Magenkrebs (GC) war die erste führende Inzidenz und die zweithäufigste Mortalität von Krebserkrankungen des Verdauungssystems

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Abstrakt

Die medikamentöse Behandlung mit Platin ist eine der vorherrschenden chemotherapeutischen Strategien für Patienten mit Magenkrebs (GC). Die therapeutische Wirkung ist jedoch nicht zufriedenstellend, was hauptsächlich auf die erworbene Resistenz gegen Platinmedikamente zurückzuführen ist. Daher kann ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen die therapeutische Wirksamkeit von GC erheblich verbessern. In dieser Studie wollten wir die chemoresistenzbezogenen Funktionen/Mechanismen und die klinische Bedeutung des Glucose-regulierten Proteins 75 (GRP75) bei GC untersuchen. Hier zeigten unsere Daten, dass im Vergleich zu SGC7901-Zellen die Expression von GRP75 in Cisplatin-resistenten (Zellen (SGC7901 *)) deutlich höher war. Der Knockdown von GRP75 hob die Aufrechterhaltung des mitochondrialen Membranpotentials (MP) auf und hemmte den Nuklearfaktor Erythroid {{ 10}}verwandter Faktor 2 (NRF2), Phosphatidylinositol-3-Kinase/Proteinkinase B (Pl3K/AKT), Hypoxie-induzierbarer Faktor 1a (HIF-1a) und c-myc, was zu einer Blockierung der Aktivierung von führte ihre nachgeschalteten Ziele. Diese Prozesse schwächten die Antioxidations-/Apoptosefähigkeiten ab und veränderten die metabolische Reprogrammierung in SGC7901-Zellen, was zu einer erneuten Sensibilisierung dieser Zellen gegenüber Cisplatin führte. Die Überexpression von GRP75 in SGC7901-Zellen verursachte jedoch die gegenteiligen Effekte. Ein Xenotransplantat-Modell bestätigten die oben genannten Ergebnisse.Bei GC-Patienten, die eine Platin-Chemotherapie und eine Meta-Analyse erhielten, warein hoher GRP75-Spiegel positiv mit aggressiven Merkmalen und einer schlechten Prognoseverbunden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf gastr Darmkrebs und war ein unabhängiger Prädiktor für das Gesamtüberleben. Insgesamt deutete unsere Studie darauf hin, dass GRP75 an der Cisplatin-Resistenz von GC beteiligt war und dass GRP75 ein potenzielles therapeutisches Ziel für die Wiederherstellung der Arzneimittelreaktion in platinresistenten Zellen und ein hilfreiches additives prognostisches Instrument zur Steuerung des klinischen Managements von GC-Patienten sein könnte.

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Einführung

Magenkrebs (GC) war die erste häufigste Inzidenz und zweithäufigste Mortalität von Krebserkrankungen des Verdauungssystems in China. Aktuelle Behandlungen für fortgeschrittene GC waren die chirurgische Operation in Kombination mit systemischer Chemotherapie, aber die Langzeitüberlebensrate war aufgrund der hohen postoperativen Rezidive weniger als zufriedenstellend2. In der klinischen Praxis waren Platinmedikamente eines der Mittel der ersten Wahl für fortgeschrittene GC-Chemotherapie3. Erworbene Arzneimittelresistenzen traten jedoch immer nach mehreren Zyklen einer platinbasierten Behandlung auf und weisen auf eine schlechte Prognose hin.ZistanchDaher waren die Aufklärung der potenziellen Mechanismen und die Identifizierung neuer therapeutischer Strategien zur Überwindung der Resistenz gegen Platinmedikamente bei GC-Patienten dringend erforderlich.

