Nach Feststellung der Tatsache, dass die senolytische Wirkung von Ouabain vom Zelltyp abhängig ist

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Eine durch Ouabain verursachte Störung der K*/Nat-Homöostase führt zu unterschiedlichen physiologischen Reaktionen bei Kontroll- und seneszenten A549- und END-MSCs

Nachdem wir festgestellt hatten, dass die senolytische Wirkung von Ouabain zelltypabhängig ist, versuchten wir weiter aufzuklären, was den offenbarten Unterschieden in den Reaktionen von hMSCs und A549 zugrunde liegen könnte. Zu diesem Zweck analysierten wir die durch oxidativen Stress induzierte Seneszenz von END-MSCs und Etoposid -induzierte Seneszenz von A549, genauer gesagt.Cynomorium-VorteileDer hauptsächliche molekulare Wirkungsmechanismus verschiedener Herzglykoside ist die Hemmung von Nat/K plus -ATPase [44]. Nat/K plus -ATPase ist ein Plasmamembranenzym, das Natrium aus der Zelle pumpt, während Kalium gegen Konzentrationsgradienten in die Zelle gepumpt wird und somit an der Aufrechterhaltung der K plus- und Na plus-Homöostase beteiligt. Daher fragten wir, ob es Unterschiede in der basalen und Ouabain-induzierten Ionenhomöostase zwischen Kontroll- und seneszenten Zellen zweier Typen geben könnte.

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Die durch Ouabain verursachte Störung der K plus - und Na plus -Homöostase sollte letztendlich zum Abbau des Plasmamembranpotentials führen. Daher haben wir außerdem die spezifische Fluoreszenzsonde DiBAC4(3) verwendet, um das Transmembranpotential von nicht erregbaren Zellen zu messen. Eine erhöhte Fluoreszenz dieses Farbstoffs spiegelt die Membrandepolarisation wider.WüstenhyazintheIn jedem getesteten Zelltyp induzierte Ouabain eine vorhersagbare Membrandepolarisation, was ein ionisches Ungleichgewicht bestätigte (Fig. 10a). Bemerkenswerterweise beobachteten wir vergleichbare Niveaus der Membrandepolarisation in Kontroll- und seneszenten END-MSCs, während seneszente A549 im Vergleich zu Kontroll-A549-Zellen durch eine signifikant stärker depolarisierte Membran gekennzeichnet waren.

Andere wichtige Folgen der ionischen Deregulierung sind Änderungen des mitochondrialen Membranpotentials (MP).

Daher haben wir unter Verwendung der fluoreszierenden Sonde JC-1 MMP in Kontroll- und seneszenten Zellen nach Ouabain-Behandlung bewertet. Es sollte besonders hervorgehoben werden, dass seneszente Zellen häufig durch verringertes MMP gekennzeichnet sind, was auf eine Fehlfunktion der Mitochondrien, Veränderungen im Energiestoffwechsel und erhöhte intrazelluläre reaktive Sauerstoffspezies zurückzuführen ist[45]. Wie erwartet war MMP in seneszenten END-MSCs und A549-Zellen niedriger als in den Kontrollzellen,

obwohl diese Abnahme die Lebensfähigkeit von seneszenten Zellen nicht beeinflusste (Fig. 1d, 6a, 10b).Flavonoidextraktionsmethode pdfÄhnlich wie die obigen Ergebnisse induzierte Ouabain eine ausgeprägte MMP-Depolarisation in seneszenten A549 im Vergleich zu ihren proliferierenden Gegenstücken, während die Wirkung auf MMP von Kontroll- und seneszenten END-MSCs minimal war ( 10b ). Wenn wir die in diesem Teil beschriebenen Ergebnisse zusammenfassen, können wir schlussfolgern, dass die Blockierung von Na plus /K plus -ATPase durch Ouabain zu einer dramatischen Depolarisation der Plasmamembran und einem Abfall von MMP im Fall von seneszentem A549 führt, im Gegensatz zu seneszentem END-MSCS.

Veränderungen in den Mechanismen des K plus-Imports vermitteln die Ouabain-Resistenz alternder END-MSCs

Um Mechanismen aufzuklären, die Ouabain-induzierte Änderungen der Membranpolarisation und MMP zwischen seneszenten A549 und END-MSCs vermitteln, haben wir ferner einen fortschrittlichen bioinformatischen Ansatz angewendet. Ziel der Analyse war es, mögliche transkriptomische Merkmale aufzudecken, die eine zelltypabhängige Ouabain-Resistenz oder -Sensitivität seneszenter Zellen vermitteln. Mit anderen Worten, wir stellten die Frage: Wie unterscheidet sich die Seneszenz von END-MSCs (Oubain-resistente Zellen) von der Seneszenz von A549 (Oubain-sensitive Zellen)? Um diese Frage zu beantworten, haben wir drei unabhängige Datensätze zur RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) verwendet. Die erste war die RNA-Seq-Analyse

