Experiment 4 Wirkung von Cistanche Deserticola Phenylethanolglycosid auf das perimenopausale Syndrom der Maus Depression Modellmaterialien und Methoden 1 Experimentelle Materialien

1.1 Versuchstiere

SPF-Mäuse, Kunming-Rasse, weiblich, 18–22 g, bereitgestellt von Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., Zertifikatsnummer dieser Mäusecharge: 0016003; Laborzertifikatsnummer SYXK (Yu) 2010-001. 1.2 Experimentelle Medikamente

Cistanche-Phenylethanolglycosidwurde nach der Methode von Experiment 1 hergestellt und der Gehalt erreichte 66,47 %. Gengnian'an-Kapsel, Inhaltsstoffe: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, Pfingstrosenrinde, Poria cocos, Perlmutt, Curculigo, Schisandra chinensis, Magnetit, Polygonum multiflorum-Rebe, Uncaria, schwimmender Weizen, Polygonum multiflorum. Funktionen und Indikationen:Nähren Sie Yin und unterdrücken Sie Yang, lindern problemeUndberuhige den Geist. Wird bei Hitzewallungen und Schwitzen in den Wechseljahren, Schwindel, Tinnitus, Reizbarkeit und Schlaflosigkeit angewendet. Spezifikationen: 0,3g pro Kapsel. Anwendung und Dosierung: Oral, 3 Kapseln auf einmal, 3-mal täglich. Hersteller: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Produktionschargennummer: 121104. Zulassungsnummer: National Drug Approval No. Z14021848.

WIE LANGE DAUERT ES, BIS CISTANCHE WIRKT?

Soja-Isoflavone und Vitamin E-Weichkapseln, Zutatenliste: Soja-Isoflavone-Pulver, Vitamin E, Sonnenblumenöl, Gelatine, Glycerin, Wasser, Tartrazin, Titandioxid. Kultige Inhaltsstoffe und Inhalt: Jede 100 g enthält 55,2 mg Soja-Isoflavone (berechnet als Genistein) und 608,5 mg Vitamin E. Gesundheitsfunktionen: Erhöhung der Knochendichte. Anleitung und Dosierung: 2 mal täglich 1 Kapsel mit warmem Wasser einnehmen. Spezifikationen: 500 mg×100 Kapseln. Hersteller: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Produktionschargennummer: 13070302. Zulassungsnummer: Guoshijianzi G20080032. 1.3 Experimentelle Reagenzien

Natriumcarboxymethylcellulose, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., Chargennummer: 20120418; Penicillin-Natrium zur Injektion, North China Pharmaceutical Co., Ltd., Spezifikation: 4 Millionen Einheiten, Produktionschargennummer: c1206807; Formaldehydlösung (analytische Qualität), Yantai City Shuangshuang Chemical Co., Ltd., Produktionschargennummer: 20130902; 0,9 % Natriumchlorid-Injektion, Chenxin Pharmaceutical Co., Ltd.; Spezifikation: 250 ml, Produktionschargennummer: 1301265303;

Chloralhydrat, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, Chargennummer 20120827; Maus-E2-ELISA-Nachweiskit, R&D Company, Chargennummer: 20140101A; Maus-T-ELISA-Nachweiskit, R&D Company, Chargennummer: 20140101A; Maus-LH-ELISA-Nachweiskit, R&D Company, Chargennummer: 20140101A; Maus-FSH-ELISA-Nachweiskit, R&D Company, Chargennummer: 20140101A;

Maus-DA-ELISA-Nachweiskit, R&D Company, Chargennummer: 20140101A; Maus 5-HT ELISA-Nachweiskit, R&D Company, Chargennummer: 20140101A. 1.4 Experimentelle Instrumente

Elektronische Waage, Shanghai Minqiao Medical Instrument Co., Ltd., Modell: JY601; elektronische Analysenwaage, Ohaus (Shanghai) Company, Modell: AR1140/C; Hochgeschwindigkeits-Tischzentrifuge, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory, Modell: TGL-168 ; Elektrisches thermostatisches Wasserbad, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd., Modell: HWS12; Autonomer Aktivitätstester der Maus, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., Modell: ZZ-6; Maus-Dunkelvermeidungsmessgerät, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., Modell: BA-200; Heckaufhängungstester, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., Modell: TS-200; Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge, Zhongjia Branch von HKUST Innovation Co., Ltd., Modell: KDC-160HR; einstellbares Pipettierinstrument, Shanghai Leibo Analytical Instrument Co., Ltd.;

Mikroplatten-Reader, American BIO-RAD Company, Modell: 680;

Elektrisches Mikroskop, Japan OLYMPUS Company, Modell: BX61.

