Der Farnesyltransferase-Inhibitor LNK-754 mildert axonale Dystrophie und reduziert die Amyloid-Pathologie bei Mäusen Teil 2

Live-Bildgebung von Neuronen

Für Live-Imaging-Experimente wurden Neuronen wie oben vorbereitet und in 35-mm-Glasbodenschalen (MatTek # P35G-1.5-14C) für 7 Tage in Kultur ausplattiert. Anschließend wurden 10 nM LNK-754 oder Lonafarnib zu den konditionierten Medien gegeben, Kontrollkulturen wurden mit DMSO als Vehikel behandelt. Nach 48 Stunden Behandlung wurde das Medium durch konditioniertes Medium aus unbehandelten parallelen Neuronenplatten ersetzt. 25 nM LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) wurden zu den konditionierten Medien gegeben und die Neuronen wurden 30 Minuten lang bei 37 Grad inkubiert.

Neuronen sind ein wichtiger Teil des Nervensystems, der in der Lage ist, Informationen zu empfangen, zu verarbeiten und zu übertragen, und sie sind die materielle Grundlage der menschlichen Intelligenz und des menschlichen Verhaltens. Immunität ist eine wichtige Garantie dafür, dass der menschliche Körper Krankheiten widerstehen kann. Es kann Krankheitserreger und abnormale Zellen identifizieren und zerstören und die Gesundheit des Körpers erhalten.

Untersuchungen zeigen, dass eine starke Verbindung zwischen Neuronen und dem Immunsystem besteht. Neuronen können das Immunsystem beeinflussen, indem sie eine Vielzahl von Neurotransmittern wie Noradrenalin, Adrenalin usw. freisetzen. Diese Neurotransmitter können die Aktivität von Immunzellen verändern, die Proliferation und Funktion von Immunzellen fördern und die Immunität des Körpers verbessern. Gleichzeitig kann das Immunsystem über verschiedene Wege auch die Funktion von Neuronen beeinflussen. Immunzellen können eine Vielzahl von Zytokinen und Hormonen absondern und so über Immunwege das Wachstum, die Entwicklung und die Funktion von Neuronen beeinflussen.

Darüber hinaus können psychologische und soziale Faktoren die Immunität und neuronale Funktion beeinflussen. Negative Emotionen wie Stress, Angstzustände und Depressionen können das Immunsystem und die Neuronen beeinträchtigen und die Immunität des Körpers schwächen. Positive Emotionen, positive soziale Beziehungen und ein gesunder Lebensstil können die gesunde Entwicklung von Immunität und Neuronen fördern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es eine interaktive und sich gegenseitig unterstützende Beziehung zwischen Neuronen und Immunität gibt. Die Aufrechterhaltung der psychischen Gesundheit, eine positive Einstellung zum Leben und die Annahme guter Lebensgewohnheiten können die Immunität des Körpers und die gesunde Entwicklung von Neuronen fördern. Es ist ersichtlich, dass wir unser Gedächtnis verbessern müssen. Cistanche deserticola kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche deserticola auch das Gleichgewicht von Neurotransmittern regulieren kann, beispielsweise durch die Erhöhung des Acetylcholinspiegels und der Wachstumsfaktoren. Diese Stoffe sind sehr wichtig für das Gedächtnis und das Lernen. Darüber hinaus kann Fleisch auch die Durchblutung verbessern und die Sauerstoffversorgung fördern, wodurch sichergestellt werden kann, dass das Gehirn ausreichend Nährstoffe und Energie erhält und so die Vitalität und Ausdauer des Gehirns verbessert werden.

Klicken Sie auf Möglichkeiten zur Verbesserung der Gehirnfunktion

Die Zeitrafferaufnahme von Neuronen wurde mit einem Ti2-Weitfeldmikroskop durchgeführt. Die Bildgebung begann sofort nach 30 Minuten und dauerte nicht länger als 30 Minuten. 1-s Aufnahmen wurden jede Minute gemacht und 20–30 separate Bereiche pro Schale wurden innerhalb von 30 Minuten abgebildet. Die Abstands- und Geschwindigkeitsquantifizierungen von LysoTracker-Partikeln und Kymographenanalysen wurden mit der NIS Elements-Software durchgeführt und im Folgenden ausführlich beschrieben. In separaten Experimenten wurde 1 μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) zu konditionierten Medien hinzugefügt und mit einem konfokalen Nikon A1-Mikroskop mit einem 60-fach-Objektiv wurden nicht länger als 15 Minuten lang aufgenommene Bilder lebender Neuronen aufgenommen (NA 1.4) und NIS Elements-Software.