Abb. 6 Validierung des Etoposid-induzierten A549-Seneszenzmodells. Seneszente A549-Zellen zeigen einen Proliferationsverlust, b erwerben eine erhöhte Zellgröße, c ein erhöhtes Autofluoreszenzniveau und d eine SA-b-Gal-Aktivität im Vergleich zu den Kontrollzellen. e Phosphorylierungsniveaus von p53 und Rb und Expressionsniveaus von p21 und HMGBI-Proteinen in Kontroll- und seneszentem A549. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung. Für mehrere Gruppen wurden Vergleiche bei einer einfachen ANOVA durchgeführt, n=3, ns nicht signifikant,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c,="" and="" d="" welch's="" test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001.>FlavonoideMaßstabsbalken für Bilder sind 500 μm. GAPDH wurde als Ladekontrolle der von uns durchgeführten Kontroll- und Seneszenz-END-MSCs verwendet. Der zweite war der Datensatz für die Kontrolle und den seneszenten A549, der von GEO heruntergeladen wurde [43]. Bemerkenswerterweise stimmten die Seneszenz-induzierenden Bedingungen mit denen überein, die in der vorliegenden Studie und in den Pilotstudien zur durch Herzglykoside induzierten Senolyse angewendet wurden. Und der dritte Datensatz war für Kontroll- und Seneszenz-IMR-90, der direkt aus der Studie zu Herzglykosiden als senolytische Verbindungen erhalten wurde [25]. Wichtig ist, dass sich IMR-90 als anfällig für Ouabain-induzierte Analyse erwiesen hat. Es sollte beachtet werden, dass der Vergleich von nur zwei Datensätzen, die für END-MSCs und A549 relevant sind, letztendlich zu falschen Ergebnissen führen würde, da in einer solchen Analyse der gesuchte Unterschied zwischen dem Seneszenzprozess in END-MSCs und A549 nicht von den durch vermittelten Variationen zu unterscheiden wäre diverse technische Chargeneffekte (zB Typ der Sequenziermaschine, Bedingungen der Probendurchläufe). Um Batch-Effekte zu minimieren, haben wir einen Datensatz für Ouabain-resistente Zellen (END-MSCs) und zwei für Ouabain-sensitive Zellen (A549, IMR-90) verglichen. Um die Relevanz der weiteren vergleichenden Analyse zu validieren, führten wir eine Hauptkomponentenanalyse für die Untergruppe von Genen im Zusammenhang mit dem GO-Begriff „zelluläre Seneszenz“ (GO 0090398) basierend auf dem zusammenfassenden Datensatz durch, der Proben aus allen drei beschriebenen Experimenten enthält. Tatsächlich wurden die Proben für jeden Zelltyp in zwei getrennte Gruppen geclustert – die Kontroll- und die Seneszenz-Proben (Abb. 10d).

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Um eine Analyse von differentiell exprimierten Genen (DEGs) während der Seneszenz von Ouabain-resistenten und -sensitiven Zellen durchzuführen, haben wir das statistische Modell erstellt, das zwei Prädiktoren und ihre Interaktion zusammenfasst. Die schematische Darstellung der Analyse ist in Abb. 10c dargestellt. Kurz gesagt unterteilte der erste Prädiktor im Modell alle Proben nach Kontroll- und Seneszenz-Untergruppen, der zweite – nach Ouabain-Resistenz oder Ouabain-Empfindlichkeit, und die letzte Komponente im Modell spiegelte die wider Interaktion beider Prädiktoren. Das Ergebnis des differentiellen Expressionstests für die letzte Variable ist in der Ergänzungstabelle 1 dargestellt.

Anschließend führten wir eine Genset-Anreicherungsanalyse (GSEA) in Genontologie (GO) -Begriffen für biologische Prozesse (BP) durch (Ergänzungstabelle 2). Bemerkenswerterweise fanden wir unter den signifikant angereicherten Prozessen, dass der „Kaliumionenimport“ und die „positive Regulation des Kationen-Transmembrantransports“ während der Seneszenz von Ouabain-resistenten END-MSCs im Vergleich zur Seneszenz von Ouabain-empfindlichen Zellen hochreguliert werden (Abb. 10e ). Die Listen der Kernanreicherungsgene im Zusammenhang mit diesen Prozessen umfassten KCNJ2, KCNJ14, KCNJ8, SLC12A7, SLC12A8, WNK4, die in seneszenten END-MSCs signifikant hochreguliert waren ( 10f ). Die von KCNJ-Genen codierten Proteine ​​sind Kaliumkanäle vom Typ Einwärtsgleichrichter, die eine größere Tendenz haben, Kalium in eine Zelle statt aus einer Zelle fließen zu lassen.Hesperidin verwendetSLC12, eine Familie von Chloridtransportern, die von Kationen abhängig sind. Das WNK4-Gen kodiert für Serin/Threonin-Kinase, die als Aktivator von Natrium-gekoppelten Chlorid-Cotransportern und Inhibitor von Kalium-gekoppelten Chlorid-Cotransportern wirkt. Zusammen erlaubten diese Befunde den Hinweis, dass seneszente END-MSCs erschöpfte intrazelluläre K+-Spiegel effektiver wiederherstellen können als seneszente A549-Zellen und somit mit Ouabain-induziertem Ionenungleichgewicht umgehen können.

Seneszente END-MSCs werden erhöht angezeigt

Apoptoseresistenz im Vergleich zu den Kontrollen, während seneszentes A549 dies nicht tut

Die Rolle von intrazellulärem K plus in bei der Regulation des Zelltods ist gut etabliert [46]. Aufgedeckte Unterschiede zwischen seneszenten END-MSCs und A549-Zellen in der Fähigkeit, die intrazelluläre K-Plus-Homöostase aufrechtzuerhalten, veranlassten uns, die während der Seneszenz erworbene Gesamtstressresistenz beider Zelltypen zu vergleichen. Es ist bekannt, dass exogene Belastungen mit einer Störung der Ionenhomöostase einhergehen, was zu einem raschen Austausch verschiedener Ionen, einschließlich K+, zwischen der Zelle und ihrer Umgebung führt [46]. Die Ergebnisse von Stresseinflüssen hängen weitgehend von der Fähigkeit der Zellen ab, das angemessene intrazelluläre Ionengleichgewicht wiederherzustellen. Wie in Abb. 10e, f gezeigt, wurde die Seneszenz von END-MSCs von der Hochregulierung des K plus-Imports begleitet, was darauf hindeutet, dass während

Abb. 10 Ouabain-resistente seneszente END-MSCs sind in der Lage, eine durch Ouabain verursachte Störung der K plus /Nat-Homöostase über einen effektiven K plus-Import wiederherzustellen, während Ouabain-sensitive seneszente Zellen diese Fähigkeit nicht haben. a Bestimmung des Membranpotentials von Kontroll- und seneszenten END-MSCs und A549-Zellen vor und 24 h nach der Ouabain-Behandlung unter Verwendung der fluoreszierenden Sonde DiBAC4(3). b Bewertung des mitochondrialen Membranpotentials von Kontroll- und seneszenten END-MSCs und A549-Zellen vor und 24 h nach der Ouabain-Behandlung unter Verwendung der fluoreszierenden Sonde JC-1. c Design der vergleichenden bioinformatischen Analyse von drei unabhängigen RNA-Seq-Datensätzen. d Hauptkomponentenanalyse für die Untergruppe von Genen, die mit dem GO-Begriff „zelluläre Seneszenz“ (GO 0090398) verwandt sind, basierend auf den kombinierten Daten aus drei unabhängigen RNA-Seq-Datensätzen . e GSEA-Ergebnisse für die differentiell exprimierten Gene zwischen den Zellen, die gegenüber Ouabain-vermittelter Analyse resistent sind (END-MSCs) und solchen, die gegenüber Ouabain-vermittelter Analyse empfindlich sind (A549 und IMR-90) für die „Positive Regulation des Kationentransmembrantransports“ und 'Kaliumionen importieren biologische Prozesse. f Heatmap, die die Kernanreicherungsgene für die biologischen Prozesse „Positive Regulierung des transmembranen Kationentransports“ und „Kaliumionenimport“ widerspiegelt. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung. Die statistische Signifikanz wurde durch den Student's t-Test bewertet: ns nicht signifikant,*S<><><>

Seneszenzentwicklung END-MSCs verbessern ihre Fähigkeit, K+-Spiegel wiederherzustellen. Interessanterweise waren wir nicht in der Lage, eine ähnliche Tendenz für die A549-Seneszenz aufzuzeigen, daher schien A549 während der Seneszenzprogression keine spezifischen Merkmale im Zusammenhang mit dem K*-Import zu erwerben. Gemäß den literarischen Daten begünstigen die stressinduzierte Abnahme des intrazellulären K* und die Unfähigkeit, sein Niveau wiederherzustellen, die Aktivierung von Caspasen und Nukleasen und werden daher als pro-apoptotischer Faktor vorgeschlagen [46].

In Übereinstimmung mit diesem Vorschlag zeigten wir unter Verwendung einer bioinformatischen Analyse der obigen RNA-seq-Datensätze eine signifikante Herunterregulierung der Prozesse im Zusammenhang mit Apoptose während der Seneszenz von END-MSCs im Vergleich zu A549 und IMR-90 (Abb. lla). . Darüber hinaus ist die Seneszenz von A549 und IMR-90 durch eine signifikante Hochregulierung von pro-apoptotischen Genen gekennzeichnet, einschließlich BAD, BAX, BOK, BAK-1 und NOXA (Abb. 11b). Diese Daten zeigen, dass END-MSCs während der Seneszenz einen Apoptose-resistenten Phänotyp erwerben, während seneszente IMR-90 und A549 apoptoseanfällig wurden (Abb. 11b). Um diese Beobachtung zu untermauern, analysierten wir zusätzlich den Microarray-Datensatz für Kontroll- und replikative seneszente AD-MSCs, die auch die Ouabain-Resistenz während der Seneszenz bewahrten, wie oben angegeben (Abb. 4g). Bei der Analyse der Expressionsniveaus der Apoptose-bezogenen Gene beobachteten wir einen ausgeprägten Apoptose-resistenten Phänotyp von seneszenten AD-MSCs, ähnlich dem von seneszenten END-MSCs (ergänzende Abb. S8a, b).

Um die Ergebnisse der Transkriptomanalyse zu überprüfen, haben wir die Expressionsniveaus von Genen im Zusammenhang mit Apoptose und K plus-Import in beiden Arten von seneszenten Zellen – END-MSCs und A549 – durch RT-PCR geschätzt (ergänzende Abb. S9). Zusätzlich analysierten wir die Expression derselben Genliste unter Verwendung anderer Ouabain-resistenter und Ouabain-empfindlicher Zellmodelle, Doxorubicin-behandelter seneszenter DP-MSCs bzw. Etoposid-behandelter seneszenter SK-Help (ergänzende Abb. S9). Wie in der ergänzenden Abb. S9 gezeigt, zeigten beide Arten von Ouabain-resistenten Zellen – seneszente END-MSCs und DP-MSCs – ähnliche Genexpressionsmuster, insbesondere KCNJ2, SLC12A und WNK4, die an der K-Plus-Wiederherstellung beteiligt waren, wurden hochreguliert, während proapoptotisches BAX herunterreguliert wurde Das antiapoptotische MCL-I wurde hochreguliert. Darüber hinaus unterschied sich das Expressionsmuster derselben Gene von denen, die für Ouabain-sensitives A549 und SK-Hep1 beobachtet wurden. Diese Ergebnisse bestätigen unsere transkriptomischen Daten und untermauern die Schlussfolgerung hinsichtlich unterschiedlicher Apoptoseprofile, die während der Seneszenz verschiedener Zelltypen erworben wurden.

Als nächstes testeten wir, ob die beobachteten Unterschiede im Apoptosehintergrund während der Seneszenz von END-MSCs und A549 einen Einfluss auf die allgemeine Stressresistenz von seneszenten Zellen haben könnten. Dazu haben wir die Zelllebensfähigkeit bei oxidativem Stress und Staurosporin, das typischerweise zur Induktion von Apoptose angewendet wird, bewertet. Tatsächlich erwiesen sich seneszente END-MSCs als signifikant widerstandsfähiger gegenüber beiden Belastungen im Vergleich zu ihren Kontrollgegenstücken (Abb. 1lc). Im Gegensatz dazu zeigten A549-Zellen eine umgekehrte Situation, da seneszente Zellen eine Tendenz zeigten, empfindlicher gegenüber stressinduziertem Zelltod zu sein ( 11d ). Diese Beobachtung verschiebt das bestehende Paradigma, dass eine erhöhte Todesresistenz ein gemeinsames Merkmal aller Arten von seneszenten Zellen ist, was ihre offensichtliche Zellspezifität demonstriert.

Basierend auf den obigen Daten nahmen wir an, dass die Verringerung der Apoptose-"Abwehr" von seneszenten END-MSCs günstige Bedingungen für weitere Analysen schaffen sollte. In dieser Hinsicht konzentrierten wir uns auf ein bekanntes antiapoptotisches Mitglied der Proteine ​​der BCL-2-Familie – MCL-1, da seine Expression in Apoptose-resistenten seneszenten END-MSCs hochreguliert war (Abb. 1lb und ergänzende Abb S9a). Zu diesem Zweck haben wir Kontroll- und seneszente END-MSCs mit A-1210477, dem spezifischen MCL-1-Inhibitor, vorbehandelt und dann Herzglykoside angewendet, um die Analyse zu induzieren. Bemerkenswerterweise hatte A-1210477 selbst keine Wirkung auf die Proliferationskapazität von Kontrollzellen und auf die Lebensfähigkeit von seneszenten Zellen, wie in den Wachstumskurven angegeben (Fig. 1le). Die anschließende Gabe von Herzglykosiden führte zu einer Abnahme der Anzahl lebensfähiger Zellen, jedoch war der Effekt bei seneszenten ESCs ausgeprägter (Abb. 11f). Daher prädisponiert die Hemmung von MCL-1 mit A-1210477 seneszente ESCs für den Ouabain-induzierten Tod, was auf eine Analyse hinweist. Der letztere Beweis dafür, dass die während der Seneszenz von END-MSCs erworbene Apoptoseresistenz eine intrinsische Barriere für eine effektive Analyse darstellt, die durch Herzglykoside ausgelöst wird.

Diskussion

Im Rahmen der vorliegenden Studie haben wir die senolytischen Wirkungen von Herzglykosiden, nämlich Ouabain und Bufalin, auf hMSCs getestet. Beide Verbindungen haben kürzlich eine selektive zytotoxische Wirkung auf seneszente Zellen (Onkogen-/Therapie-induzierte Seneszenzmodelle) unterschiedlichen Ursprungs, einschließlich Primärzellen IMR-90,HUVEC, ARPE-19,T/ C-28 und Krebszellen SK-Help,A549,SK-Mel-5,MCF7,HCT116, HaCat,H1299,U373-MG,H1755[25,26].Unerwarteterweise haben wir konnten keine präferenziellen zytotoxischen Wirkungen weder von Ouabain noch von Bufalin auf seneszente END-MSCs im Vergleich zu den Kontrollen zeigen. Wichtig ist, dass das Fehlen einer Analyse unter Verwendung von hMSCs, die aus Fettgewebe, Zahnpulpa und Warton-Gelee gewonnen wurden, und verschiedenen Seneszenzmodellen verifiziert wurde. Letzteres führte uns zu der Vermutung, dass die Resistenz gegenüber Herzglykosid-induzierter Analyse das gemeinsame Merkmal von hMSCs sein könnte. Gleichzeitig konnten wir Apoptose bevorzugt in seneszentem A549 und SK-Help induzieren und so die in den relevanten Artikeln beschriebene senolytische Wirkung von Herzglykosiden reproduzieren [25,26]. Mit verfügbaren Zellen, die gegenüber Ouabain-induzierter Analyse resistent und sensitiv sind (Ouabain-resistent/Ouabain-sensitiv), haben wir versucht, die grundlegenden Ursachen aufzuklären, die diesem Unterschied zugrunde liegen. Der gemeinsame molekulare Mechanismus der Wirkung von Herzglykosiden ist die Bindung an die Nat/K plus -ATPase und die Blockierung ihrer Aktivität. Durch die Hydrolyse von ATP stellt dieses Enzym sicher, dass Na+ aus der Zelle gepumpt und K+ in die Zellen importiert wird und somit den physiologischen elektrochemischen Gradienten, die ionische Homöostase, den zellulären pH-Wert und das Zellvolumen aufrechterhält, die für das Überleben und Funktionieren der Zelle unerlässlich sind [47]. Daher spekulierten wir, dass die senolytische Fähigkeit von Ouabain von der Schwere des K plus /Nat-Ungleichgewichts in den behandelten Zellen abhängen könnte. In Übereinstimmung mit diesem Vorschlag zeigten wir, dass Ouabain eine ausgeprägtere Depolarisation der Plasmamembran und einen Abfall von MMP in Ouabain-empfindlichem seneszentem A549 induzierte.

