Blütenextrakte als multifunktionale Farbstoffe in der Kosmetikindustrie Teil 2

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Viele Naturprodukte werden in traditionellen medizinischen Systemen zur Linderung von Schmerz- und Entzündungssymptomen eingesetzt [61], daher wurde die Wirkung der analysierten Extrakte auf die Hemmung der Lipoxygenase- und Proteinaseaktivität untersucht. Im Bereich der analysierten Konzentrationen (100-500 ug/ml) zeigte CTE-Wasserextrakt die stärkste Fähigkeit, Proteinase zu hemmen (Abbildung 4) (bei 57 Prozent für eine Konzentration von 500 ug/ml). Diese Aktivität wurde mit dem wohlbekannten Proteinase-Inhibitor Diclofenac verglichen, der als Kontrolle verwendet wurde (ungefähr 89 Prozent Hemmung bei der höchsten getesteten Konzentration). Ähnliche Ergebnisse wurden jedoch für GGE- und KTE-Extrakt erhalten (etwa 56 Prozent bzw. 53 Prozent für die höchsten Konzentrationen). Für PRE- und PGE-Extrakte wurde eine geringere Proteinase-Hemmung beobachtet. In einem weiteren Test, der die Fähigkeit zur Hemmung der Lipoxygenase misst, zeigen die wässrigen Extrakte von KTE und CTE die höchsten Werte (ca. 67 Prozent bzw. 64 Prozent Hemmung bei einer Konzentration von 500 µg/ml). Diclofenac wurde auch als Kontrolle verwendet GGE-, PGE- und PRE-Extrakte weisen ebenfalls signifikant hohe Werte auf (60 Prozent, 57 Prozent bzw. 54 Prozent).Es wurde auch festgestellt, dass die Fähigkeit zur Hemmung von LOX- und Proteinase-Enzymen von der Extraktkonzentration abhängt (Abbildung 5).

Frühere Studien zeigten, dass viele polyphenolische Verbindungen signifikant zu den entzündungshemmenden Aktivitäten vieler Pflanzenextrakte beigetragen haben[62]. Studien haben die Beteiligung von ROS am Entzündungsprozess gezeigt, und phenolische Verbindungen wie Gallus- und Chinasäure können den Arachidonsäure-Metabolismus blockieren, indem sie die Aktivität der Lipoxygenase-Aktivität hemmen, oder sie können als Abfang reaktiver freier Radikale dienen, die während der Arachidonsäure produziert werden [63]. Die von BenSaad et al. weisen darauf hin, dass aus P. granatum isolierte Ellagsäure, Gallussäure und Punicalagin A&B die Produktion von Stickstoffmonoxid (NO), Prostaglandin E2 (PGE2) und Interleukin 6 (IL-6) in Lipopolysaccharid (LPS)-induzierter Hemmung hemmten RAW 267.4 Makrophagen. Ob diese Verbindungen als alleinige Wirkstoffe wirken oder einen synergistischen Effekt haben, bleibt eine Frage [64]. Da viele Flavonoide aufgrund ihres intrinsischen antioxidativen Verhaltens entzündungshemmende Eigenschaften aufweisen, wurden sie mit verschiedenen entzündlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht.Flavonoid-Extraktionsmethode pdf,Insbesondere Quercetin ist das interessanteste Molekül, da es in spezifische biologische Stoffwechselwege eingreift. Darüber hinaus deuten Studien darauf hin, dass es den Entzündungsprozess, der an mehreren Modellen beteiligt ist, durch verschiedene Mechanismen reduzieren kann[65]. Insbesondere die AMP-aktivierte Proteinkinase und der Histon/Protein-Deacetylase(AMPK/SIRT1)-Weg führen zu einem interessanteren Entzündungsmanagement. Somit können AMPK-Aktivatoren Makrophagenentzündungen reduzieren. Quercetin und andere Flavonoide können als Aktivatoren von AMPK und SIRT1 Entzündungen reduzieren, indem sie in diesen Signalweg eingreifen [66]. Es wurde auch gezeigt, dass Quercetin und Quercetin-Monoglucoside ein höheres LOX-Inhibitionspotential ausüben [67]Nair et al. haben entzündungshemmende Eigenschaften von KTE-Extrakt gezeigt, indem sie das Vorhandensein von Flavonolen mit der Quercetin-Einheit wie Mangaslin Qu 3- [2G] Rhamnosylrutinosid, Qu 3- O-Dirhamnosid und Rutin bewerteten. Diese Moleküle haben eine starke Hemmung der COX-2-Aktivität und eine teilweise ROS-Unterdrückung gezeigt. Im Allgemeinen zeigten in CTE vorhandene Polyphenole entzündungshemmende Eigenschaften bei LPS-induzierter Entzündung in RAW 264.7-Makrophagenzellen[68].

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2.5.Beurteilung der Zytotoxizität

Eine der wichtigsten Eigenschaften bei der Entwicklung neuer kosmetischer Rohstoffe ist ihre Anwendungssicherheit. Substanzen, die für die Verwendung in Kosmetika bestimmt sind, müssen nicht toxisch sein, insbesondere in Bezug auf Hautzellen wie Keratinozyten und Fibroblasten. Zwei Arten von Tests wurden verwendet, um die Toxizität der analysierten Extrakte auf HaCaT- und BJ-Zellen zu bestimmen.FlavonoideDie erste Studie, die den Neutralrot-Aufnahmeassay verwendet, ermöglicht es uns, die Lebensfähigkeit der mit den analysierten Extrakten behandelten Zellen zu beurteilen. Dieser Farbstoff dringt in die Lysosomen einer lebenden Zelle ein und wird in das Zytoplasma toter Zellen freigesetzt. Es wurde beobachtet (Abbildung 6), dass der CTE-Extrakt die höchste Fähigkeit besitzt, die Proliferation sowohl der HaCaT- als auch der BJ-Zellen zu steigern. Im Vergleich zur Kontrolle erzielte dieser Extrakt etwa 20 Prozent bzw. 40 Prozent höhere Werte als der getestete Parameter bei einer Konzentration von 250 μL/ml (HaCaT und B) bzw. 500 μL/ml (BJ-Zellen). Der GGE-Extrakt in Konzentrationen von 100 und 250 μl/ml und der KTE-Extrakt in der Konzentration von 500 μl/ml waren durch eine geringe toxische Wirkung auf BJ-Zellen gekennzeichnet. Andere Extrakte hatten einen positiven Einfluss auf die Lebensfähigkeit dieser Zellen. Die PRE- und PGE-Extrakte bei einer Konzentration von 100 μl/ml unterschieden sich nicht signifikant von der Kontrolle und sie erhöhten die Proliferation von BJ-Zellen um etwa 10-15 Prozent im Vergleich zur Kontrolle bei einer Konzentration von 250 und 500 μl/ ml. Bei Keratinozyten wurde keine Abnahme der Zelllebensfähigkeit beobachtet. Für PGE-, PRE- und CTE-Extrakte wurde eine Zunahme der Proliferation mit steigender Konzentration festgestellt, während eine Abnahme der Zelllebensfähigkeit mit steigender Konzentration der KTE- und GGE-Extrakte gezeigt wurde.

Als zweiter Test zur Bestimmung der Zytotoxizität der getesteten Extrakte wurde der Resazurin-Test (Alamar Blue) durchgeführt. Es wurde gezeigt (Abbildung 7), dass die Lebensfähigkeit von Zellen von der Konzentration des Extrakts abhängt, mit dem die Zellen inkubiert wurden. Bei Fibroblasten bewirken die PRE-, PGE- und CTE-Extrakte mit steigender Konzentration eine höhere Zellproliferation. Bei der höchsten analysierten Konzentration (500 μL/mL) wurde im Vergleich zur Kontrolle eine etwa 20 Prozent höhere Proliferation beobachtet.Hesperidin verwendetIm Falle von KTE- und GGE-Extrakten wurde eine Abnahme der Zelllebensfähigkeit mit einer Erhöhung der Konzentration der Extrakte beobachtet. Diese Extrakte zeigten bei Konzentrationen von 250 und 500 μl/ml eine geringe toxische Wirkung auf BJ. Bei Keratinozyten wurde eine ähnliche Wirkung der analysierten Extrakte auf die Hautzellen beobachtet, jedoch war deren Vermehrungsfähigkeit nicht so stark wie bei Fibroblasten. Die höchste Fähigkeit zur Steigerung der Keratinozytenproliferation wurde für den CTE-Extrakt im gesamten Bereich der analysierten Konzentrationen beobachtet. Ähnliche Werte wurden für den PRE-Extrakt bei einer Konzentration von 250 μL/ml und für den PGE-Extrakt bei einer Konzentration von 500 μL/ml erhalten. Der KTE-Extrakt zeigte eine signifikant höhere toxische Wirkung auf HaCa-Zellen als der GGE-Extrakt.

Die analysierten Extrakte wurden zuvor nicht umfassend auf ihre Toxizität für Hautzellen getestet. Es gibt nur wenige Studien zur Zytotoxizität von Extrakten oder deren Hauptwirkstoffen, insbesondere gegenüber Krebszellen. Die Autoren früherer Studien wiesen darauf hin, dass diese Extrakte im Allgemeinen keine toxische Wirkung auf Hautzellen haben und ihre Fähigkeit, die Zellproliferation zu erhöhen, am häufigsten dem hohen Gehalt an Polyphenolen, Anthocyanen und Flavonoiden zugeschrieben wird [45, 69-73 ]. Einige Autoren wiesen auch darauf hin, dass die in den Extrakten enthaltenen Einzelkomponenten möglicherweise eine toxische Wirkung auf Hautzellen haben, der Extrakt als Ganzes jedoch nicht. Ali Hijaziet al. [69] zeigten, dass aus Punica granatum extrahierte Alkaloide für normale und Krebszelllinien toxisch sind, während der gesamte Extrakt weniger toxisch ist. Die Studie von Nasiri et al. [70] weist darauf hin, dass der Blütenextrakt von Punica granatum aufgrund seiner Fähigkeit, die Proliferation von Hautzellen zu erhöhen, zur Beschleunigung des Wundheilungsprozesses nützlich sein kann. In unserer früheren Forschung [45] wurde gezeigt, dass die aus den analysierten Pflanzen gewonnenen wässrig-ethanolischen Extrakte durch eine höhere Fähigkeit zur Steigerung der Proliferation von BJ-Zellen gekennzeichnet waren und die KTE- und GGE-Extrakte eine geringere toxische Wirkung auf diese Zellen zeigten .verlorenes Reich cistancheDie Wirkung von Wasser-Ethanol-Extrakten auf HaCaT-Zellen war ähnlich der von reinen wässrigen Extrakten, jedoch wurden bei mit Ethanol gewonnenen Extrakten etwas günstigere Proliferationseigenschaften beobachtet als bei wässrigen Extrakten. Die Unterschiede in der Zusammensetzung beider Arten von analysierten Extrakten können Unterschiede in ihrer Toxizität verursachen. Wie gezeigt, sind Wasserextrakte nicht so reich an bioaktiven Inhaltsstoffen wie Wasser-Ethanol-Extrakte. Die größten Unterschiede werden beim Gehalt an Rutin und Isoquercitrin beobachtet.

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2.6.Bestimmung des Lichtschutzfaktors

Die ungünstigen Auswirkungen der UV-Strahlung auf die Haut können sich sowohl kurz nach der Einwirkung als auch noch Jahre später zeigen. Die Sonnenstrahlung hat eine immunsuppressive Wirkung, die den Alterungsprozess der Haut mit allen damit verbundenen Folgen, einschließlich einer erhöhten Karzinogenese, beschleunigt [74]. Die derzeit zu beobachtenden Trends weisen auf einen wachsenden Bedarf hin, Produkte zu entwickeln, die sich nicht nur durch eine sehr hohe Anwendungssicherheit, sondern auch durch Multifunktionalität in dem Sinne auszeichnen, dass Produkte den Strahlenschutz der Haut mit einem breiteren Wirkungsspektrum als bisher aufweisen. Einige Pflanzenstoffe spielen dabei eine unschätzbare Rolle, die nicht nur Sonnenschutz bieten, sondern auch die bereits bestehenden negativen Auswirkungen der Sonneneinstrahlung auf die Haut neutralisieren können [75-77]. Die durchgeführte Forschung zeigte, dass die analysierten Pflanzenextrakte PRE, PGE, KTE, CTE und GGE durch hohe SPF-Koeffizienten gekennzeichnet sind.

