Plasmid wiederhergestellt (ergänzende Abbildung S9A, B ). In shLDHA-transfizierten SNU620/5FU-Zellen wurden die Laktatproduktion und die Zelllebensfähigkeit durch die CA-Behandlung im Vergleich zu denen von scheintransfizierten Zellen nicht merklich verändert ( 4B , C). Außerdem war die wachstumshemmende Wirkung von CA erhöht durch die Wiederherstellung der LDHA-Expression in LDHA-Knockdown-SNU620/5FU-Zellen (Abbildung 4D). Weiterhin wurden SNU620- und SNU620/5FU-Zellen nach der Behandlung von CA und 5FU einzeln oder der Kombination von beiden untersucht. Die gleichzeitige Behandlung mit CA und 5FU hemmte signifikant das Wachstum von SNU620/5FU-Zellen (Abbildung 4E). Darüber hinaus wurden Kombinationseffekte von CA und 5FU in mehreren anderen Zelllinien, wie z. B. humanem Magenkrebs AGS, Bauchspeicheldrüsenkrebs Panic-1, MIA PaCa-2 und Dickdarmkrebs LS174T und RKO-Zellen, im Vergleich untersucht Zellen SNU620 und SNU620/5FU. Die Laktatproduktion und die LDHA-Expression korrelierten gut miteinander, und diese glykolytischen Eigenschaften sind bei SNU620/5FU, AGS und RKO relativ hoch (ergänzende Abbildung S10A, B). Darüber hinaus reduzierte die Kombinationsbehandlung von CA und 5FU die Lebensfähigkeit von Zellen im Vergleich zu einer Einzelbehandlung von 5FU in glykolytischen Zellen, einschließlich AGS und RKO (ergänzende Abbildung S10C). Die gleichzeitige Behandlung mit CA und 5FU hemmte jedoch das Wachstum in SNU620-, Panic-1-, MIA PaCa-2- und LS174T-Zellen nicht signifikant, die niedrige LDHA-Expressionen zeigten. Diese Ergebnisse legten nahe, dass die sensibilisierende Wirkung von CA auf 5FU-resistente Zellen mit seiner hemmenden Wirkung auf die LDHA-Aktivität zusammenhängen könnte.

Abbildung 2. Catechin (CA) hemmt die LDHA-Aktivität, aber nicht ihre Expression: (A) Die Laktatproduktion von SNU620/5FU wurde nach einer 24-stündigen Behandlung mit CA-Derivaten (10 μM) gemessen; (B) die In-vitro-LDHA-Aktivität wurde nach der Behandlung bewertet mit CA-Derivaten (10 uM) und Oxamat (20 mM); (C, D) in vitro wurden die LDHA- und LDHB-Aktivitäten mit den angegebenen CA-Konzentrationen abgeschätzt; (E, F) Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit den angegebenen CA-Konzentrationen behandelt. Intrazelluläre LDHA- und LDHB-Aktivitäten wurden unter Verwendung der Zelllysate als Enzymquelle gemessen. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM gezeigt. **p<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Abbildung 4. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch die gleichzeitige Behandlung mit Catechin (CA) und 5- Fluorouracil (5FU) in 5FU-resistenten Zellen gehemmt: (A) Die Lebensfähigkeit von SNU620- und SNU620/5FU-Zellen wurde nach der Behandlung mit den angegebenen Konzentrationen von CA für 48 h; (B) SNU620/5FU-pLKO.1- und SNU620/5FU-shLDHA-Zellen wurden mit CA (10 μM) für 24 h behandelt. Die Laktatproduktion wurde in den Kulturmedien von SNU620/5FU-pLKO.1- und SNU620/5FU-shLDHA-Zellen gemessen; (C, D)SNU620/5FU-pLKO.1, SNU620/5FU-shLDHA, SNU620/5FU-shLDHA plus EV und SNU620/5FU-shLDHA plus LDHA#2-Zellen wurden mit den angegebenen CA-Konzentrationen für 48 h behandelt. Die Zelllebensfähigkeit wurde mit einem MTT-Assay gemessen; (E) SNU620- und SNU620/5FU-Zellen wurden 48 h lang mit CA (10 μM) und/oder 5FU (10 μM) behandelt. Die Lebensfähigkeit dieser Zellen wurde mittels MTT-Assay gemessen. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM.*p dargestellt<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Dieser Artikel ist aus Int. J.Mol. Wissenschaft. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms