Favonoid- und Phyto-Oxylipin-Reaktionen in Granatapfelblättern (Punica Granatum L.), Teil 1

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Abstrakt:In Pflanzen produziertes Methyljasmonat (MeJA) kann ihre Reaktion auf Umweltbelastungen vermitteln. Es wurde auch gezeigt, dass die exogene Anwendung von MeJA Signalwege aktiviert und eine Phytoalexin-Akkumulation in vielen Pflanzenarten induziert. Um zu verstehen, wie Granatapfelpflanzen biochemisch auf Umweltstress reagieren, wurde eine Metabolitenanalyse in Granatapfelblättern durchgeführt, die einer MeJA-Anwendung unterzogen wurden, und zeigte einzigartige Veränderungen in hydrolysierbaren Tanninen, Flavonoiden und Phytooxylipinen. Darüber hinaus identifizierten Transkriptom- und Echtzeit-qPCR-Analysen von Mock- und MeJA-behandelten Granatapfelblättern differentiell exprimierte metabolische Gene und Transkriptionsfaktoren, die möglicherweise an der Kontrolle von beteiligt sindhydrolysierbarTannin-, Flavonoid- und Phytooxylipin-Wege. Molekulare, biochemische und bioinformatische Charakterisierung der einzigenLipoxygenasemit anhaltender, MeJA-induzierter Expression zeigte, dass es in der Lage ist, mehrfach ungesättigte Fettsäuren zu oxidieren, obwohl sie sich nicht im subzellulären Kompartiment befinden, wo Nicht-Jasmonat (Nicht-JA)-Phytooxylipine produziert wurden. Diese Ergebnisse legten gemeinsam nahe, dass, während die breite Unterdrückung von Flavonoiden und Anthocyanen zumindest teilweise auf Transkriptionsebene kontrolliert wird, die induzierte Biosynthese von Nicht-JAPhytooxylipinewird wahrscheinlich nicht transkriptionell reguliert. Insgesamt wird ein besseres Verständnis dafür, wie Granatapfelblätter auf Umweltbelastungen reagieren, nicht nur die Pflanzengesundheit und -produktivität fördern, sondern sich auch auf die menschliche Gesundheit auswirken, da die von Granatapfelpflanzen produzierten Früchte eine reichhaltige Quelle für Nährstoffverbindungen sind.

Schlüsselwörter:Methyljasmonat.Flavonoid·Anthocyanin· Fettsäure.Phytooxylipin·Lipoxygenase

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Einführung

Wenn Pflanzen von Pflanzenfressern und Krankheitserregern verwundet oder angegriffen werden, produzieren und emittieren sie Methyljasmonat (MeJA), das von nicht verletzten Pflanzengeweben und benachbarten Pflanzen wahrgenommen wird, um die Abwehrreaktion zu aktivieren (Cheong und Choi 2003). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die exogene Anwendung von MeJA auf eine Pflanze Signalwege sowie die Produktion von mit der Pathogenese zusammenhängenden Proteinen und Abwehrchemikalien, die als Phytoalexine bekannt sind, hervorruft. Phenolische Phytoalexine, z. B. Flavonoide und Anthocyane, haben als Reaktion auf die MeJA-Behandlung eine erhöhte Akkumulation in verschiedenen Pflanzen wie Arabidopsis thaliana, Traube (Vitis vinifera), Banane (Musa acuminate), Apfel (Malus Domestica) und roter Himbeere (Rubus idaeus) gezeigt ) (Pandey et al. 2016; Portu et al. 2015; De Geyteret al. 2012; Shafiq et al. 2011; Flo-res und Ruiz del Castillo 2014). Die Biosynthese von Flavonoiden und Anthocyanen beginnt mit der Bildung von Naringenin-Chalcon aus Cumaroyl-CoA und drei Molekülen Malonyl-CoA, katalysiert durch Chalcon-Synthase (CHS) und der anschließenden Isomerisierung von Naringenin-Chalcon zu Naringenin durch Chalcon-Isomerase (CHI). Naringenin wird dann verwendet, um die Kern-Flavonoid- und Anthocyanin-Skelette zu erzeugen, die weiter mit funktionellen Glykosyl-, Methyl-, Hydroxyl- und Prenylgruppen modifiziert werden, um verschiedene Strukturen und Funktionen zu erzeugen (Tian et al. 2008).

Cistanche kann die Immunität verbessern

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>75 Prozent Ähnlichkeit) und enthalten kein Signalpeptid, wohingegen Typ-II-LOXs eine insgesamt geringe Sequenzähnlichkeit aufweisen (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

Granatapfel (Punica granatum L.) ist eine spezielle Gartenbaupflanze, die für die reichlich vorhandenen phenolischen Verbindungen in ihren Früchten geschätzt wird, wie Flavonoide, Anthocyane und hydrolysierbare Tannine (HTs), die aus einem Zwischenprodukt des Shikimat-Wegs gewonnen werden (Ono et al.2016 ). Viele Studien haben sich bisher auf die Rolle von Granatapfelphenolen bei der Linderung von Stress und Krankheiten beim Menschen konzentriert (Wu und Tian 2017). Im Gegensatz dazu ist wenig über die Funktion von Phenolen und anderen sekundären Pflanzenstoffen bei der Abwehr von Granatapfel gegen abiotische und biotische Faktoren (z Verwundung, Krankheitserreger, MeJA-Induktion) in Blättern und Früchten. Zwei aktuelle Berichte bewerteten die MeJA-Behandlung vor der Ernte auf die Nacherntequalität von Granatapfelfrüchten (Koushesh Saba und Zarei 2019; Garcia-Pastor et al.2020). Die gesamten Anthocyane, Flavonoide und Phenole von mit MeJA behandelten Früchten, aber nicht von Blättern, wurden gemeinsam mit einem Spektrophotometer analysiert. Eine der Studien analysierte auch einzelne Anthocyane mittels Massenspektrometrie (Garcia-Pastor et al.2020). Es bleibt jedoch unklar, wie Granatapfel-Pflanzengewebe, entweder Blätter oder Früchte, vor dem Fruchtansatz auf Umweltbelastungen reagieren.

Um mit der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Granatapfelpflanzen und Umweltfaktoren zu beginnen, untersuchten wir die metabolische Reaktion von Granatapfelblättern auf die exogene MeJA-Anwendung mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS). . Einzigartige Veränderungen bei HTs, Flavonoiden und Anthocyanen sowie Veränderungen bei Lipiden, Fettsäuren und Phytooxylipinen wurden in mit MeJA behandelten Granatapfelblättern beobachtet. Eine vergleichende Transkriptomanalyse, die durch Echtzeit-qPCR-Analyse validiert wurde, zeigte, dass strukturelle und/oder regulatorische Gene, die am Metabolismus von HT, Flavonoiden, Anthocyanen und Phytooxylipin beteiligt sind, in Mock- und MeJA-behandelten Granatapfelblättern unterschiedlich exprimiert wurden. Das einzige LOX-Gen, das eine anhaltend hochregulierte Expression in MeJA-behandelten Blättern aufwies, wurde einer weiteren molekularen, biochemischen und phylogenetischen Charakterisierung unterzogen.

Materialen und Methoden

Die -Glucogallin- und Pentagalloyl-Glucose-Standards wurden von Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd (Shanghai, China) bezogen. Die im LOX-Assay verwendeten Chemikalien wurden von den folgenden Anbietern bezogen: 3-(Dimethylamino)benzoesäure (DMAB) (Adamas Reagent, Co., Ltd., Shanghai, China), Linolsäure (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 3-Methyl-2-benzothiazolinon (MBTH) und Hämoglobin (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China).

Pflanzenmaterial Granatapfelfrüchte und -samen (Cv. Wonderful) wurden großzügigerweise von der Panzhihua Academy of Agricultural and Forest Sciences zur Verfügung gestellt und von Dr. Binjie Ge im Shanghai Chenshan Botanical Garden identifiziert. Ein Belegexemplar (Nr. CSHO173966) wurde im Herbarium des Shanghai Chenshan Botanical Garden, Shanghai, China, hinterlegt. Granatapfelsämlinge wurden in einem temperaturkontrollierten Wachstumsraum für 6 Wochen bei 25 Grad und 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit gezüchtet. Die MeJA-Konzentration für die Sprühapplikation auf Pflanzengewebe liegt Berichten zufolge im Bereich von 100 bis 250 μM (Ku et al. 2014; Hickman et al.2017). Granatapfelblätter wurden zunächst mit verschiedenen Konzentrationen von MeJA appliziert, von denen 200 μM MeJA in der Voranalyse zu einer erkennbaren Stoffwechselreaktion führten und für die in dieser Studie beschriebenen Metaboliten- und Genexpressionsanalysen verwendet wurden. Vor der MeJA-Behandlung wurde die Hälfte der Granatapfelpflanzen in einen anderen Wachstumsraum mit ähnlichen Bedingungen gebracht. Während die Pflanzen in einem Wachstumsraum mit 200 μM MeJA besprüht wurden, wurden die Pflanzen im anderen Wachstumsraum mit Wasser besprüht (d. h. Scheinkontrolle). Um 2-h,3-h,6- h,12-h,24-h, 30-h,36-h,48-h,und72-h nach der Behandlung, Blätter von3 bis 5 Schein- oder MeJA-behandelte Pflanzen wurden gepoolt, die eine biologische Wiederholung darstellen. Drei biologische Wiederholungen wurden für die Schein- und MeJA-Behandlungsexperimente gesammelt; jedes biologische Replikat wurde in Aliquots für Metaboliten-Profiling und Genexpressionsanalysen aufgeteilt.