Die Analyse der Koeffizienten (SPF) wurde für die gewonnenen Wasserextrakte aus den oben genannten Pflanzen in Konzentrationen von 10 und 50 mg/mL durchgeführt. Für jede untersuchte Pflanze führte eine höhere Konzentration des Extrakts zu einem signifikant höheren SPF-Wert.mikronisierte gereinigte Flavonoidfraktion 1000 mg verwendetEin Vergleich zwischen Extrakten zeigt, dass die höchsten Werte des SPF für den KTE-Extrakt beobachtet wurden, der für beide untersuchten Konzentrationen gilt. Eine weitere interessante Beobachtung ist, dass der KTE-Extrakt selbst in der niedrigeren der untersuchten Konzentrationen immer noch einen hohen Lichtschutzfaktor aufwies, während die Werte für andere Extrakte merklich abnahmen. Dies wird deutlich, wenn wir analysieren, um wie viel das Ergebnis für KTE höher war als bei anderen Extrakten. Bei der Konzentration von 50 mg/mL war der SPF um den Faktor 1,2 (im Vergleich zu PGE, CTE) bis zum Faktor 1,9 (im Vergleich zu PRE, GE) höher. Die gleiche Berechnung für die Konzentration von 10 mg/ml ergibt Faktoren von 1,4 (im Vergleich zu PGE) bis zu Faktoren im Bereich 2-3 (im Vergleich zu CTE, GGE), sogar bis zu Faktoren wie 10 im Vergleich zu VOR. Wenn man sich auf den KTE-Extrakt konzentriert, kann man feststellen, dass eine abnehmende Konzentration des Extrakts um den Faktor 5 (von einem Wert von 50 mg/ml auf den Wert von 10 ml/ml) zu einer Verringerung des SPF-Werts um den Faktor 3,4 führt , was bedeutet, dass der Lichtschutzfaktor langsamer abnimmt als die Konzentration. Das Obige zeigt, dass der KTE-Extrakt selbst bei Anwendung in niedrigen Konzentrationen wirksam sein kann (Abbildung 8).

2.7. Messungen des transepidermalen Wasserverlusts (TEWL) und der Hautfeuchtigkeit

Aufgrund des breiten biologischen und pharmakologischen Wirkungsspektrums pflanzlicher Rohstoffe haben in Extrakten enthaltene Pflanzenstoffe einen erheblichen Einfluss auf den Zustand der Haut. Insbesondere sprechen wir hier über den Einfluss von Sekundärmetaboliten auf den Zustand unserer Haut [78,79].

In der nächsten Phase der Forschung wurden die Analysen der Hydratation und des TEWL durchgeführt. Bewertet wurde die Wirkung der getesteten Extrakte auf die Haut. Messungen wurden in zwei Zeitintervallen von 60 und 360 min für die Extraktkonzentration von 10 mg/ml durchgeführt. Bei der TEWL-Messung zeigte sich die größte prozentuale Abnahme für den PGE-Extrakt, wo der Kontrollwert von 13,9 auf 8,71 fiel, was zu einer prozentualen Abnahme von 37 Prozent führte. Es lohnt sich auch, den KTE-Extrakt aus dieser Perspektive zu analysieren, da dieser die höchsten SPF-Werte aufwies. Für den KTE-Extrakt sank der TEWL-Kontrollwert auf den Wert 10,22, was einer Abnahme von 26 Prozent entspricht (Abbildung 9A).

Bei der zweiten Gerätemessung zeigte sich jedoch, dass die analysierten Extrakte sowohl nach 60 als auch nach 360 min eine Erhöhung der Durchfeuchtung gegenüber der Kontrollprobe bewirken.

Als Ergebnis der Analysen wurde festgestellt, dass die analysierten PRE-, PGE-, KTE-, CTE- und GGE-Extrakte die Hautfeuchtigkeit erhöhen (Abbildung 9B). Eine Zunahme der feuchtigkeitsspendenden Eigenschaften wurde zusammen mit einer Zunahme der Konzentration des Extrakts in den Präparaten beobachtet. Die stärksten feuchtigkeitsspendenden Eigenschaften wurden für PRE- und PGE-Extrakte beobachtet, die 32 Prozent und 29 Prozent nach 60 Minuten entsprechen und 21 Prozent und 22 Prozent nach 360 Minuten entsprechen. Der niedrigste Grad an Hautfeuchtigkeit wurde jedoch für KTE-Extrakt gefunden, der 18 Prozent nach 60 Minuten und fast 3 Prozent nach 360 Minuten entspricht.

2.8. Anwendungsanalyse

2.8.1. Bestimmung der Farbparameter von Extrakten

Aufgrund ihrer natürlichen Farbe können die Wirkstoffe von Pflanzenblüten als natürliche Farbstoffe in vielen kommerziellen Produkten wie Kosmetika und Lebensmitteln verwendet werden. Für die erhaltenen Extrakte wurde eine Farbanalyse durchgeführt (Tabelle 5).

PRE-, KTE- und CTE-Extrakte haben das höchste Potenzial als natürliche Kosmetikpigmente. Die höchsten Chroma-Werte (C*) wurden jedoch für CTE beobachtet. Basierend auf dem Wert des h-Grad-Parameters wurde festgestellt, dass es die gelbe Farbe dieses Extrakts ist, die beobachtet und mit bloßem Auge sichtbar ist. Bei KTE- und PRE-Extrakten ist trotz des niedrigen C*-Wertes (2,8) die Farbe dieser Extrakte mit bloßem Auge deutlich erkennbar und wurde für PRE-Extrakt mit rot-lila und für KTE-Extrakt mit blau-violett angegeben. Die Wasserextrakte von PGE und GGE waren rötlich und leicht orange gefärbt, und die erhaltenen Chroma-Werte lagen auf dem Niveau von 1,3. Für diese Farbe waren diese Werte mit bloßem Auge nicht signifikant wahrnehmbar.

2.8.2. Bestimmung der Farbparameter von Kosmetika anhand der Extrakte

In den letzten Jahren bestand insbesondere in der Lebensmittel- und Kosmetikindustrie ein starker Bedarf an der Entwicklung neuer Farbstoffe natürlichen Ursprungs. Im Vergleich zu synthetisch gewonnenen Farbstoffen können sie geringere negative Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und die Umwelt haben [80]. Die erhaltenen Extrakte wurden zur Formulierung einer mizellaren Make-up-Entferner-Modellflüssigkeit verwendet. In jeder Formulierung wurden sie in einer Konzentration von 1 Prozent verwendet. Die Ergebnisse der Farbparameter von Modellkosmetik sind in Tabelle 6 dargestellt.

Es wurde beobachtet, dass die Zugabe von 1-prozentigen Wasserextrakten aus PRE, PGE, CTE und GGE die Farbe des Make-up-Entferners signifikant beeinflusste. Jede Probe war mit bloßem Auge farblich deutlich sichtbar. Der PRE-Extrakt änderte die Farbe des Kosmetikums in Orange und der PGE-, CTE- und GGE-Extrakt änderte sie in Gelb.

Die Möglichkeit, die analysierten Extrakte als potentielle Farbstoffe einzusetzen, wird durch die relativ hohen Werte von △Make-up-Entferner mit Extrakt/Basis-Make-up-Entferner bestätigt, was auf eine deutliche Farbveränderung von Modellkosmetik mit Zugabe des Extrakts im Vergleich hinweist zur Basisprobe (ohne Zugabe der Extrakte). Literaturangaben [73] zeigen, dass bei AE-Werten über 5 die Farbe von der nackten Vorhaut wahrgenommen und als Farbeffekt wahrgenommen wird. Für Make-up-Entferner, die PRE-, KTE- und CTE-Extrakte enthielten, wurden die AE-Werte von 8,83, 9,17 bzw. 8,14 erhalten. Bei Produkten mit den Extrakten von PGE und GGE wurde kein signifikanter Einfluss des Extrakts auf die Farbe der Zubereitung beobachtet. Die Werte von AE liegen im Bereich von 2.51-2.82. Dies bedeutet, dass der Farbunterschied nur für einen erfahrenen Beobachter erkennbar ist [80,81].

3. Materialien und Methoden

3.1. Pflanzenmaterial und Extraktionsverfahren

Das in der Forschung verwendete Pflanzenmaterial waren getrocknete Blüten von P. rhoeas L., P.granatum L., C.ternatea L., C.tinctorius L. und G.globosa L., die aus dem örtlichen Kräuterladen bezogen wurden . Der Extraktionsprozess wurde in einem Ultraschallbad (Digital Mgtrasonic Cleaner, Berlin, Deutschland) durchgeführt, das unter Verwendung der von Yang et al.[82] beschriebenen Methode durchgeführt wurde. 10 g getrocknete Blüten und 100 g Wasser wurden verwendet, um Wasserextrakte der getesteten Pflanzen herzustellen. Der Prozess wurde für 20 min bei Raumtemperatur durchgeführt. Die erhaltenen Extrakte wurden dann gesammelt und dreimal durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert. Nach Filtration wurden die Extrakte unter reduziertem Druck bei 40 Grad eingedampft. Aus den getrockneten Extrakten wurde eine Stammlösung mit einer Konzentration von 100 mg/ml hergestellt und bis zur weiteren Analyse im Dunkeln bei 4 Grad gelagert. Folgende Abkürzungen werden verwendet: PRE – Papaver rhoeas-Extrakt, PGE – Punica granatum-Extrakt, GGE – Gomphrena globosa-Extrakt, CTE – Carthamus tinctorius-Extrakt, KTE – Clitoria ternatea-Extrakt.

3.2. Bestimmung bioaktiver Verbindungen durch HPLC-UV-ESI-MS

Die erhaltenen Extrakte wurden analysiert, um ihre wichtigsten bioaktiven Verbindungen unter Verwendung einer HPLC (DionexUltiMate 300{{20}} RS Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA) zu bestimmen mit einem Massenspektrometer (4000 QTRAP, AB Sciex, Concord, ON, Kanada), ausgestattet mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) und einer dreifachen Quadrupol-Ionenfallenmasse Analysator. Die chromatographische Trennung wurde mit einem Gradienten-Umkehrphasensystem erreicht. Darüber hinaus wurde eine 100 × 4,6-mm-Chromatographiesäule Kinetex 3,5 μm XB-C18 100 A mit Isobutyl-Seitenketten und mit TMS-endverkappender stationärer Phase, die mit einer Vorsäule ähnlicher Zusammensetzung verwendet wurde, von Phenomenex gekauft und bei 30 Grad gehalten . Ein binäres Lösungsmittelsystem, umfassend 0,1 Prozent (o/v) wässrige Ameisensäure als Lösungsmittel A und Methanol als Lösungsmittel B, wurde im Gradientenmodus während 19,1 min der Laufzeit verwendet. Die angewandten Elutionsbedingungen waren wie folgt: 0,0-15,0 min 25-100 Prozent B, 15,0-17,0 min 100 Prozent B, 17,0-17,1 min 100-25 Prozent B,17.1-19,1 Min. 25 Prozent B. Die Flussrate der mobilen Phase betrug 0,6 ml/min und das Injektionsvolumen 10 μl. Der Eluent wurde mit einem Elektrospray-Ionen-Massenspektrometer (ESI-MS) im Negativ-Ionen-Modus überwacht und von m/z 20 bis 1000 Da gescannt. Für die Quantifizierungsanalyse arbeitete der Triple-Quadrupol-MS-Detektor im MRM-Scanmodus (Multiple Reaction Monitoring). Optimale Massenanalysatorbedingungen und die Auswahl von Produkt-Ionen für einzelne Verbindungen wurden experimentell bestimmt. Zu diesem Zweck wurden Standardlösungen der untersuchten Verbindungen (1 ng/mL) in Zusammensetzung der mobilen Phase unter Verwendung einer Infusionspumpe eingeführt, die mit konstanter Probenzufuhr betrieben wurde. Nachdem sichergestellt wurde, dass das richtige Vorläuferion ausgewählt wurde, wurden Declustering-Potential (DP), Eintrittspotential (EP), Kollisionszellen-Austrittspotential (CXP) und Kollisionsenergie (CE) für jeden MRM-Übergang optimiert (Tabelle S1). Zwei MRM-Übergänge wurden überwacht, einer zur Quantifizierung und einer zur Bestätigung. Die MS-Parameter wurden wie folgt eingestellt: Kapillartemperatur von 600°C, Schutzgas bei 35 psi, Zerstäubergas bei 60 psi und Trocknungsgas bei 50 psi. Für die Bestimmung bioaktiver Verbindungen wurde eine Quellenspannung -4500 V im negativen Ionisationsmodus angelegt. Als Vorhang- und Kollisionsgas wurde Stickstoff verwendet. Die Datenanalyse wurde mit der Software Analyst 1.5.1 verarbeitet. Die Identifizierung ausgewählter Verbindungen erfolgte anhand der Molekülmasse und der Fragment- oder Anioneneinträge jeder einzelnen Verbindung und wurde durch MS2-Fragmentierung bestätigt. Die Identität von neun Verbindungen wurde zusammen mit ihrer chemischen Formel, deprotonierten Molekülionen und den charakteristischen Fragmentionen für jeden einzelnen Peak bestimmt. Sechs Verbindungen wurden basierend auf der Kalibrierungskurve quantifiziert, die unter Verwendung von Peakflächen der intensivsten MRM-Übergänge von analytischen Standards erstellt wurde. Die Linearität der Detektorantwort für quantifizierte Verbindungen wurde durch Injektion von Kalibrierungsstandards bei acht Konzentrationsstufen im Bereich von 0,01 ug/ml bis 2 ug/ml demonstriert. Kalibrierungskurven waren linear mit Korrelationskoeffizienten (R) größer als 0,99. Falls die Proben nicht in den linearen Bereich des CMS-Detektors fielen, wurden die Proben verdünnt.

Analytische Standards für Chinasäure, Gallussäure, Kaffeesäure, Caffeoylchinasäuren (CQA, zwei Isomere: 3- und 5- CQA) und Quercetin wurden von Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA bezogen ). Alle verwendeten Standards waren von analytischer Qualität (2 größer oder gleich 99 Prozent Reinheit).

Standard-Stammlösungen wurden durch genaues Wiegen und Auflösen von 20 mg jedes Standards in 10 ml LC-MS-Methanol hergestellt, um eine Konzentration von 2 mg/ml zu ergeben. Reihenverdünnungen von 2,{{10}} ug/ml, 1,5 ug/ml, 1,0 ug/ml, 0,5 ug/ml,0 0,1 ug/ml, 0,05 ug/ml, 0,02 ug/ml und 0,01 ug/ml wurden dann unter Verwendung einer Methanollösung von LC-MS-Qualität hergestellt. Die Bestimmungsgrenze (LOQ) wurde mit 0,01 µg/ml definiert.

Der LC-MS/MS-Assay wurde dreifach durchgeführt. Erhaltene Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt.

3.3. Bestimmung der antioxidativen Eigenschaften

3.3.1.ABTS· plus Scavenging-Assay

Zunächst wurde die ABTS-Lösung hergestellt, indem 19,5 mg ABTS und 3,3 mg Kaliumpersulfat mit 7 ml Phosphatpuffer (pH =7,4) gemischt und 16 h im Dunkeln gelöst wurden. Dann wurde die Lösung auf eine Extinktion von etwa 1,0 verdünnt. Extinktionen wurden bei einer Wellenlänge von 入=734 nm gemessen. Als nächstes wurden 20 ml KTE-, PGE-, PRE-, CTE- und GGE-Extrakte (10.100.250.500 ug/ml) mit 980 ml verdünnter ABTSe-Plus-Lösung gemischt und dann 10 Minuten lang im Dunkeln inkubiert. Im nächsten Schritt wurde die Extinktion der vorbereiteten Proben bei 入=734 nm mit einem UV/VIS-Spektrophotometer Aquamate Helion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemessen. Als Blindwert wurde destilliertes Wasser verwendet. Das ABTS plus Scavenging wurde aus Gleichung (1) berechnet:

wobei: As – Extinktion der Probe; Ac – Extinktion der Kontrollprobe. Die Messungen wurden für jede extrahierte Probe dreifach durchgeführt. Das Verfahren wurde von Gawel-Beben et al. [83].

3.3.2. DPPH-Radikalfänger-Assay

Die Fähigkeit der Extrakte, freie Radikale zu fangen, wurde unter Verwendung des von Brand-Williams et al. [84]. Es basiert auf der Verwendung des 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） Radikals. Zuerst wurden 33 μl wässrige Lösungen von Extrakten in Konzentrationen von 100 ug/ml mit 167 μl einer Methanollösung von DPPH (4 mM) gemischt und auf eine Platte mit 96--Wells übertragen und dann durch Schütteln gemischt. Anschließend wurde die Extinktion der Proben bei einer Wellenlänge von 517 nm gemessen. Die Messungen wurden alle 5 Minuten für 30 Minuten auf einem UV-VIS Filter Max ® =5 Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) durchgeführt. Für jeden Extrakt wurden drei unabhängige Wiederholungen durchgeführt. Als Kontrolle wurde Wasser mit einer DPPH-Lösung verwendet. Die antioxidative Kapazität wurde als Prozentsatz der DPPH-Hemmung unter Verwendung von Gleichung (2) ausgedrückt:

wobei: As – Extinktion der Probe; Ac – Extinktion der Kontrollprobe. Die Messungen wurden für jede extrahierte Probe dreifach durchgeführt.

3.3.3.Nachweis von intrazellulären Konzentrationen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)

Um die Fähigkeit der analysierten Extrakte zu bestimmen, die intrazelluläre Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in HaCaT- und BJ-Zellen zu erzeugen, wurde ein fluorogener H, DCFDA-Farbstoff verwendet. Diese Verbindung hat die Fähigkeit, durch passive Diffusion in Zellen einzudringen, wo sie durch intrazelluläre Esterasen zu einer nicht fluoreszierenden Verbindung deacetyliert wird. Wenn reaktive Sauerstoffspezies in der Zelle vorhanden sind, wird diese Verbindung in stark fluoreszierendes DCF umgewandelt. Um den intrazellulären ROS-Spiegel in HaCaTs und BJ zu bestimmen, wurden Zellen in 96-Well-Platten ausgesät. Dann wurden die Zellen für 24 h in einem Inkubator kultiviert. Das DMEM-Medium wurde entfernt und durch 10 μM H2DCFDA (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) ersetzt, das in serumfreiem DMEM-Medium gelöst war. HaCaT- und BJ-Zellen wurden in H, DCFDA für 45 min inkubiert und dann mit den Extrakten in den Konzentrationen von 100, 250 und 500 ug/ml inkubiert. Mit 1 mM Wasserstoffperoxid (H2O2) behandelte Zellen wurden als positive Kontrollen verwendet. Die Kontrollproben waren mit den getesteten Extrakten unbehandelte Zellen. Die DCF-Fluoreszenz wurde alle 90 Minuten mit einem FilterMax F5-Mikroplattenlesegerät (Thermo Fisher Scientific) bei einer maximalen Anregung von 485 nm und Emissionsspektren von 530 nm gemessen [85].

3.4. Bewertung der Hemmung von Matrix-Metallopeptidasen

3.4.1. Bestimmung der Anti-Elastase-Aktivität

Um die Möglichkeit der Hemmung von Matrix-Metalloproteinase, Neutrophilen-Elastase (NE) zu bestimmen, wurde ein fluorometrisches Kit (Abcam, ab118971) angewendet. Der Test wurde gemäß den dem Kit beigefügten Anweisungen und mit dem von Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Die Analysen wurden in einer Standard-96-Well-Platte mit einem durchsichtigen flachen Boden durchgeführt. Für die Analyse wurden Pflanzenextrakte in einer Konzentration von 100 und 250 µg/mL verwendet. Zunächst wurden NE-Enzymlösungen, ein NE-Substrat und eine Inhibitorkontrolle (SPCK) gemäß den Anweisungen hergestellt. Verdünnte NE-Lösung wurde zu allen Vertiefungen gegeben und dann wurden Testproben, die Inhibitorkontrolle und die Enzymkontrolle (Assay-Puffer) zu den nachfolgenden Vertiefungen hinzugefügt. Danach wurden die Proben gemischt und 5 min lang bei 37 Grad inkubiert. In der Zwischenzeit wurde ein Reaktionsgemisch hergestellt, indem der Assay-Puffer und das NE-Substrat gemischt wurden. Die Mischung wurde in jede Vertiefung gegeben und gründlich gemischt. Die Fluoreszenz wurde sofort bei Anregungswellenlänge 入=400 nm und Emission 入=505 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (FilterMax F5, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemessen. Die Fähigkeit zur Hemmung der NE-Aktivität der Analysierten Proben wurde aus Gleichung (3) berechnet:

Das Endergebnis war das arithmetische Mittel aus drei unabhängigen Messungen.

3.4.2. Bestimmung der Anti-Kollagenase-Aktivität

Um die Fähigkeit der erhaltenen Extrakte zur Hemmung der Kollagenase-Aktivität zu beurteilen, wurde ein fluorometrisches Kit (Abcam, Cambridge, UK, ab211108) angewendet. Der Test wurde gemäß den dem Kit beigefügten Anweisungen und mit dem von Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Die Analysen wurden in einer standardmäßigen 96--Well-Platte mit einem durchsichtigen flachen Boden durchgeführt. Für die Analyse wurden Pflanzenextrakte in einer Konzentration von 100 und 250 µg/mL verwendet. Zuerst wurde Kollagenase (COL) in einem Kollagenase-Analysepuffer (CAB) gelöst. Dann wurden analysierte Proben zu COL und CAB gegeben. Inhibitorkontrollproben wurden durch Mischen des Kollagenaseinhibitors (1,10-Phenanthrolin (80 mM) mit Kollagenase und CAB-Puffer hergestellt. Enzymkontrollvertiefungen wurden durch Mischen von verdünntem COL mit CAB hergestellt. Der CAB-Puffer wurde als Hintergrundkontrolle verwendet Anschließend wurden die Proben für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert.Durch Mischen des Kollagenase-Substrats mit CAB wurde ein Reaktionsgemisch hergestellt.Das so hergestellte Reaktionsgemisch wurde zu allen analysierten Proben gegeben undinnig gemischt.Anschließend wurde die Fluoreszenz bei einer gemessen Anregungswellenlänge von 490 nm und Emission von 520 nm. Die Messung wurde im kinetischen Modus für 60 min bei 37 °C durchgeführt.