Live-Bildgebung von Gehirngewebe

{{0}} Monate alte 5XFAD-Mäuse wurden 3 Wochen lang täglich ip injiziert und nach Abschluss der Behandlung wurden die Mäuse anästhesiert und mit einer Lösung perfundiert, die 1 M KCl, 1 M MgCl2, 0,1 mM Kynurenat enthielt , 0,01 mM DL-2-Amino-5-phosphonopentansäure, 5 mM Glutathion, 25 mM Glucose, 125 mM NaCl, 1,4 mM NaH2PO4 und 25 mM NaHCO3.

Die Gehirne wurden dann schnell in eiskaltem, sauerstoffhaltigem ACSF präpariert, das 2,5 mM KCl, 85 mM NaCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 2,5 mM CaCl2, 4 mM 4 MgCl2, 75 mM Saccharose, 25 mM Glucose enthielt. 50uM C6H7NaO6, 0,1 mM Kynurenat, 0,01 mM DL-2-Amino-5-phosphonopentansäure und 5 mM Glutathion. 300 μm große koronale Schnitte wurden mit einem Compresstome VF-200-Vibrationsmikrotom (Precision Instruments) erhalten und zur Erholung 30 Minuten lang bei 32 Grad in sauerstoffhaltiger ACSF-Lösung ruhen gelassen, die Folgendes enthielt: 2,5 mM KCl, 85 mM NaCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 0,5 mM CaCl2, 4 mM 4 MgCl2, 75 mM Saccharose, 25 mM Glucose, 50 uM C6H7NaO6, 0,1 mM Kynurenat, 0,01 mM DL2-Amino-5-phosphonopentansäure und 5 mM Glutathion.

Die Scheiben wurden dann in 35-mm-Glasbodenschalen (MatTek # P35G-1.5-14C) überführt, die sauerstoffhaltiges ACSF mit 25 nM LysoTracker-Green und einer 1:10,000-Verdünnung von 1 mg/d enthielten. ml Tiazinrot (#S570435, Sigma Aldrich), das ansonsten mit dem während der Erholungsphase verwendeten ACSF identisch war. Die Lebensfähigkeit der Schnitte wurde mithilfe von Zeitrafferaufnahmen von Geweben bestätigt. Die Schnitte wurden mit LysoTracker-Green und Tiazinrot 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann wurden kortikale Gehirnregionen sofort in derselben Lösung bei 32 Grad auf einem konfokalen Nikon A1-Mikroskop mit einem 60-fachen Objektiv (NA 1,4) und der NIS Elements-Software abgebildet nicht länger als 30 Minuten.

Gehirnextraktion und Immunblotting

Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von Xylazin (15 mg/kg) und Ketamin (100mg/kg anästhesiert und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1XPBS) mit Phenylmethylsulfonylfluorid (20 ug/ml) perfundiert. Leupeptin (0,5 ug/ml), Natriumorthovanadat (20 μM) und Dithiothreitol (0,1 mM), gefolgt von der Entfernung des Gehirns. Alle für die Proteinextraktion verwendeten Puffer enthielten den Proteaseinhibitor-Cocktail III (#535140, Millipore) und den Halt-Phosphataseinhibitor (#78420, Thermo Fisher Scientific). Hemihirngewebe wurden gewogen und manuell unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators 1:10 (Gew./Vol.) in 1XPBS homogenisiert.

Nach der Homogenisierung wurden die Lysate 30 Minuten lang bei 4 Grad mit 20,8{{10}}0g zentrifugiert. Die lösliche Fraktion (Überstand) wurde entfernt und das Pellet durch Pipettieren in RIPA-Puffer (Radioimmunpräzipitationsassay) [50 mM Tris, 0,15 M NaCl, 1 % Octylphenoxypolyethoxyethanol (IGEPAL), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1 % SDS und 0,5 mM resuspendiert % Natriumdesoxycholat bei pH 8] zur 30-minütigen Inkubation auf Eis.

Die Proben wurden 20 Sekunden lang auf Eis mit Ultraschall behandelt (Misonix XL{{0}}) und dann 30 Minuten lang bei 4 Grad und 20.800 g zentrifugiert. Die RIPA-lösliche Fraktion (Überstand) wurde entfernt und das Pellet zur Analyse unlöslicher Proteine ​​in 5 M Guanidin (pH 8,0) resuspendiert. Jede Probe wurde 20 Sekunden lang auf dem Eis beschallt, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur rotiert und dann 30 Minuten lang bei 4 Grad und 20.800 g zentrifugiert. Der Bicinchoninsäure (BCA)-Assay (#23225, Thermo Fisher Scientific) wurde verwendet, um die Proteinkonzentration jeder Probe zu messen.

Für Western Blots wurden 20 µg Protein jeder Probe auf 4–12 % NuPAGE-Gele (Invitrogen) geladen und unter Verwendung von MOPS-Puffer unter reduzierten und denaturierten Bedingungen aufgetrennt. Die Proteine ​​wurden auf eine Polyvinylidendifluoridmembran übertragen und mit Pierce ECL (verstärkte Chemilumineszenz; Thermo Fisher Scientific) entwickelt. Die entwickelten Signale wurden mit ProteinSimple FCR (FluorChem R) sichtbar gemacht und die nachfolgenden Chemilumineszenzsignale wurden mit der AlphaView-Software (ProteinSimple) quantifiziert. Alle Blots wurden mit dem Tool „Lokale Hintergrundkorrektur“ analysiert, mit Ausnahme des HDJ-2-Blots, der mit dem Tool „Hintergrundverknüpfung“ in Verbindung mit der multiregionalen Hintergrundkorrektur (AlphaView-Software) analysiert wurde.

Ein 42 ELISA

Um A 42 in Hemihirnhomogenaten von 5XFAD-Mäusen zu messen, wurde ein kommerziell erhältlicher Enzyme-Linked Immunosorbent-Assay (ELISA) (Thermo Fisher Scientific, KHB3441) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, um Guanidin und PBS-lösliches A 42 in Hemihirnen zu analysieren. Um A 42 im Gehirn von hAPP/PS1-Mäusen zu messen, wurde ein kommerziell erhältlicher ELISA verwendet (h-Amyloid 42 ELISA hochempfindlich, Te Genetics Company, Zürich, Schweiz). Der ELISA wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

Immunfluoreszenz des Gehirngewebes einer Maus

Nach der Perfusion wurden die Gehirne extrahiert und die Hemihirne in 10 % Formalin fixiert, gefolgt von einer Kryokonservierung in 30 % Saccharoselösung in 1XPBS. Ein Gefriergleitmikrotom wurde verwendet, um 30-μm koronale oder sagittale Schnitte zu gewinnen. Die Schnitte wurden nacheinander in einer 12--Wellplatte in einer kryoprotektiven Lösung (1xPBS, 30 % Saccharose und 30 % Ethylenglykol) platziert und bis zur Verwendung bei –20 Grad gelagert. Die Immunfluoreszenzfärbung wurde durchgeführt, indem die Schnitte zunächst dreimal in 1XTBS gewaschen und anschließend eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 16 mM Glycin in 1XTBS inkubiert wurden. Nach drei weiteren Wäschen in 1XTBS wurden die Schnitte 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in 5 % Ziegenserum in 0,25 % Triton X-100 in 1XTBS blockiert.

Die Schnitte wurden dann über Nacht in primären Antikörpern in einer Lösung aus 0,25 % Triton X-100, 1 % Rinderserumalbumin und 1XTBS bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurde eine sekundäre Immunfärbung mit Esel-AlexaFluor-markierten Sekundärantikörpern in einer Konzentration von 1:1000 (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. ProLong Gold (#P36934, Thermo Fisher Scientific) wurde zum Montieren von Schnitten verwendet, bevor sie auf einem Ti2-Weitfeldmikroskop oder einem Nikon A1-Laser-Scanning-Konfokalmikroskop zur Bildquantifizierung unter Verwendung der Nikon NIS Elements-Software zur Aufnahme abgebildet wurden.

Alle Aufnahmeeinstellungen blieben zwischen den Genotypen gleich und alle Bilder wurden innerhalb desselben Bildgebungszeitraums für einzelne Experimente aufgenommen (Northwestern University Center for Advanced Microscopy und Nikon Imaging Centre).

Bildquantifizierung

Mäusegehirne

Die Immunfluoreszenzquantifizierung der Immunfärbung von Maushirngewebe wurde an 3–5 Schnitten pro Tier mit Bregma-Koordinaten von etwa −0,94 bis –2,55 mm durchgeführt, die mit einem 10-fachen Objektiv auf einem Ti2-Weitfeldmikroskop abgebildet wurden. Quantifizierungsanalysen, einschließlich Größen- und Intensitätsschwellen, wurden mit der Nikon NIS-Elements-Software (Nikon Imaging Center der Northwestern University) durchgeführt.

Abhängig vom Signal wurden mit dem Tool „Allgemeine Analyse“ Schwellenwerte basierend auf Objektgröße, -form und -kontrast festgelegt und anschließend Binärmasken für jeden Kanal und jeden interessierenden Bereich erstellt. Die Schwellenwertbestimmung wurde für jeden Kanal separat durchgeführt, um interessierende Signale zu isolieren, indem das Signal-Rausch-Verhältnis optimiert und unspezifische Hintergrundsignale eliminiert wurden. Für die Berechnung der von LAMP1, BACE1 oder LysoTracker-Green abgedeckten Fläche sowie von LAMP1- und Lysosensor-Fluoreszenzintensitätsmessungen in primären Neuronen wurden die interessierenden Regionen manuell mit NIS-Elements verfolgt und für jede interessierende Region eine Binärschicht erstellt.