2 Experimentelle Methoden

2.1 Modellierung und Arzneimittelverabreichung

90 weibliche Kunming-Mäuse mit einem Körpergewicht von 23-25g wurden ausgewählt, und 10 wurde zufällig als Blindgruppe ausgewählt und einer Scheinoperation unterzogen, und die restlichen Mäuse wurden zur Erstellung verwendet Perimenopausale Modelle. Nach dem Wiegen wurden die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 1 0 % Chloralhydrat (0,03 ml/10 g) anästhesiert und die Bauchposition fixiert. Dann wurden die Haare vom Rücken der Maus unter der letzten Rippe, am Schnittpunkt der mittleren Achsellinie und etwa 1 cm von der Außenseite der Wirbelsäule entfernt, abgeschnitten und nach der Desinfektion eingeschnitten. Die Haut und die Rückenmuskulatur sind etwa 0,5-1cm breit. Im Schnittfeld ist eine milchig weiß glänzende Fettmasse zu erkennen, in der der Eierstock eingebettet ist. Greifen Sie die Fettmasse vorsichtig mit einer kleinen Pinzette und ziehen Sie sie aus dem Einschnitt. Trennen Sie die Fettmasse und Sie werden eine Gruppe dünner, unregelmäßiger, gelb-roter Eierstöcke sehen. Beim Schneiden werden zunächst die Eileiter (einschließlich Fett) mit dünnen Fäden unter den Eierstöcken abgebunden und dann die Eierstöcke entfernt. Nach der Operation werden die Gebärmutterhörner wieder in die Bauchhöhle eingesetzt, die Muskeln und die Haut vernäht und beide Eierstöcke auf die gleiche Weise entfernt. Nach der Operation wurden die Tiere sorgfältig aufgezogen und Penicillin 200,000 E/kg (jeweils 0,1 ml) wurde an drei aufeinanderfolgenden Tagen einmal täglich intramuskulär injiziert, um eine Infektion zu verhindern. 5 Tage nach der Operation wurde an 5 aufeinanderfolgenden Tagen bei jeder Maus nacheinander einmal täglich ein Vaginalabstrich durchgeführt, um festzustellen, ob die Eierstöcke vollständig entfernt wurden. Die Mäuse, die im Abstrich eine Brunstreaktion zeigten, wurden verworfen und 60 vollständig kastrierte Mäuse wurden zu Versuchszwecken zufällig und gleichmäßig in 6 Gruppen aufgeteilt, nämlich Modellgruppe, Mengnianan-Gruppe, Soja-Isoflavon-Gruppe, groß, mittel undNiedrig dosierte Cistanche-Phenylethanolglycosidgruppe. Den Tieren jeder Gruppe wurden am 10. Tag nach der Operation entsprechende Medikamente verabreicht. Nach 6-tägiger Verabreichung wurden 5 Mäuse in der Blindgruppe pro Käfig mit normalem Futter und Wasser ohne jegliche Stimulation aufgezogen. Die 6 Modellgruppen wurden alle mit einer Maus pro Käfig aufgezogen und erhielten jeden Tag nach dem Zufallsprinzip unterschiedliche Stimulationen. Sieben Stressfaktoren wurden innerhalb von 18 Tagen zufällig angewendet: feuchte Einstreu (1 g Einstreu/1 ml Wasser); Schwimmen im Eiswasser (4 Grad, 5 Min.); Hitzestress (45 Grad, 5 Min.); Nachtbeleuchtung (24h); Schwanzklemmen (1 Min.); Wasserentzug (24 h); Fasten (24h). Jeden Tag wurde zufällig ein Reiz gegeben, und jeder Reiz konnte 18 Tage lang nicht kontinuierlich auftreten.

Zubereitungsmethode: 0,5 % CMC Zubereitungsmethode: 4 g Carboxymethylcellulose-Natrium abwiegen und mit destilliertem Wasser auf 800 ml mischen.

Die Dosierungen der großen, mittleren und kleinen Dosen der Cistanche-Phenylethanolglycosidgruppe betrugen 200mg/kg, 10{{20}}mg/kg und 50mg/kg bzw. (Verabreichungsvolumen 0,1 ml/10 g). Zubereitungsmethode: 2000 mg, 1000 mg bzw. 500 mg Cistanche-Phenylethanoidglykosid abwiegen, mit einer kleinen Menge 0,5 % CMC auflösen, dann das Volumen auf 100 ml einstellen, gut mischen und fertig. Gengniangan-Kapseln (675 mg/kg, gemischt mit destilliertem Wasser auf 67,5 mg/ml, 0,1 ml/10 g, entspricht dem 15-fachen der klinischen Dosierung); Zubereitungsmethode: Nehmen Sie 9 Gengniangan-Kapseln, verwenden Sie zuerst eine kleine Menge 0,5 % CMC Dissolve, stellen Sie dann das Volumen auf 40 ml ein und mischen Sie gut, um die Dosis der Gengnianan-Kapselsuspension (675 mg/kg) zu erhalten. Sojabohnen-Isoflavone-Vitamin-E-Weichkapsel (250 mg/kg, mit destilliertem Wasser 25 mg/ml herstellen, 0,1 ml/10 g, entspricht dem 15-fachen der klinischen Dosierung); Zubereitungsmethode: Nehmen Sie 2 Sojabohnen-Isoflavon-Vitamin-E-Weichkapseln und verwenden Sie diese zuerst. Lösen Sie eine kleine Menge 0,5 % CMC auf, stellen Sie dann das Volumen auf 40 ml ein und mischen Sie gut, um die Dosis der Soja-Isoflavon-Vitamin-E-Weichkapselsuspension (250 mg/kg) zu erhalten ). Aufbewahrungsmethode: Im Kühlschrank aufbewahren, während des Gebrauchs warm halten.