Metabolitenprofilanalyse

Granatapfelblätter wurden lyophilisiert, gewogen und unter Verwendung von Zirkonoxidperlen in einem Perlrührer (Mischmühle MM 400, Retsch GmbH, Haan, Deutschland) für die 90er Jahre bei 30 Hz zu einem feinen Pulver gemahlen. Für die HPLC-Analyse wurde die Blattprobe 60 min lang unter Beschallung in 70 % Methanol extrahiert und 10 min lang bei 13 000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein HPLC-Fläschchen überführt, wovon 30 μl auf eine Umkehrphasen-HPLC (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) injiziert und wie zuvor beschrieben analysiert wurden (Wil-son et al. 2019). Metaboliten wurden durch UV-Absorption bei 254 nm, 280 nm, 320 nm und 360 nm nachgewiesen. Es wurden Standardkalibrierungskurven von &bgr;-Glucogallin und Pentagalloylglucose erstellt; sie wurden verwendet, um die Bereiche von Peaks, die den Retentionszeiten und Absorptionsspektren von -Glucogallin und Pentagalloylglucose entsprechen, in die entsprechenden Konzentrationen umzuwandeln.

For LC-ESI-MS/MS analysis, the homogenized leaf sample(100 mg) was extracted in 1 mL of 70% methanol at 4℃Covernight.On the following day, the methanolic extract was centrifuged at 10,000×g for 10 min and the supernatant was passed through a CNWBOND Carbon-GCB SPE cartridge（ANPEL, Shanghai, China） and a 0.22-μm syringe filter(ANPEL) prior to metabolite analysis. The extract （2 μL） was analyzed using LC-ESI-MS/MS (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japan; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)and a reverse phase C1s column(ACQUITY UPLC HSS T3,1.8 βm, 2.1 mm×100 mm, Waters, Milford, MA, USA).Metabolites were eluted using solvents(A)water containing 0.04%acetic acid,and(B)acetonitrile containing0.04% acetic acid at a gradient of 0-11 min,95-5%A;11-12 min,5% A;12-12.1 min,5-95%A;12.1-15min,95%A.The flow rate was maintained at 0.4 mL min-1. Linear ion trap (LIT) and triple quadrupole(QQQ)MS scans were acquired in positive-and negative-ion modes. The turbo spray ion source was operated at 500℃C with an ionization voltage of 5500 V. The ion source gas I, gas I, and curtain gas were set at 55 psi,60 psi, and 25 psi, respectively. The collision gas (nitro-gen) was set at 5 psi. For the MRM analysis, declustering potential (DP)and collision energy(CE) were optimized for each precursor-product ion transition. For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values, and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>=1 wurden als erheblich verändert betrachtet.

Transkriptomanalyse

Gesamt-RNA wurde aus Granatapfelblättern unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) extrahiert und unter Verwendung von Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) quantifiziert. Die Integrität der RNA-Proben wurde durch Trennung auf einem Agarosegel (kein sichtbarer Abbau) und Bestimmung des OD20/28o-Verhältnisses (zwischen 1,8 und 2,2) unter Verwendung von Nanodrop2000 verifiziert. Die Anreicherung von mRNA aus Gesamt-RNA wurde unter Verwendung der Oligo (dT)-Magnetbeads (Invitrogen) durchgeführt. mRNA-Seq-Bibliotheken wurden unter Verwendung des Truseq-RNA-Bibliotheksvorbereitungskits (Illumina, San Diego, CA, USA) konstruiert. Die Transkriptomanalyse wurde auf Illumina HiSeq4000 durchgeführt, und für jede Probenbibliothek wurden 55-60 Millionen von 150- bp-Paired-End-Reads (PE150) erhalten. Die Rohsequenzdaten wurden verarbeitet, indem die Adaptersequenzen sowie kurze (<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS: GitHub. com/Joshi/sickle). Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1 und angepasster P-Wert<>