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Glucose-reguliertes Protein 75 (GRP75) war das stressinduzierbare molekulare Chaperon, das zur Familie der Hitzeschockproteine ​​gehörte4. Die Überexpression von GRP75 war eng mit der Tumorprogression bei verschiedenen menschlichen Krebsarten verbunden5-7. Hier haben wir durch Untersuchung einer Metaanalyse festgestellt, dass ein hoher GRP75-Spiegel bei mehreren Krebsarten des Verdauungssystems (Darmkrebs, Cholangiokarzinom und Bauchspeicheldrüsenkrebs) auf eine signifikant schlechte Prognose hinweist. Bei der Arzneimittelresistenz kehrte die Hemmung von GRP75 die Cisplatin- und Doxorubicin-Resistenz bei hepatozellulärem Karzinom und Eierstockkrebs um. GRP75 sequestrierte klassischerweise das p53 im Zytoplasma, was zur Inaktivierung der p53-Funktion führte und die App-Tosis unterdrückte10. Eine frühere Studie berichtete, dass GRP75 positive Tumoren hatten eine schlechtere Prognose im Vergleich zu GRP75-negativen Tumoren bei GC mit normaler p53-Funktion. Allerdings war p53 eines der am häufigsten mutierten Gene bei GC (betroffen von mehr als 50 % der Patienten)12-15. Daher stellten wir die Hypothese auf dass GRP75 zusätzlich zur klassischen Unterdrückung der p53-Aktivität an der Induktion/Aufrechterhaltung der Resistenz gegen Platin-Medikamente in GC beteiligt sein könnte, indem es eine {53--unabhängige Weise einsetzt.

In dieser Studie trug die höhere Expression von GRP75 zur Cisplatin-Resistenz in SGC7901-Zellen und in einem Xenotransplantat-Modell bei. Mechanistisch induzierte/erhielt GRP75 die Cisplatin-Resistenz über die Regulierung der antioxidativen/apoptotischen Fähigkeiten und metabolischen Umprogrammierungseigenschaften.Cistanche AustralienBei GC-Patienten trug die Überexpression von GRP75 zu den aggressiven Eigenschaften und der schlechten Prognose bei. Unsere Ergebnisse zeigten, dass GRP75 die Cisplatin-Resistenz bei GC förderte und ein Biomarker für die Vorhersage des Ansprechens auf eine Behandlung mit Platinarzneimitteln sein könnte.Cistanche-VorteileDie Ausrichtung auf GRP75 könnte ein neues Verständnis der systemischen GC-Chemotherapie ermöglichen.

Ergebnisse

Die Wirkungen von GRP75 auf die Cisplatin-Resistenz in GC-Zelllebensfähigkeitsassays wurden verwendet, um die Resistenz von SGC7901~-Zellen zu verifizieren, die Ipsos (uM) von Cisplatin für SGC7901- und SGC7901CR-Zellen waren: 5,518 vs. 72,46 (Fig. 1A). Basierend auf KM-Plotter-Datenbanken deutete die erhöhte Expression von GRP75 auf eine schlechte Prognose hin (Abb. 1B). Darüber hinaus sind die GRP75-Expressionen in SGC7901CR-Zellen im Vergleich zu den SGC7901-Elternzellen ( 1C ) deutlich erhöht, was darauf hindeutet, dass GRP75 zur Cisplatin-Resistenz beitragen könnte. Um diese Hypothese zu verifizieren, wurden SGC7901~-Zellen mit Scramble- oder GRP75-siRNA transfiziert, und die IC50s (uM) von Cisplatin für Scramble- oder GRP75-siRNA-transfizierte SGC7901CK-Zellen waren: 50,83 vs. 20, 86 (Abb .1D). Im Gegensatz,

Überexpression von GRP75 durch Transfektion der GRP75-Plasmide in SGC7901-Zellen zeigte, dass die IC50-Werte der mit Cisplatin für Scramble- oder GRP75-Plasmide transfizierten SGC7901-Zellen 3,825 gegenüber 6,98 betrugen (Fig. 1E). Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass GRP75 eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung/Induktion der Cisplatin-Resistenz bei GC spielte, aber die Mechanismen blieben weiterer Untersuchung vorbehalten.