3.5. Bestimmung der entzündungshemmenden Eigenschaften

3.5.1. Hemmung der Proteindenaturierung

Die Proteinase-Inhibitoraktivität von PRE-, PGE-, KTE-, CTE- und GGE-Extrakten wurde nach der Methode von Sakat et al.[87] bestimmt, die von Gunathilake et al.[88] modifiziert wurde. Kurz gesagt, die Reaktionslösung (2 ml) bestand aus 1 ml 1-prozentigem Trypsin in 2 {{10}} mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) und 1 ml Testprobe ({{17} }.02 ml Extrakt 0,980 ml Wasser). Die Lösung wurde inkubiert (37 Grad für 5 Minuten) und dann wurde 1 ml 0,8 Prozent (w/v) Casein zugegeben und die Mischung wurde weitere 20 Minuten inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden 2 ml 70-prozentige Perchlorsäure zugegeben, um die Reaktion zu vervollständigen. Das Gemisch wurde zentrifugiert, und die Extinktion des Überstands wurde bei 210 nm gegen den Puffer als Leerwert gemessen. Als Kontrolle diente die Phosphatpufferlösung. Die prozentuale Hemmung der Proteindenaturierung wurde nach folgender Formel berechnet:

wobei A1= Absorption der Kontrollprobe und A2= Absorption der Testprobe.

3.5.2. Hemmung der Lipoxygenase-Aktivität

Die Fähigkeit der erhaltenen Extrakte zur Hemmung der Lipoxygenase-Aktivität wurde unter Verwendung des von Sarvesvaran et al. beschriebenen Verfahrens bestimmt. 【89】. Zuerst wurden 10 ul Pflanzenextrakte in verschiedenen Konzentrationen (100, 250 und 500 ug/ml) in einer 96--Well-Platte mit 160 ul 100 mM PBS und 20 ul Sojabohnen-Lipoxygenase-Lösung (167 U/) gemischt. ml）. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 25 Grad inkubiert und nach dieser Zeit wurden 10 &mgr;l Natriumlinolsäure zugegeben, um die Reaktion zu starten. Dann wurde die Extinktion der Proben bei 234 nm über einen Zeitraum von 3 Minuten pro Minute unter Verwendung eines FilterMax F5-Mikroplattenlesegeräts (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemessen. Als positive Kontrolle wurde Diclofenac verwendet. Der Prozentsatz der Hemmung der Lipoxygenase-Aktivität wurde aus Gleichung (6) berechnet:

wobei: Wie die Extinktion der getesteten Probe, Ac die Extinktion der Negativkontrolle ist.

Das Endergebnis war das arithmetische Mittel aus drei unabhängigen Messungen.

3.6. Zytotoxizitätsanalyse

3.6.1. Zellkultur

In dieser Studie wurden zwei Hautzelllinien verwendet: normale menschliche Keratinozyten (HaCaT) und Fibroblasten (BJ). HaCaTs wurden von CLSCell Lines Service (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Deutschland) und BJs von der American Type Culture Collection ( Manassas, Virginia, USA). Die Zellen wurden in Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM, Biological Industries, Cromwell, CO, USA) mit Natriumpyruvat, L-Glutamin und hohem Glucosegehalt (4,5 g/l) gezüchtet. Das Medium wurde auch mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (Gibco, Waltham, MA, USA) und 1 Prozent mit Antibiotika (100 U/ml Penicillin und 1000 ug/ml Streptomycin, Gibco) angereichert, um eine mikrobielle Kontamination zu verhindern. Die Zellen wurden in einem Inkubator bei 37 Grad in einer befeuchteten Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid gezüchtet.

3.6.2.Alamar Blue-Assay

Nachdem die kultivierten Zellen (HaCaT und BJ) die gewünschte Konfluenz erreicht hatten, wurde das DMEM-Medium in die Kulturflaschen abgesaugt. Die am Boden befestigten Zellen wurden zweimal mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Der Zellrasen wurde mit Trypsin abgelöst und anschließend wurden die Zellen in ein frisches DMEM-Medium gegeben. Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit flachem Boden (VWR, Radnor, PE, USA) ausplattiert und nach dem Anbringen am Boden der Platten wurden die Zellen mit Extrakten (100, 250 und 500 ug/ml) behandelt. Die Zellen wurden für 24 h inkubiert.

Der Zytotoxizitätstest wurde mit dem Alamar Blue Assay (Sigma, R7017, Life Technologies, Bleiswijk, Niederlande) durchgeführt. Nach der Inkubation wurde eine Resazurin-Lösung mit einer Konzentration von 60 &mgr;M zu den Vertiefungen gegeben, dann wurden die Platten 2 Stunden lang bei 37 Grad in einen Inkubator gestellt. Nach dieser Zeit wurde die Fluoreszenz gemessen (入=570 nm). Jede Extraktkonzentration wurde in drei Wiederholungen durchgeführt.

3.6.3. Neutralrotaufnahme-Assay

Der Neutral Red Uptake Assay ist der zweite Test, der zur Bestimmung der Zytotoxizität von PRE, PGE, KTE, CTE und GGE verwendet wird. Zunächst wurden 96-Well-Platten mit flachem Boden wie im vorherigen Abschnitt beschrieben vorbereitet. Nachdem die Zellen den Extrakten 24 h lang ausgesetzt waren, wurden sie abgesaugt und mit neutralrotem Farbstoff (40 ug/ml) ersetzt und für 2 h inkubiert. Nach dieser Zeit wurden die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Im nächsten Schritt wurde Entfärbungspuffer (150 μl) in die Vertiefungen gegeben. Dann wurde die Aufnahme von Neutralrot dve durch Messen der optischen Dichte (OD) bei 540 nm bestimmt. Jede Extraktkonzentration wurde in drei Wiederholungen durchgeführt.

3.7. Bestimmung des Lichtschutzfaktors (in vitro)

Der Sonnenschutzfaktor (SPF) wurde bestimmt, indem die Extinktion einer wässrigen Lösung von Extrakten in Konzentrationen von 10 ug/ml und 50 ug/ml im Wellenlängenbereich von 290 bis 320 nm in Intervallen von 5- nm gemessen wurde. Aus den erhaltenen Ergebnissen wurde der SPF anhand der Mansur-Gleichung [90] berechnet: wobei∶ EE（λ） – Erythem-Effekt-Spektrum, I（入） – Sonnenintensitätsspektrum, ABS（入） – Absorption des Sonnenschutzprodukts, CF – Korrekturfaktor（=10）, E（N）×I（λ） – von Sayre bestimmte Werte wurden verwendet [91].