Echtzeit-qPCR-Analyse

Gesamt-RNA wurde aus schein- und MeJA-behandelten Granatapfelblättern unter Verwendung des RNAprep Pure Plant Kit (Tiangen Biotech Co., Ltd., Peking, China) extrahiert. Reverse Transkription (RT) wurde unter Verwendung von Gesamt-RNA und dem PrimeScriptTM RT Reagent Kit (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japan) durchgeführt. Quantitative PCR (qPCR) wurde unter Verwendung des TB GreenTM Premix Ex Taq TM (Tli RNaseH Plus) Kits ( Takara) und ein StepOnePlus Real-Time PCR System (ThermoFisher Scientific). Eine Schmelzkurvenanalyse wurde durchgeführt und zeigte ein einzelnes Amplifikationsprodukt für jedes Primerpaar. Für die RT-qPCR-Analyse wurden drei biologische Replikate und jeweils drei technische Replikate auf Mock- und MeJA-behandelte Proben untersucht. Die Genexpression wurde mit der vergleichenden C,(△AC)-Methode (Livak und Schmittgen 2001) analysiert, und die Signifikanzniveaus wurden mit einem zweiseitigen Student's t-Test bestimmt. Die Primersequenzen für die Echtzeit-qPCR-Analyse und die Amplifikationseffizienzen der Primerpaare sind in Tabelle S1 dargestellt.

Expression und Reinigung rekombinanter Proteine ​​und Enzymassays

Der offene Leserahmen von Pgr025417 (kodiert für mutmaßliches LOX) wurde für eine optimale Codonnutzung in E. coli (Genewiz, Suzhou, China) synthetisiert und in pET28a kloniert. Das rekombinante Plasmid wurde in E. coli BL21 transformiert (DE3) Zellen. Eine 5--ml-Luria Bertani (LB)-Kultur mit 50 ug ml-Ikanamycin wurde aus einer einzelnen Kolonie gestartet und über Nacht unter Schütteln bei 37 °C inkubiert. Die Übernachtkultur wurde verwendet, um ein 100- ml LB-Medium mit 50 ug ml-'Kanamycin zu inokulieren und bis zu einer OD600 von 0,5 wachsen zu lassen. Isopropyl- -D-thiogalactosid (IPTG) wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM zur Induktion der Proteinexpression zugegeben. Nach Inkubation unter Schütteln bei 16 Grad für 18 h wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet. Die Zellpellets wurden im Lysepuffer (50 mM NaH, PO, pH 7,4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) resuspendiert und unter Verwendung eines Zellzerstörers (Constant Systems Ltd, Northants, UK) homogenisiert Ni-NTA-Kügelchen (ThermoFisher Scientific) mit dem Waschpuffer (50 mM NaH, PO, pH 7,4, 300 mM NaCl, 25 mM Imidazol) und dem Elutionspuffer (50 mM NaH, PO, pH 7,4, 300 mM NaCl, 500 mM). Imidazol). Die gereinigten Proteine ​​wurden auf einem 10-prozentigen SDS-PAGE-Gel zur Sichtbarmachung der Proteinreinheit aufgetrennt. Die Konzentration der gereinigten Proteine ​​wurde mit dem Bradford-Assay (Bradford 1976) bestimmt.

Für den LOX-Assay wurde Linolsäure als Substrat in einem zweistufigen, kolorimetrischen Verfahren mit leichten Modifikationen verwendet （Anthon und Barrett 2008）. Die 500- μl-Reaktionsmischung, einschließlich 50 mM Na-Phosphat, pH 6, 10 mM DMAB, 0,5 mM Linolsäure und verschiedene Mengen gereinigter rekombinanter Proteine ​​(1,5 mg mL). -), wurde 10 min lang bei 25 Grad inkubiert. Eine zweite Lösung (500 μl) mit 0,2 mM MBTH und 0,1 mg ml Hämoglobin wurde zu der Reaktionsmischung gegeben, die weitere 5 min lang inkubiert wurde. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 500 μl 1-prozentigem (w/v) Natriumlaurylsulfat beendet. Die Lichtabsorption bei 598 nm wurde bestimmt. Subzelluläre Lokalisierung und phylogenetische Analysen Eine Suche im annotierten Granatapfelgenom (Qin et al. 2017) identifizierte 1 l mutmaßliche LOXs voller Länge (786 aa bis 970 aa), einschließlich Pgr025413, Pgr020032, Pgr025418, Pgr025417, PgrO18982, PgrO18980, PgrO1685 (full -Längensequenz in GenBank XP_031395793), Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 und PgrO13780. Die subzelluläre Lokalisierung und Spaltstellen von Signalpeptiden für die Granatapfel-LOXs wurden mit TargetP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/TargetP/) (Almagro Armenteros et al.2019) vorhergesagt.

Analyse der TF-Bindungsstelle

Um die Bindungsstellen von TFs vorherzusagen, wurden 1000 bp stromaufwärts des ATG-Startcodons der Zielgene von GenBank bezogen und in PlantRegMap (Version 5) (Tian et al.2020) gegen die Eucalyptus Grandis-TFs gesucht. Der Schwellenwert für die Bindung Standortidentifikation wurde auf P gesetzt. Kleiner als oder gleich le-4. Die statistische Analyse für die Metabolitenquantifizierung, das Transkriptom und die Echtzeit-qPCR-Daten werden in den entsprechenden Abschnitten beschrieben.

Ergebnisse

MeJA moduliert Zellsignal- und Stoffwechselwege in Granatapfelblättern

Um die genomweite Transkriptionsantwort von Granatapfel auf MeJA-Auslösung zu verstehen, wurden Transkriptome von Granatapfelblättern um 2-h,6-h,24-h und 72-h nach MeJA oder Scheinbehandlung (jeweils mit drei biologischen Wiederholungen) wurden analysiert (Abb. S1). Für jedes Transkriptom mit einem GC-Gehalt von etwa 52 Prozent und Q30-Werten von 91,6 bis 95 Prozent wurden ungefähr 55 Millionen Rohsequenz-Reads (2 × 150 bp Paired-End) erhalten (Tabelle S2). Bei allen Transkriptomen wurden mehr als 96 Prozent der bereinigten Sequenz-Reads dem Referenz-Granatapfelgenom zugeordnet (Qin et al. 2017) (Tabelle S3). Ein Großteil der zusammengesetzten Transkripte hatte weniger als 1000 bp (34,3 Prozent), 1000 bp – 2000 bp (32,9 Prozent) oder 2000 bp – 3000 bp (18,1 Prozent) (Tabelle S4).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, angepasst P<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),="" a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="" s1d).="" shikimate="" and="" ht="" pathway="" genes="" and="" ht="" metabolites="" were="" induced="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leave="" as="" revealed="" in="" the="" transcriptome="" and="" kegg="" pathway="" enrichment="" analysis,="" three="" shikimate="" biosynthetic="" path-way="" genes="" showed="" upregulated="" expression="" in="" meja-treated="" leaves="" relative="" to="" mock="" controls="" at="" 6-h,="" including="" 3-deoxy-d-arabinose-heptulosonate-7-phosphate="" synthase="" (dahps),="" 3-dehydrogenate="" synthase(dhs),="" and="" the="" bifunctional="" 3-dehydrogenate="" dehydratase/shikimate="" dehydrogenase="" (dhq/sdh;="" abbreviated="" as="" sdh)(figs.s1b="" and="" la).in="" particular,="" three="" isoforms="" of="" pomegranate="" sdhs="" were="" identified="" and="" showed="" differential="" expression="" in="" the="" transcriptome="" analysis,="" pgr020271,="" pgr019030,="" and="">