Mögliche Mechanismen, die GRP75 zugrunde liegen, verursachten eine Cisplatin-Resistenz

Wir haben die Microarray-Datensätze GSE122130 (SGC7901CR vs. SGC7901) und GSE14209 (Gewebe, Cisplatin-resistent vs. Cisplatin-sensitiv) von GEO heruntergeladen, dann den GO-Biological-Prozess und die KEGG-Pathway-Anreicherungsanalyse basierend auf DAVID und den Top 10 durchgeführt Ergebnisse wurden in Fig. 2A-D gezeigt. Zu den wesentlichen Unterschieden der biologischen Prozesse zwischen SGC7901C*-Zellen und SGC7901-Zellen gehörten Oxidations-Reduktion, apoptotischer Prozess (Abb. 2A), KEGG-Pathway-Anreicherungsanalyse, die ergab, dass DEGs-Sätze eng mit Stoffwechselwegen korrelieren, und Phosphatidylinositol-3-Kinase/Proteinkinase B (PI3K/AKT)-Weg (Abb. 2B). Die Reaktion auf das Medikament wurde in die wesentlichen Unterschiede der biologischen Prozesse zwischen Cisplatin-resistenten und Cisplatin-empfindlichen Tumorgeweben einbezogen, und der Stoffwechselweg war auch das Kernglied in der KEGG-Pathway-Anreicherungsanalyse (Abb. 2C, D). Außerdem wurde ein Netzwerk von 60 Proteinen, die signifikant mit GRP75 interagierten, unter Verwendung der String-Datenbank konstruiert, dann eine KEGG-Pathway-Analyse durchgeführt, die besagte, dass Stoffwechselwege eine wichtige Rolle zwischen GRP75 und seinen Interaktoren spielten (Abb. 2E). Basierend auf diesen Ergebnissen vermuteten wir, dass Antioxidation/Apoptose und metabolische Reprogrammierung das Überleben und Wachstum von GC fördern könnten, was zu einer Cisplatin-Resistenz führt. Die Mechanismen der Beteiligung von GRP75 an der Regulation mussten jedoch weiter untersucht werden (Abb. 2F).

Wirkungen von GRP75 auf Antioxidation und Anti-Apoptose Hier war der intrazelluläre ROS-Spiegel in SGC7901CR-Zellen im Vergleich zu seinen elterlichen Gegenstücken erhöht (Abb. 3A), was darauf hindeutet, dass SGC7901Ck-Zellen relativ höheren oxidativen Stressbedingungen ausgesetzt waren. Eine frühere Studie zeigte, dass GRP75 an der Stabilisierung von MMP, einer wichtigen Quelle der ROS-Erzeugung, beteiligt war. Hier hob der Knockdown von GRP75 die durch Cisplatin induzierte Aufrechterhaltung von MMP in SGC7901CK-Zellen auf, und die Überexpression von GRP75 hatte den gegenteiligen Effekt in SGC7901-Zellen ( 3B ).Cistanche-CholesterinDann validierten wir die Beziehung zwischen GRP75 und Antioxidation und Anti-Apoptose. Wie in Fig. 3C gezeigt, senkte der Knockdown von GRP75 den Spiegel des Nuklearfaktors Erythroid-2-related Factor 2 (NRF2) und seiner nachgeschalteten Zielgene (HO-1 und NQO-1) in SGC7901 ~ Zellen, und die Überexpression von GRP75 zeigte den gegenteiligen Effekt in SGC7901-Zellen. Darüber hinaus verstärkte der Knockdown von GRP75 oder NRF2 in SGC7901CR-Zellen die durch Cisplatin induzierten intrazellulären ROS-Generationen, Apoptose (Abb. 3D) und Caspase-3-Aktivitäten (ergänzende Abb. S1). Im Gegensatz dazu schwächte die Überexpression von GRP75 in SGC7901-Zellen die durch Cisplatin induzierte ROS-Generation, Zellapoptose (Abb. 3E) und Caspase-3-Aktivitäten signifikant ab (ergänzende Abb. S1). Diese Ergebnisse zeigten, dass die durch GRP75 aufrechterhaltene/induzierte Cisplatin-Resistenz möglicherweise über die Induktion von Antioxidation und Anti-Apoptose in GC-Zellen erfolgt.

Wirkungen von GRP75 auf die metabolische Reprogrammierung Als nächstes untersuchten wir weiter, wodurch GRP75 eine Veränderung der metabolischen Reprogrammierung induzierte. Immer mehr Beweise zeigten, dass der Metabolismus von Tumorzellen keine abnormale Veränderung eines einzelnen Stoffwechselwegs war, sondern eine Neuprogrammierung des gesamten zellulären Stoffwechselnetzwerks17. Viele klassische Onkogene oder Signalwege waren direkt oder indirekt an der metabolischen Reprogrammierung beteiligt, wie PI3K/AKT, Hypoxie-induzierbarer Faktor la (HIF-la), c-myc und so weiter“819. Daher haben wir überprüft, ob GRP75 es war an der metabolischen Reprogrammierung von GC-Zellen beteiligt. Wie in Abb. 4A gezeigt, beobachteten wir erhöhte p-AKT-, HIF-la- und c-myc-Spiegel in SGC7901CR-Zellen im Vergleich zu den ursprünglichen SGC7901-Zellen GRP75 senkte die Cisplatin-induzierten p-AKT-, HIF-la- und c-Myc-Proteinspiegel und ihre nachgeschalteten Ziele im Zusammenhang mit der Glykolyse (HK2: Hexokinase 2; PDK1: Pyruvatdehydrogenasekinase 1; und LDHA: Lactatdehydrogenase A-Kette). Im Gegensatz dazu zeigte die Überexpression von GRP75 in SGC7901-Zellen den gegenteiligen Effekt (Abb. 4B, C). Darüber hinaus zeigte der Knockdown von GRP75 oder AKT in SGC7901CR-Zellen eine signifikante Abnahme der Glukoseaufnahme und der durch Cisplatin induzierten Zelllebensfähigkeit/-wachstum; Überexpression von GRP75 in SGC7901-Zellen deutlich erhöhte die Fähigkeit zur Glukoseaufnahme und Zelllebensfähigkeit/-wachstum, verursacht durch Cisplatin (Abb. 4D-F). Insgesamt deuteten diese Daten darauf hin, dass die durch GRP75 aufrechterhaltene/induzierte Cisplatin-Resistenz in GC-Zellen möglicherweise über die Teilnahme an p-AKT-, HIF-la- und c-myc-vermittelter metabolischer Reprogrammierung erfolgt.

Bestätigung der In-vitro-Daten in einem Xenograft-Modell Anschließend untersuchten wir die potenzielle klinische Relevanz von GRP75 in vivo. Die Xenotransplantat-Daten zeigten, dass die Behandlung mit Cisplatin allein oder Knockdown von GRP75 allein das Tumorwachstum hemmen könnte; die Cisplatin-Behandlung in Kombination mit GRP75-Knockdown erleichterte jedoch signifikant die Cisplatin-induzierte Hemmung des Tumorwachstums (Fig. 5A). Darüber hinaus zeigten IHC- und qPCR-Assays, dass Cisplatin plus GRP75-siRNA die Expression von Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT und nachgeschalteten Zielen im Vergleich zur Behandlung mit Cisplatin allein signifikant verringerte, aber die Apoptose erhöhte (wie durch TUNEL-Färbung bestimmt, Abb. 5B , C). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass GRP75 über die Regulierung der Antioxidations-/Anti-Apoptose-Fähigkeiten und die metabolische Reprogrammierung das Überleben und Wachstum in vivo stimulierte, was wiederum zu einer Cisplatin-Resistenz von GC führte.

Identifizierung von GRP75 als charakteristischer krebsfördernder Faktor und die klinische Bedeutung von GRP75 bei GC

Wir haben dann die GRP75-Expression in aufeinanderfolgenden Abschnitten von GC-Proben ausgewertet. Wie in Fig. 6A gezeigt, wurde im Vergleich zu benachbarten Nicht-Tumor-Magengeweben eine beträchtliche Erhöhung der GRP75-Expression in GC-Geweben beobachtet. Die Überexpression von GRP75 wurde in GC-Geweben durch den IHC-Intensitäts-Score nachgewiesen (Fig. 6B). Eine stärkere Färbung für GRP75 wurde auch mit zunehmender TNM-Klassifizierung des bösartigen Tumorstadiums beobachtet (Fig. 6C, D). Dann teilten wir diese 116 GC-Proben in zwei Gruppen ("GRP75 niedrig" vs. "GRP75 hoch", entsprechend der IHC-Intensität, Abb. 6E). Die transversalen Durchmesser von Tumoren in der Gruppe "GRP75 hoch" waren signifikant größer als die in der Gruppe "GRP75 niedrig" (Fig. 6F). Wir haben die klinische Prognose von GRP75 bei GC weiter validiert. Die Kaplan-Meier-Überlebensanalyse zeigte auch, dass GC-Patienten in der Gruppe „GRP75 hoch“ ein schlechteres Gesamtüberleben hatten als diejenigen in der Gruppe „GRP75 niedrig“ (Abb. 6G).

Die multivariate Analyse ergab, dass GRP75 ein unabhängiger Prädiktor für das Gesamtüberleben war (Tabelle 1).Cistanche Deserticola Nebenwirkungen,Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass GRP75 eine charakteristische Rolle bei der führenden GC-Progression, der Cisplatin-Resistenz und der schlechten Prognose spielt. Die Metaanalyse des hohen GRP75-Spiegels mit dem Prognoseflussdiagramm der Literatursuche und -auswahl sowie die Metaanalyse wurden in der ergänzenden Abb. S2 gezeigt. Das Random-Effect-Modell und das Fixed-Effect-Modell wurden verwendet, um den HR-Wert zu berechnen und zu analysieren. Beide zeigten, dass hohe GRP75-Spiegel signifikant mit schlechten Patientenergebnissen assoziiert sind. Die gepoolte HR betrug 1,91 (95-Prozent-KI 1,62 bis 2,25), mit Heterogenität (I'=0,0 Prozent, p =0,559) (Abb. 7A). Dann führten wir eine Untergruppenanalyse durch, die zeigte, dass das Expressionsniveau von GRP75 bei Magen-Darm-Krebs (gepoolte HR war 1,99,95 Prozent, KI 1,64 bis 2,43) eine signifikante Beziehung zu einer schlechten Überlebensprognose hat. Sicherlich wurden ähnliche Ergebnisse auch bei anderen Tumoren gefunden (gepoolte HR war 1,74,95 Prozent CI 1,29 bis 2,33) (Abb. 7B). Beide

Begg's Funnel Plot und Egger's Test wurden verwendet, um den möglichen Publikationsbias der eingeschlossenen Studien zu beurteilen. Bei der Analyse des Zusammenhangs zwischen GRP75 und OS betrug der p-Wert des Begg-Tests und des Egger-Tests 0.076 bzw. 0,024 (Abb. 7C und D). Der Egger-Test hat jedoch eine höhere Sensitivität bei der Bewertung des Publikationsbias. Daher wurde die Trim-and-Fill-Methode verwendet, um unsere Ergebnisse glaubwürdiger zu machen. Wie in Abb. 7E gezeigt, betrug die angepasste Herzfrequenz im Fixed-Effect-Modell 1,785 (95-Prozent-KI 1,530 bis 2,081, p<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

Diskussion

In dieser Studie verwendeten wir eines der First-Line-Chemotherapeutika für Patienten mit GC, Platin-Medikamente. Klassischerweise könnten Platin-Medikamente kovalent an Guanin an der DNA-Kette binden und somit die Replikation und Transkription von DNA2 blockieren. Aufgrund von Arzneimittelresistenzen und unerwünschten Nebenwirkungen war es jedoch dringend erforderlich, neue therapeutische Strategien zur Aufhebung der Resistenz bei GC-Patienten zu identifizieren. Darüber hinaus entwickelten GC-Patienten nach Erhalt mehrerer Cisplatin-Zyklen eine Arzneimittelresistenz, und unsere Ergebnisse zeigten, dass SGC7901-Zellen im Vergleich zu SGC7901-Zellen eine signifikante Resistenz gegenüber Cisplatin aufwiesen.

GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) spielte eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Entstehung und des Fortschreitens menschlicher Krebserkrankungen-7. In jüngerer Zeit war klar geworden, dass GRP75 auch eine entscheidende Rolle bei der Chemotherapie-Resistenz spielt. „Zusätzlich zu GRP75 spielten andere Hitzeschockproteine ​​über PI3K/AKT/NF-KB und andere Signalwege eine entscheidende Rolle bei der Cisplatin-Resistenz.21-24 Der molekulare Mechanismus der GRP75- und Cisplatin-Resistenz wurde jedoch selten berichtet.Hier zeigte unsere Studie, dass GRP75 die Antioxidations-/Apoptosefähigkeiten förderte und die metabolische Reprogrammierung veränderte, was zu einer Cisplatin-Resistenz in GC-Zellen führte.Wir fanden auch heraus, dass GRP75 hochreguliert war SGC7901~-Zellen und in Gewebeproben von Patienten und korrelierte mit Arzneimittelresistenz, Überlebensvorteil, Wachstum und schlechten Ergebnissen. In der Zwischenzeit identifizierte eine multivariate Analyse, dass GRP75 ein unabhängiger Prädiktor für das Gesamtüberleben war. Außerdem deutete eine Meta-Analyse darauf hin, dass a Ein hoher GRP75-Spiegel zeigte eine schlechte Prognose, einschließlich, aber nicht beschränkt auf GC, was in hohem Maße mit unserer Forschung übereinstimmte.Alle oben genannten Ergebnisse bestätigten, dass die Ausrichtung auf GRP75 möglich war Es wird erwartet, dass es ein neuer Ansatz wird, um die Cisplatin-Resistenz umzukehren und die Prognose von GC-Patienten zu verbessern.

Unter physiologischen Bedingungen waren die Zellen unvermeidlich ROS durch externe Faktoren und den intrazellulären aeroben Metabolismus ausgesetzt. Als zweischneidiges Schwert seien geeignete ROS wichtige Signalmoleküle, die die normale Funktion von Zellen regulieren, während übermäßige ROS zu Apoptose führten. Daher existierte im Körper ein präzises antioxidatives Regulationssystem, um das Redoxgleichgewicht und apoptotische Vorgänge aufrechtzuerhalten 20. Im Gegensatz zu physiologischen Bedingungen waren die ROS-Spiegel von Tumoren jedoch im Allgemeinen signifikant höher als bei normalen Kontrollen des gleichen Gewebeursprungs, was die Existenz einer Besonderheit bestimmte Antioxidans-System in Tumorzellen, insbesondere bei arzneimittelresistenten Tumorzellen27-29. Unsere Ergebnisse bestätigten, dass SGC7901CR-Zellen im Vergleich zu SGC7901-Zellen ein relativ höheres ROS-Niveau aufwiesen und dass GRP75 die Kapazitäten der Antioxidation/Apoptose erhöhte. Tumorzellen hatten eine lange Geschichte von Stoffwechselanomalien. Bereits in den 1930er Jahren entdeckte Otto Warburg, dass Tumorzellen die Glykolyse bevorzugen. Selbst unter Bedingungen mit ausreichend Sauerstoff hielten die Tumorzellen immer noch hohe Glykolyseraten für die ATP-Erzeugung aufrecht. Dieses abnormale Stoffwechselmuster wurde als "Warburg-Effekt"3031 bezeichnet. Die durch den Warburg-Effekt verursachten metabolischen Veränderungen wurden kürzlich als metabolische Reprogrammierung bezeichnet, und Studien dieser Veränderungen lieferten ein tieferes Verständnis des GC-Zellstoffwechsels. Es wurde gezeigt, dass GC-Zellen und normale Zellen metabolische Unterschiede nicht nur im Glukosestoffwechsel, sondern auch im Stoffwechsel von Lipiden und Aminosäuren aufwiesen³2-35. In dieser Forschung fanden wir heraus, dass Veränderungen im Glukosestoffwechsel einer der Kernpunkte waren Verbindungen, die das Zellwachstum aufrechterhalten, was schließlich zu einer GC-Cisplatin-Resistenz führt.