Im Allgemeinen wurde gezeigt, dass die Wirkung von Nat/K plus -ATPase-Hemmung auf das Zellüberleben zelltypspezifisch ist. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Ouabain die Apoptose in Lymphozyten, Jurkat-Zellen und Hundeepithelzellen potenziert, während es trotz ähnlicher Modulation keinen Tod in Epithelzellen aus Rattenaorta, zerebralen Körnerzellen von Ratten und proximalen tubulären LLC-PK1-Lymphozyten von Schweinen herbeiführte des Kationenverhältnisses [48-54]. Einer der vorgeschlagenen Mechanismen der proapoptotischen Wirkung von Ouabain ist die Erschöpfung des intrazellulären Materials, das die apoptotische Schrumpfung, die Aktivierung von Caspasen und die Initiierung der apoptotischen Programmierung begünstigt [46, 47]. Unter Berücksichtigung eines vergleichbaren K plus -Verlusts, aber einer entgegengesetzten Wirkung auf die Todesinduktion, die für Ouabain-resistente und Ouabain-empfindliche Modelle erhalten wurde, schlugen wir die Unterschiede in den kompensatorischen Systemen von Kationen vor. Der Abfall des intrazellulären K plus -Spiegels sollte im Wesentlichen zur Aktivierung des K plus -Imports aus dem extrazellulären Raum führen, um den Mangel an diesem Kation zu kompensieren. Daher könnte die Wirksamkeit der Wiederherstellung von K plus der Prädisposition für Apoptose nach einer Behandlung mit Ouabain zugrunde liegen. Um diesen Vorschlag zu testen, haben wir eine komplexe bioinformatische Analyse angewendet, bei der Veränderungen der Transkriptomsignaturen während der Seneszenz von Ouabain-resistenten Zellen (END-MSCs) und Ouabain-empfindlichen Zellen (A549 und IMR-90) verglichen wurden. Wir beobachteten eine starke Hochregulierung der Prozesse im Zusammenhang mit dem Kaliumionenimport während der Seneszenz von END-MSCs, während diese Prozesse während der Seneszenz von Oua-Bain-sensitivem A549 und IMR-90 unverändert blieben oder sogar abnahmen. Basierend darauf können wir spekulieren, dass seneszente END-MSCs effektiv mit der Ouabain-induzierten K+-Verarmung über aktive Kationen-Importsysteme fertig werden können, was eine Apoptose-Induktion verhindert. Im Gegensatz dazu scheinen Our-Bain-empfindliches seneszentes A549 und IMR-90 weniger in der Lage zu sein, den K-Plus-Verlust zu überwinden, und sind daher anfällig für Apoptose. Für diese Annahme induzierte Ouabain eine signifikantere Plasma- und Mitochondrienmembran-Depolarisation seneszente A549-Zellen, die ein ausgeprägtes ionisches Ungleichgewicht zeigen, das typisch für sterbende Zellen ist.

Anstatt das einzigartige Merkmal der Ouabain-induzierten Apoptose zu sein, ist ein Abfall des intrazellulären K plus -Gehalts wahrscheinlich das gemeinsame Merkmal des apoptotischen Todes, der durch verschiedene Stressfaktoren ausgelöst wird, z. B. Staurosporinbehandlung und oxidativer Stress [46]. Dementsprechend sollte die verringerte Fähigkeit von seneszentem A549, zytoplasmatisches K plus wiederherzustellen, letztendlich zu einer Abnahme der gesamten Stressresistenz führen. Diese Vorstellung widerspricht jedoch der modernen Definition der Zellseneszenz, die besagt, dass seneszente Zellen sehr resistent gegen Apoptose sind [16]. Besonders hervorzuheben ist, dass eine verstärkte Apoptoseresistenz die Grundlage für die Analytikentwicklung bildete [16, 17].

Die erste Erwähnung der erhöhten Stressresistenz von seneszenten Zellen stammt aus dem Jahr 1995, als sich herausstellte, dass replikative seneszente Fibroblasten widerstandsfähiger gegen Serumentzug waren als die Kontrollzellen [55]. Auf diese erste Studie folgte eine begrenzte Anzahl von Untersuchungen, die darauf hindeuteten, dass seneszente Zellen widerstandsfähiger gegen UV-Licht, Staurosporin, Thapsigargin und andere Belastungen sind als ihre proliferierenden Gegenstücke [56, 57]. Wir sind jedoch bei weitem nicht die Ersten, die die Frage nach der erhöhten Apoptoseresistenz als allgemeines Merkmal seneszenter Zellen aufwerfen. So wurde in der 2003 veröffentlichten Übersichtsarbeit berichtet, dass "... Apoptoseresistenz kein allgemeines Merkmal seneszenter Zellen ist, die je nach Zelltyp und apoptotischen Stimuli auch apoptotisch anfällig sein können ..."[58]. Tatsächlich zeigten mehrere Daten eine höhere Empfindlichkeit von seneszenten Zellen gegenüber stressinduzierter Apoptose als von Kontrollzellen [59-61]. Zum Beispiel waren seneszente HUVECs im Vergleich zu Kontrollzellen anfälliger für Apoptose, die durch oxidiertes LDL oder TNFa induziert wurde[61]. Trotz der offensichtlichen Kontroverse tauchte der letzte Zweifel im Jahr 2015 auf und klang wie folgt: "Es scheint zweifelhaft, dass globale Apoptoseresistenz ein allgemeines Merkmal von Seneszenzzellen ist"[62]. Im selben Jahr wurde die erste Studie veröffentlicht, die Analysen aufdeckte [16 ]. Innerhalb dieser Studie hoben die Autoren die erhöhte Expression überlebensfördernder Gennetzwerke in seneszenten Zellen hervor, die zu ihrer erhöhten Resistenz gegen Apoptose beigetragen haben. Daher stellten Senolytika zunächst die Medikamente dar, die auf Proteine ​​abzielen, die seneszente Zellen vor Apoptose schützen. Die Entdeckung der Analytik zusammen mit den beeindruckenden Ergebnissen der Entfernung alternder Zellen mit transgenen INK-ATTAC-Mäusen löste eine Flut von Studien aus, die nach neuen Verbindungen mit hämolytischer Aktivität suchten [16-26,63]. In den letzten zwei Jahren wurden zahlreiche Rezensionen zu Analytics veröffentlicht [13-15,64-66]. Seit 2015 war die erhöhte Apoptoseresistenz seneszenter Zellen jedoch kein Thema mehr, obwohl sie in diesen Studien tatsächlich nicht getestet wurde.