Um zu bestimmen, ob Änderungen in der Menge an biosynthetischen Shikimat- und HT-Gentranskripten die Menge an Metaboliten beeinflussen können, die von diesen Stoffwechselwegen stammen, wurden phenolische Metaboliten aus Blättern extrahiert, die um 24- h, 30- h geerntet wurden. 36-h,48-h und 72-h nach MeJA- oder Scheinanwendung und Analyse durch HPLC (Abb. 2). Es sollte beachtet werden, dass diese Zeitpunkte gewählt wurden, um die Zeit zu berücksichtigen, die für die Proteinsynthese und Metabolitenproduktion und -akkumulation nach den beobachteten Expressionsänderungen von Shikimat- und HT-Biosynthesegenen bei 6- h benötigt wird. Die Retentionszeiten und Absorptionsspektren von zwei Metaboliten, die bei 4,57 min (Peak 1) und 24,98 min (Peak 2) eluiert wurden, stimmten mit denen der HT-Weg-Zwischenprodukte – Glucogallin bzw. Penta-Legierungen – Glucose ( 1a und 2a ) überein. Beide Peaks zeigten zu mehreren Zeitpunkten signifikante Änderungen der integrierten Peakflächen (Abb. 2b). Insbesondere stieg Peak 1 in MeJA-behandelten Blättern im Vergleich zu Scheinkontrollen um 30- h, 36- h und 48- h (Abb. 2b). Interessanterweise nahm Peak 2 in mit MeJA behandelten Blättern anfänglich um 24- h ab, stieg aber anschließend um 30- h und 36- h an, bevor es um 48- auf ein Niveau zurückkehrte, das den Scheinkontrollen ähnelte. h und 72-h (Abb. 2b). Die Reduktion der meisten Flavonoide und Anthocyane sowie erhöhte methylierte Flavone und Flavonole waren in mit MeJA behandelten Granatapfelblättern offensichtlich

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; Tabellen S5 und S6). Bei den unterschiedlich angereicherten Metaboliten gab es eine Gesamtanreicherung von Metaboliten, die am sekundären/spezialisierten Metabolismus der Pflanzen beteiligt sind (67 von 102), insbesondere phenolische Verbindungen (63 von 102) (Tabelle S6).

Unter den Phenolen war eine konzertierte Reduktion einer breiten Palette von Flavonoiden und Anthocyanen (42 der 73 verringerten Verbindungen) in MeJA-behandelten Blättern erkennbar (Abb. 3; Tabelle S6). Interessanterweise waren drei mono- oder di-O-methylierte Flavone und Flavonole, einschließlich Di-O-Methyl-Quercetin, Chrysoberyl-O-Hexosyl-O-Hexosid und Verkaufs-5-O-Hexosid, in MeJA-behandelten Blättern erhöht (Abb. 3; Tabelle S6). Mehrere Zwischenprodukte der Flavonoid- und Anthocyaninwege, einschließlich Luteolin, Chrysoberyll, Dihydrokaempferol, Dihydroquercetin, Dihydromyricetin, Epicatechin, Delphinidin und Pelargonidin, waren nachweisbar, zeigten jedoch keine signifikanten Veränderungen in MeJA-behandelten Blättern (Abb. 3; Tabelle S5). Hydroxycin-Namoyl-Derivate, Isoflavone und Cumarine waren unter anderen Phenolen, die eine verringerte Akkumulation nach MeJA-Induktion zeigten (Tabelle S6). Im Gegensatz dazu waren zwei Phenolsäuren, 2,3-Dihydroxybenzoesäure und Protocatechusäure (3,4-Dihydroxybenzoesäure), und ein Cumarin, 6-Methylcumarin, in MeJA-behandelten Blättern erhöht (Tabelle S6).

In Übereinstimmung mit den weitgehend reduzierten Flavonoiden und Anthocyanen in MeJA-behandelten Granatapfelblättern, den Transkripten von zwei Schlüsselenzymen für die Biosynthese von Flavonoiden und Anthocyanen. CHS(Pgr005566) und CHI (Pgr025966) waren laut Transkriptomanalyse 6- h und 24- h nach der MeJA-Anwendung signifikant erniedrigt (Abb. 4). Es wurde eine Echtzeit-qPCR-Analyse durchgeführt, um die CHS- und CHI-Expression mit zusätzlichen Zeitpunkten zu untersuchen, einschließlich 2-h, 3-h, 6-h,12-h,{{ 11}} h, 48- h und 72- h (Abb. 4). Die CHS-Transkripte fielen in MeJA-behandelten Blättern um 3- h und blieben signifikant niedriger als die in Mock Kontrollen bis 72-h, mit dem größten Rückgang um 12-h. Im Gegensatz dazu war die Reduktion der CHI-Expression nur um 24- h, 48- h und 72- h nach der MeJA-Behandlung signifikant (Abb. 4).

Dieser Artikel ist ein Auszug aus Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9