Verabreichungsmethode: Den Tieren jeder Gruppe wurden am 10. Tag nach der Operation entsprechende Medikamente verabreicht. Der Gengnian'an-Gruppe wurde oral eine Gengnian'an-Kapselsuspension von 675 mg·kg-1 verabreicht, der Soja-Isoflavon-Gruppe wurden oral 250 mg·kg-1 Soja-Isoflavon-Vitamin-E-Weichkapselsuspension verabreicht, und große, mittel undkleine Dosen CistanchePhenylethanol. Der Glykosidgruppe wurden große, mittlere und kleine Dosen von Cistanche-Phenylethanolglykosid 200mg·kg-1, 10 mg·kg-1, 50 mg·kg{{ oral verabreicht. 5}}, jeweils 0,1 ml/10 g. Der Blindgruppe und der Modellgruppe wurde 30 aufeinanderfolgende Tage lang einmal täglich das gleiche Volumen einer 0,5 %igen CMC-Lösung verabreicht.

2.2 Beobachtungsgegenstände und Nachweismethoden

Zwangsschwimmen: Am ersten Tag nach dem Ende der chronischen Stressstimulation wurde die Immobilitätszeit der Mäuse in jeder Gruppe innerhalb von 6 Minuten für 2-6 Minuten gemessen. (Setzen Sie die Mäuse jeder Gruppe in ein 2000-ml-Becherglas. Die Wassertemperatur beträgt 25 Grad. Zusätzlich zu der notwendigen Mindestbewegung, die zum Aufrechterhalten des Schwebens erforderlich ist, hören die Gliedmaßen der Tiere auf, sich zu bewegen, und werden als unbeweglich aufgezeichnet. Notieren Sie die gesamte Immobilitätszeit ab 2 bis 6 Minuten innerhalb von 6 Minuten. ) Freiwilliger Aktivitätstest: Am zweiten Tag nach Ende der chronischen Stressstimulation wurde die Anzahl der spontanen Aktivitäten der Mäuse in jeder Gruppe innerhalb von 5 Minuten gemessen.

Methode zur Vermeidung von Dunkelheit: Legen Sie am dritten Tag nach dem Ende der chronischen Stressstimulation den Schwanz der Maus in die Messbox mit Blick auf die kleine Öffnung in die Dunkelkammer und führen Sie das Training durch. Messen Sie nach 24 Stunden erneut die Latenz, bis die Maus die Dunkelkammer zum ersten Mal betritt, und die Zeit, die benötigt wird, um die Dunkelkammer innerhalb von 5 Minuten zu betreten. Anzahl der Stromschläge.

Schwanzaufhängungstest: Am 5. Tag nach dem Ende der chronischen Stressstimulation wurde die Immobilitätszeit der Mäuse in jeder Gruppe innerhalb von 6 Minuten für 2-6 Minuten gemessen.

2 Stunden nach der letzten Dosis (12 Stunden ohne Futter oder Wasser) wurden die Mäuse gewogen, die Augäpfel entfernt, Blut gesammelt, das Serum abgetrennt und der Gehalt an E2, T, LH und FSH im Serum bestimmt gemessen; Anschließend wurden die Mäuse durch Luxation der Halswirbel getötet und die Mäuse seziert. Entfernen Sie Thymusdrüse, Milz und Uterusgewebe, wiegen Sie ihr Nassgewicht und berechnen Sie den Organindex (Organindex=Organfeuchtgewicht mg/Mausgewicht g), dann entfernen Sie das Gehirn, schneiden Sie die Hälfte ab und bereiten Sie das Gehirn vor Gewebehomogenat. Mithilfe eines Enzymimmunoassays wurde der Gehalt der Monoamin-Neurotransmitter 5-HT und DA im Hirngewebehomogenat bestimmt. Die Gewebe von Thymus, Milz, Gebärmutter und Gehirn wurden in 10 %iger Formaldehydlösung fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit HE gefärbt. Die morphologischen Veränderungen jeder Gruppe wurden unter einem Lichtmikroskop beobachtet. 2.3 Kit-Bestimmungsmethode