Interessanterweise stellten wir beim Vergleich der Transkriptomsignaturen von Ouabain-resistenten Zellen (END-MSCs) und Ouabain-sensitiven Zellen (A549 und IMR-90) fest, dass nur die Seneszenz von END-MSCs mit dem Erwerb von merklich einherging antiapoptotisches Profil. Im Gegensatz dazu ist die Seneszenz von A549 und IMR-90 durch eine signifikante Hochregulierung von pro-apoptotischen Genen gekennzeichnet, einschließlich BAD, BAX, BOK, BAK-1, NOXA und so weiter. Wichtig ist, dass diese Ergebnisse unter Verwendung anderer Ouabatin-resistenter Zellen DP-MSCs erweitert wurden. Einerseits liefern diese Ergebnisse eine zusätzliche molekulare Erklärung für das Fehlen einer Ouabain-induzierten Analyse in hMSCs und zeigen andererseits deutlich, dass A459 und IMR-90 während der Seneszenz für Apoptose prädisponiert werden. Bemerkenswerterweise stimmten unsere Daten zu transkriptomischen Veränderungen in Genen im Zusammenhang mit Apoptose bei seneszenter IMR-90 mit den Ergebnissen überein, die in dem von Guerrero et al. {19}}-Zellen stammen aus dieser Studie [25]. Die genaue Analyse der in dieser Studie bereitgestellten Heatmap ergab eine Hochregulierung von BAX, BAD, BAD, BAKI und NOXA in seneszenten IMR-90 im Vergleich zu den Kontrollzellen. Darüber hinaus haben Baar et al. offenbarten auch eine "unerwartete" Hochregulierung von proapoptotischen und Herunterregulierung von antiapoptotischen Genen in seneszenten IMR-90, wobei erwähnt wurde, dass seneszente IMR-90 vorbereitet werden sollten, um Apoptose zu durchlaufen [21].

Um unsere Beobachtung zu untermauern, verglichen wir die Resistenz von Kontroll- und seneszenten END-MSCs und A459 mit den häufigsten Apoptose-induzierenden Stimuli – oxidativem Stress und Staurosporin. Nach den Ergebnissen unserer bioinformatischen Analyse erwiesen sich seneszente END-MSCs als weitaus stressresistenter als Kontrollzellen. Gleichzeitig zeigte seneszentes A549 die entgegengesetzte Reaktion, da es für beide Arten von Stressreizen etwas anfälliger war als Kontrollzellen. Daher könnte die senolytische Wirkung von Herzglykosiden, zumindest für A549, durch die Prädisposition seneszenter Zellen dieses Ursprungs für Apoptose im Vergleich zu ihren Kontrollgegenstücken vermittelt werden, während das Fehlen einer Ouabain-induzierten Senolyse in hMSCs durch die Zunahme von erklärt werden könnte allgemeine apoptotische Resistenz während der Seneszenz dieser Zellen. Darüber hinaus prädisponiert die Schwächung der "antiapoptotischen Abwehr" durch MCL-1-Hemmung END-MSCs für eine durch Herzglykoside induzierte Senolyse. Obwohl wir in der Lage waren, die gewünschte Senolyse von END-MSCs durch Hemmung von MCL-1 zu erreichen, scheint die Strategie, die Expression der konkreten antiapoptotischen Gene zu modulieren, um seneszente hMSCs für Senolyse zu prädisponieren, nicht sehr vielversprechend, da die Expression Die Dynamik der konkreten anti- oder pro-apoptotischen Gene kann sich zwischen Zellen unterschiedlicher Herkunft unterscheiden. Wir glauben, dass eher der Erwerb des sogenannten "anti-apoptotischen" Profils während der Zellalterung als Veränderungen in den konkreten anti- oder pro-apoptotischen Genen für die Ouabain-Resistenz verantwortlich sind, in dieser Hinsicht könnte die Möglichkeit, das gesamte Profil umzuschalten, möglicherweise bestehen scheinen vernünftiger.