Um das Verhältnis von LAMP1 zu A 42 zu berechnen, wurde die Fläche von LAMP1 in dystrophischen Neuriten auf der Basis einzelner Plaques auf die Fläche von A 42 normalisiert und die durchschnittlichen Verhältnisse pro Maus zwischen den Behandlungsgruppen quantifiziert. Die Pearson-Korrelationskoeffizientenanalyse für BACE1 und LAMP1 wurde mit NIS-Elements pro Plaque anhand von Projektionen maximaler Intensität von 30-μm-Z-Stapelbildern durchgeführt, die mit einem konfokalen Nikon A1-Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Schrittgröße von 1 μm aufgenommen wurden.

Um das Verhältnis von LysoTrackerGreen zu Tiazinrot zu berechnen, wurde die Fläche von LysoTracker-Green in dystrophischen Neuriten auf die Fläche von Tiazinrot auf individueller Plaquebasis normalisiert und das durchschnittliche Verhältnis pro Maus zwischen den Behandlungsgruppen quantifiziert. Vier koronale Schnitte aus Bregma-Koordinaten von etwa −1,70 bis −2,55 mm wurden verwendet, um die Fläche oder Intensität jedes Signals in der jeweiligen Gehirnregion für jede Maus zu berechnen. Die Analyse der mit Plaque bedeckten Fläche und der Plaquegröße wurde anhand des Durchschnitts von fünf Schnitten pro Maus aus Bregma-Koordinaten von etwa –0,94 bis –2,55 mm durchgeführt. Schnittauswahl, Bildaufnahme, Bildverfolgung und Quantifizierung wurden von einer Person durchgeführt, die keine Ahnung von Behandlungsgruppen und Genotypen hatte.

Primäre Neuronen

Zur Quantifizierung der LAMP1-Immunfärbung in fixierten primären Mausneuronen wurden Somas anhand der Morphologie mithilfe von NIS-Elements manuell verfolgt und für jede interessierende Region und jeden Kanal eine binäre Maske erstellt. Der Schwellenwert wurde verwendet, um LAMP1-Signale zu optimieren und LAMP1 in Neuriten, einschließlich Dendriten und Axonen, zu unterscheiden, indem Pixel von LAMP1 isoliert wurden, die für Tubulinpixel positiv sind.

Die LAMP1-Signale des Zellsomas wurden aus dem gesamten LAMP1-Bereich ausgeschlossen, um LAMP1-Vesikel in Neuriten zu analysieren. Zur Analyse der LysoTracker-Green-Motilität in Neuronen wurden Bilder mit NISElements quantifiziert. Die Geschwindigkeit und Entfernung der gesamten LysoTrackerGreen-Partikel in jedem Frame wurden mithilfe der automatischen Bewegungsverfolgungsfunktion in NIS-Elements verfolgt. Basierend auf der Größe und Fluoreszenzintensität der LysoTracker-Green-Partikel wurde ein Schwellenwert festgelegt und auf alle Filme angewendet, um Hintergrundgeräusche zu eliminieren.

Zur Kymographenerzeugung wurde eine Zeitrafferaufnahme einzelner Neuronen mit einem konfokalen 60-Mikroskop durchgeführt und Axone morphologisch identifiziert. Der Prozentsatz der Häufigkeit von Partikeln, die sich in anterograder oder retrograder Richtung oder stationär bewegten, wurde quantifiziert, indem die Anzahl der Partikel für jede Gruppe durch die Gesamtanzahl der Partikel dividiert wurde. Für Kymograph-Analysen wurden bewegte Partikel mit einer Geschwindigkeit über 0,1 μM/s definiert.

statistische Analyse

Die GraphPad Prism-Software v8 wurde verwendet, um statistische Analysen durchzuführen, einschließlich Varianzanalyse (ANOVA) mit Post-hoc-Tests beim Vergleich von mehr als zwei Proben und ungepaarten t-Tests, wenn nur zwei Proben verglichen wurden. Spezifische Testdetails, einschließlich der Anzahl der Wiederholungen, der Art der Post-hoc-Tests und der P-Werte, sind in den Legenden der Abbildungen angegeben. Alle Quantifizierungen werden im Mittelwert ± SEM aufgetragen. Auf Signifikanz wurde geschlossen, wenn der P-Wert weniger als 0,05 betrug, angezeigt durch *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

For more information:1950477648nn@gmail.com