Wie bereits erwähnt, waren klassische Onkogene und Signalwege wie PI3K/AKT, HIF-la und c-myc direkt oder indirekt an der metabolischen Reprogrammierung beteiligt. Die Aktivierung des PI3K/AKT-Signalwegs in Tumorzellen verstärkte viele Stoffwechselaktivitäten. Erstens ermöglicht es den Zellen die Aufnahme von Glukose, Aminosäuren und anderen Nährstoffen. Zweitens erhöhte AKT die Glykolyse und Laktatproduktion über seine Wirkungen auf die Genexpression und Enzymaktivität und war ausreichend, um einen Warburg-Effekt in Krebszellen zu induzieren. Drittens verstärkte die Aktivierung dieses Weges die Biosynthese von Makromolekülen und stimulierte die Expression von lipogenen Genen und die Lipidsynthese'7. Darüber hinaus hemmten GRP75--aktiviertes AKT und die durch extrazelluläre Signale regulierten Proteinkinasen 1 und 2 Konformationsänderungen und Apoptose von Bax 8. Tumorzellen, die an Hypoxie angepasst waren, beinhalteten eine metabolische Reprogrammierung über hochregulierte HIF-la-Zielgene, um die Glukoseaufnahme, Glykolyse, Produktion und Sekretion von Milchsäure, Glykogenspeicherung, Glutaminkatabolismus³ und fördern die Akkumulation von Triglyceriden in Lipidtröpfchen³. In jüngerer Zeit war klar geworden, dass GRP75 spezifisch an HIF-la binden und die damit verbundene äußere Mitochondrienmembran angreifen kann VDAC1 und HK2, die die Apoptose verhinderten. C-myc könnte die metabolische Reprogrammierung auf verschiedene Weise vermitteln, und die c-myc-vermittelte metabolische Reprogrammierung wurde größtenteils durch Beeinflussung der Mitochondrien erreicht. Einerseits förderte c-myc auch die Glykolyse, indem es die Expression von mit der Glykolyse verwandten Enzymen, einschließlich LDHA, HK2 und PDK11938, direkt regulierte. Andererseits förderten c-myc-aktivierte Enzyme, die am Glutaminstoffwechsel beteiligt sind, die Verwendung von Glutamin durch Mitochondrien in Tumorzellen. Dieser Effekt wird „Glutaminolyse“ genannt. Darüber hinaus reduzierte die GRP75--Überexpression Cyclin-B1 und reguliert Cyclin-D1 und c-myc hoch, um das Wachstum von Eierstockkrebszellen zu fördern*. Basierend auf unseren aktuellen Ergebnissen lieferten wir ein neues Verständnis der GC-Cisplatin-Resistenz durch GRP75 als potenziell wichtiges Bindeglied in der Regulation von Netzwerken zur metabolischen Reprogrammierung von Tumoren.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die Überexpression von GRP75 das Überleben/Wachstum in GC-Zellen fördern kann, indem sie Antioxidation/Apoptose und metabolische Reprogrammierungsnetzwerke reguliert und dadurch eine Cisplatin-Resistenz induziert

Materialen und Methoden

Zellen, Reagenzien und Kulturbedingungen

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99,0 Prozent Reinheit), wurde von Sigma-Aldrich (Shanghai, China) gekauft. Die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium (Gibco, Grand Island, NY, USA), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin (Gibco) kultiviert und inkubiert in 5 Prozent CO2 bei 37 Grad. Zur Aufrechterhaltung des Cisplatin-Resistenz-Phänotyps wurden SGC7901CR-Zellen in einem Medium inkubiert, das Cisplatin (5 μM) enthielt.