3.8. Transepidermaler Wasserverlust (TEWL) und Hautfeuchtigkeitsmessungen

TEWL- und Hautfeuchtigkeitsmessungen wurden mit einer TEWAmeter TM 300-Sonde und einer Corneometer CM 825-Sonde durchgeführt, die an einen MPA-Adapter (Courage plus Khazaka Electronic, Köln, Deutschland) angeschlossen waren. Fünf Freiwillige nahmen an der Studie teil. An ihrem Unterarm Haut, sechs Bereiche (2 × 2 cm groß) wurden markiert.An fünf Stellen wurde eine Menge von 0,2 ml der getesteten Pflanzenextrakte aufgetragen,die sechste Stelle war die Kontrolle (ohne Proben behandelt).Nach 60 und 360 min , der Hydratationsgrad und TEWL-Messungen durchgeführt.Das Endergebnis war das arithmetische Mittel (von jedem Freiwilligen) von fünfunabhängigen Messungen (Hauthydratation) und 20 Messungen (TEWL).

3.9.Zubereitung von Modellkosmetik (Make-up-Entferner) mit Extrakten

Es wurde ein Kosmetikmodell (Make-up-Entferner) hergestellt. Alle verwendeten Komponenten entsprachen den Anforderungen von EcoCert und COSMOS. Die Formulierung ist in Tabelle 7 gezeigt.

Das Produkt wurde durch Mischen der Bestandteile (von Punkt 1 bis Punkt 6) bei Raumtemperatur hergestellt, bis eine homogene Flüssigkeit erhalten wurde. Im letzten Schritt wurde der pH-Wert der Formulierung eingestellt. Der Make-up-Entferner wurde in Portionen aufgeteilt. Eine Menge von 1 Prozent der Stammlösungen des Extrakts wurde zu jeder Portion gegeben und gründlich gemischt.

3.10. Bestimmung der Farbparameter von Extrakten und Kosmetika (Make-Up-Entferner), die Extrakte enthalten

Proben von Extrakten und Kosmetika mit Extrakten wurden 48 h nach ihrer Herstellung bei Raumtemperatur getestet. Zur Auswertung der Farbparameter (CIELAB-Koordinaten) wurde ein CHROMA METER CR-400 (Konica Minolta, Sensing Inc., Tokio, Japan) verwendet. Das CIELAB-System wurde 1978 von der Internationalen Beleuchtungskommission definiert. Es basiert auf drei Farbattributen: L*, a*, b, wobei L* eine Helligkeitsvariable ist, die proportional zum Wert im Munsell-System ist, und a* und b* sind Farbkoordinaten. Die a*- und b*-Koordinaten geben Positionen auf der Rot/Grün- bzw. Gelb/Blau-Achse an ( plus a=rot, -a=grün; plus b=gelb, - b =blau).

Basierend auf den erhaltenen Daten: L*, a* und b* wurden die folgenden Farbparameter berechnet: Chroma (C*) und Farbton (h). Folgende Gleichungen wurden verwendet:

4. Schlussfolgerung

Aufgrund der erhaltenen Ergebnisse kann geschlussfolgert werden, dass die getesteten Pflanzenextrakte mehrere positive Eigenschaften aufweisen, dank denen sie als sicherer und bioaktiver Inhaltsstoff bei der Herstellung von Kosmetika verwendet werden können. Es hat sich gezeigt, dass diese Pflanzen eine reiche Quelle von Polyphenolen sind, was ihnen antioxidative Eigenschaften verleiht. PRE zeigte die beste Fähigkeit, freie Radikale abzufangen, was wahrscheinlich daran liegt, dass es im Vergleich zu anderen Pflanzen die meisten Polyphenole enthält. PGE und PRE zeigten die beste Fähigkeit, die ROS-Produktion in Zellen zu reduzieren. Darüber hinaus zeigen Pflanzen keine zytotoxische Aktivität. Alle getesteten Extrakte zeigten eine Hemmwirkung auf die Enzyme Elastase und Collagenase, wobei P. granatum und GGE die stärkste Hemmwirkung aufwiesen. Dies könnte darauf hindeuten, dass diese Pflanzen in der Kosmetik als Substanzen verwendet werden können, die die Alterungsprozesse verlangsamen. Darüber hinaus zeigen die erhaltenen Ergebnisse, dass diese Pflanzen entzündungshemmende Eigenschaften haben. In diesem Fall schienen CTE und KTE die besten zu sein. KTE und PGE zeigten bereits in geringen Konzentrationen eine Schutzwirkung gegen UV-Strahlung. Bei höheren Konzentrationen hatten alle Pflanzen eine UV-Schutzwirkung. Darüber hinaus wirkten sich die Pflanzen positiv auf die Hautfeuchtigkeit aus und reduzieren den transepidermalen Wasserverlust. PRE-, KTE- und CTE-Extrakte können als wirksame Farbstoffe in kosmetischen Produkten verwendet werden. Die Modellflüssigkeit zum Abschminken mit den oben genannten Extrakten zeichnete sich durch eine intensive und über die Zeit stabile Farbe aus. Die Farbe der Kosmetika mit PGE- und GGE-Extrakten kann nur von erfahrenen Beobachtern wahrgenommen werden und sie unterscheiden sich nicht wesentlich von der kosmetischen Blindprobe ohne Zugabe des Extrakts. Unter Berücksichtigung aller erhaltenen Ergebnisse kann geschlussfolgert werden, dass Papaver rhoeas, Clitoria ternatea und Carthamus tinctorius erfolgreich als Quellen für gelbe, orange, blaue und violette Farbstoffe bei der Herstellung von Kosmetika verwendet werden können, die sicher in der Anwendung sind, und wirkt sich zudem positiv auf die Haut aus.

Dieser Artikel ist ein Auszug aus Molecules 2022, 27, 922. https://doi.org/10.3390/molecules27030922 https://www.mdpi.com/journal/molecules