Serumproben entnehmen: Verwenden Sie Reagenzgläser, die frei von Pyrogenen und Endotoxinen sind. Vermeiden Sie während der Operation jegliche Zellstimulation. Nachdem Sie das Blut entnommen haben, zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 3000 U/min, um das Serum und die roten Blutkörperchen schnell und sorgfältig zu trennen. Erhalten Sie Gewebehomogenatproben: Geben Sie eine angemessene Menge physiologischer Kochsalzlösung zum Gewebe und zerdrücken Sie es. 10 Minuten bei 3000 U/min zentrifugieren und den Überstand entnehmen.

Die Bestimmungsmethode des Maus-Östradiol (E2)-ELISA-Kits ist die gleiche wie in Experiment 2. Die Konzentrationen der Standardprodukte (S0-55) sind: 0, 4, 8, 16, 32 und 64 pmol/L.

Die Bestimmungsmethode des Mouse Testosterone (T) ELISA-Kits ist die gleiche wie die von Östradiol (E2). Die Konzentrationen der Standardprodukte (S0-55) sind: 0, 50, 100, 200, 400, 800 pg/ml.

Die Bestimmungsmethode des ELISA-Kits für follikelstimulierendes Hormon (FSH) der Maus ist die gleiche wie die von Östradiol (E2). Die Konzentrationen der Standardprodukte (S0-55) sind: 0, 5, 10, 20, 40 und 8{{30} }mIU/ml. Die Bestimmungsmethode des ELISA-Kits für luteinisierendes Hormon (LH) der Maus (Maus) ist die gleiche wie die von Östradiol (E2). Die Konzentrationen des Standards (S0-55) betragen: 0, 0,5, 1, 2, 4 und 8 mIU/ml. Die Bestimmungsmethode des Maus-ELISA-Kits für 5-Hydroxytryptamin (5-HT) ist dieselbe wie die von Östradiol (E2). Die Konzentrationen der Standardprodukte (S0-55) betragen: 0, 15, 30, 60, 120, 240 ng/ml. Die Bestimmungsmethode des Maus-(Maus-)Dopamin (DA)-ELISA-Nachweiskits ist die gleiche wie die von Östradiol (E2). Die Konzentrationen der Standardprodukte (S0-55) betragen: 0, 7,5, 15, 30, 60 und 120 pg/ml.

Aus Tabelle 21 und Abbildung 25 ist ersichtlich, dass im Vergleich zur Blindgruppe die Immobilitätszeit der Mäuse in der Modellgruppe in den Experimenten mit erzwungenem Schwimmen und Schwanzaufhängung signifikant zunahm (P<0.01), indicating that perimenopausal model mice with depression Increased levels of despair about adverse circumstances. Compared with the model group, the forced swimming immobility time and tail suspension immobility time of mice in each drug group were significantly reduced (P<0.01).

2 Auswirkungen auf autonome Aktivitäten bei Modellmäusen mit perimenopausaler Depression

Die Ergebnisse des autonomen Aktivitätstests von Mäusen in jeder Versuchsgruppe sind in Tabelle 22 und Abbildung 26 dargestellt.

Aus Tabelle 23 und den Abbildungen 27 und 28 ist ersichtlich, dass im Vergleich zur Blindgruppe die Latenzzeit der Mäuse in der Modellgruppe deutlich verkürzt und die Anzahl der Elektroschocks deutlich erhöht war (P<0.01), reflecting the decline in memory of the perimenopausal depression model mice. . Compared with the model group, the number of electric shocks received by mice in each administration group was significantly reduced (P<0.01), and the latency of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Mengnianan group, and soybean isoflavones group was significantly reduced (P<0.01). extension (P<0.01). The latent period of mice in the medium and small doses of Cistanche phenylethanoid glycoside group was significantly prolonged (P<0.05).

4 Auswirkungen auf den Organindex bei Modellmäusen mit perimenopausaler Depression

Aus Tabelle 24 und Abbildung 29 ist ersichtlich, dass im Vergleich zur Blindgruppe der Thymusindex, der Milzindex und der Uterusindex der Modellgruppe signifikant reduziert waren (P<0.01), indicating that the perimenopausal depression mouse model had thymus, spleen, and uterus index. Shrinkage of the organization. Compared with the model group, the thymus index, spleen index, and uterine index of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group could be significantly increased (P<0.01). The medium-dose Cistanche-PhenylethanolglycosidGruppe Der Thymusindex und der Uterusindex von Mäusen können deutlich erhöht sein (P<0.01), and the spleen index can be significantly increased (P<0.05).