Unsere Schlussfolgerungen, die hervorheben, dass die während der Seneszenz von hMSCs erworbene Apoptoseresistenz eine intrinsische Barriere für eine effektive Analyse darstellt, könnten weit über Herzglykoside hinaus ausgedehnt werden. Insbesondere wurde festgestellt, dass alternde hMSC gegenüber anderen senolytischen Verbindungen resistent sind. Tatsächlich haben wir durch die Analyse der vorhandenen Beweise festgestellt, dass verschiedene Verbindungen mit der angegebenen senolytischen Aktivität, einschließlich Navitoclax, Nicotinamid-Ribosid, Danazol, Geldanamycin, Ganetespib, Fisetin, BCL-XL-Inhibitoren, Quercetin, Etomoxir, Antimycin A, FOXO4-DRI ,17-DMAG erwies sich als unwirksam für die gezielte Entfernung von seneszenten menschlichen Präadipozyten (fibroblastenähnliche Vorläuferzellen aus menschlichem Fettgewebe) und hMSCs aus Knochenmark [17-19, 36, 40]. Die Daten bezüglich des Fehlens einer Analyse in hMSCs widersprechen etwas den inspirierenden Ergebnissen, die unter Verwendung von In-vivo-Mausmodellen erhalten wurden und positive Ergebnisse bei systemischer Anwendung von Analytik zeigen [37, 38]. Beispielsweise wurde gezeigt, dass die Clearance alternder Speicheldrüsen-Stammzellen mit ABT263 eine strahlentherapieinduzierte Xerostomie verhindern kann [38]. Darüber hinaus verbesserte die Entfernung von seneszenten Knochenmark-MSCs durch Quercetin die Knochenmarkbildung [37]. Wichtig ist, dass gezeigt wurde, dass seneszente MSCs von Mäusen und Ratten im Gegensatz zu hMSCs auf Analysen ansprechen. Beispielsweise entfernten Quercetin, Quercetin-Zinn-Dasatinib und ABT263 signifikant seneszente Maus-MSCs [16]. Außerdem wurde gezeigt, dass 17-DMAG seneszente bmMSCs in einem progeroiden Mausmodell stark reduziert [19]. Daher wird spekuliert, dass die in diesen Studien beschriebenen Verbesserungen in verschiedenen Organen und Systemfunktionen die Folge der gezielten Entfernung von seneszenten Mausstammzellen sind. Diese Analysen haben jedoch noch keine funktionelle Verjüngung von hMSCs gezeigt. Ein solch offensichtlicher Unterschied zwischen der Reaktionsfähigkeit von Mäusen und menschlichen MSCs auf die Analyse legt nahe, dass Verbesserungen durch senolytische Therapien möglicherweise nicht über die Spezies hinweg konserviert werden. Die für die senolytische Verbindung UBX0101 erhaltenen Ergebnisse können als gute Illustration angesehen werden, die die letzte Aussage bestätigt. Es wurde gezeigt, dass dieses Mittel seneszente Zellen in einem Mausmodell für Osteoarthritis beseitigt, was die Schmerzen signifikant reduziert und die Reparatur des beschädigten Knorpels fördert [20]. Leider konnte UBX0101 während klinischer Phase-II-Studien das Fortschreiten der Krankheit und die Schmerzen bei Patienten mit mittelschwerer schmerzhafter Osteoarthritis nicht abschwächen [67-69]. Ähnliche Bedenken werden über die senolytische Kombination Dasatinib-Querce-Zinn geäußert[68].

Zusammenfassend ergeben sich aus den erhaltenen Daten zwei wichtige Schlussfolgerungen. Ersteres zeigte, dass Herzglykoside nicht in der Lage sind, seneszente hMSC zu beseitigen. Das Fehlen einer Analyse könnte durch einen effektiven K plus zellulären Import und eine erhöhte Apoptoseresistenz in seneszenten hMSCs vermittelt werden. Letzteres ist grundlegender und zeigt, dass die Apoptoseresistenz kein allgemeines Merkmal seneszenter Zellen ist, da einige Zellen während der Seneszenz einen „Apoptose-resistenten“ Phänotyp erwerben, während andere dies nicht tun. Wichtig ist, dass nur apoptoseanfällige seneszente A549-Zellen effektiv durch Herzglykoside beseitigt werden konnten. Basierend darauf können wir spekulieren, dass die Wirksamkeit anderer senolytischer Ansätze davon abhängen könnte, ob seneszente Zellen im Vergleich zu ihren proliferierenden Gegenstücken tatsächlich apoptoseresistent sind. Obwohl „Analytik“ ein heißes Thema ist und viele inspirierende Daten veröffentlicht wurden, sollten Schlussfolgerungen hinsichtlich der Effektivität der Analyse mit Vorsicht getroffen werden, da die Heterogenität der Zellseneszenz immer noch ein „Rätsel“ bleibt.

Dieser Artikel ist ein Auszug aus Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x