Xenotransplantate und Behandlungen

Diese Studie wurde vom Nanjing Medical University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt, und die Tiere wurden human und im Hinblick auf die Linderung von Leiden behandelt. Die BALB/c-Nacktmäuse wurden vom SLRC Laboratory Animal Center (Shanghai, China) erhalten und wie zuvor beschrieben konventionell gehalten*1. Für die Xenograft-Studie wurden 2 × 10 Grad SGC7901CK-Zellen in 100 μl Matrigel subkutan in die Flanken der Mäuse für 5 Wochen injiziert. Um die Wirkungen von GRP75 auf die Cisplatin-Resistenz von GC zu bestimmen, führten wir den intratumoralen und intraperitonealen Injektionstest durch. Kurz gesagt, die Mäuse wurden zufällig in 4 Gruppen eingeteilt (5 Mäuse pro Gruppe): (1) MOCK, (2) GRP75KD, (3) MOCK – Cisplatin und (4) GRP75 KD – Cisplatin. 100 ul siRNA (si-Con oder si-GRP75, 100 nM) wurden alle 3 Tage intratumoral injiziert. Den Gruppen, die einer Therapie mit Cisplatin (5 mg/kg) unterzogen wurden, wurden dreimal pro Woche intraperitoneale Injektionen verabreicht, und die anderen Gruppen wurden mit einem gleichen Volumen Kochsalzlösung perfundiert. Die Tumore wurden jede Woche gemessen und ihre Volumina wurden nach folgender Formel berechnet: V=Y (Breite 2 Länge). Nach 5 Wochen wurden die Mäuse getötet und Tumorgewebe zur weiteren Untersuchung entnommen.

Patienten und Gewebeproben

Diese Studie wurde von der Medizinischen Ethikkommission des Second Affiliated Hospital der Nanjing Medical University und des Affiliated Changzhou No. 2 Hospital der Nanjing Medical University genehmigt und die schriftliche Einverständniserklärung der Teilnehmer wurde von jedem Patienten eingeholt. Die klinisch-pathologischen Daten wurden in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. Das Gewebe-Mikroarray wurde von Zhuoli Biotechnology Co. Ltd. (Shanghai, China) wie zuvor beschrieben konstruiert*

Zelltransfektion

Für die Transfektion wurden verschlüsselte und pcDNA-3.1-GRP75-Flag von General Biotech (Shanghai, China) synthetisiert; während siRNAs in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt waren. Die Zellen wurden mittels Lipofectamin 3000-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers transient transfiziert. Kurz gesagt, Zellen wurden auf Platten mit 6- Vertiefungen in einer Dichte von 1 × 10 Grad Zellen in RPMI 1640-Medium, das 10 % FBS ohne Antibiotika enthielt, plattiert. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Zellen vorübergehend mit 5 ng/ml Scrambled oder GRP75-Flag oder 20 nM si-Con oder si-GRP75 für 12 h transfiziert. Nach der Transfektion wurden die Zellen weitere 24 h in frischem Medium, ergänzt mit 10 Prozent FBS, kultiviert, bevor sie für andere Experimente verwendet wurden.

Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Die verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle S3 aufgeführt. Die Isolierung von Gesamt-RNA, die Transkription von RNA zu cDNA und die Durchführung von qRT-PCR mit dem Applied Biosystems 7300HT-Gerät entsprachen alle unserer vorherigen Studie 2. Das -Aktin wurde amplifiziert, um die cDNA-Integrität sicherzustellen und die Expression zu normalisieren. Vielfache Änderungen in der Expression jedes Gens wurden durch eine Methode des vergleichenden Schwellenwertzyklus (Ct) unter Verwendung der Formel 2-(4ACt) berechnet.

Dieser Artikel ist aus Dai et al. Cell Death Discovery (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w