Rho-GTPase-aktivierendes Protein Myosin MYO9A als neuartiges Kandidatengen für monogene fokale segmentale Glomerulosklerose identifiziert

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Qi Li1, Ashima Gulati2,6, Mathieu Lemaire3,7, Timothy Nottoli4, Allen Bale3 und Alda Tufro1,5

1 Abteilung für Pädiatrie, Sektion Nephrologie, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut, USA; 2 Abteilung für Innere Medizin, Sektion Nephrologie, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut, USA; 3 Abteilung für Genetik, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut, USA; 4 Yale Gene Editing Center, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut, USA; und 5 Abteilung für Zell- und Molekularphysiologie, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut, USA

SCHLÜSSELWÖRTER: FSGS; Myo9A-Aktin-Calmodulin-Wechselwirkung; MYO9A-Varianten; RhoA-Aktivität

Fokale segmentale Glomerulosklerose(FSGS) ist eine zum Nierenversagen führende Podozytopathie, deren molekulare Ursache häufig ungeklärt ist. Hier beschreiben wir eine seltene heterozygote MYO9A-Funktionsverlust-Mutation (p.Arg701*) als möglichen Krankheitsverursacher bei einem Geschwisterpaar mit familiärer BelastungFSGS/Proteinurie. MYO9A-Varianten mit ungewisser Signifikanz wurden durch Sequenzierung des gesamten Exoms in einer Kohorte von 94 durch Biopsie nachgewiesenen Patienten mit FSGS identifiziert. MYO9A ist ein unkonventionelles Myosin mit einer Rho-GAP-Domäne, die den Zusammenbau von Epithelzellen kontrolliert, Aktin vernetzt und bündelt und das kleine GTPase-Protein deaktiviert, das vom RHOA-Gen codiert wird. Die RhoA-Aktivität ist mit der Regulation der Aktin-Stressfaserbildung und der Actomyosin-Kontraktilität durch das Zytoskelett verbunden. Myo9A wurde in Maus- und menschlichen Podozyten in vitro und in vivo nachgewiesen. Knockin-Mäuse, die das durch Gen-Editierung erzeugte p.Arg701* MYO9A (Myo9AR701X) tragen, wurden entwickelt

Proteinurie, Podozytenauslöschung undFSGS. Nieren und Podozyten von Mäusen mit Myo9AR701X/D-Mutante zeigten eine Myo9A-Haploinsuffizienz, eine erhöhte RhoA-Aktivität, eine verringerte Myo9A-Aktin-Calmodulin-Interaktion, eine beeinträchtigte Podozyten-Anhaftung und -Migration. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Myo9A eine neuartige Komponente des Podozyten-Zytoskelettapparats ist, die die RhoA-Aktivität und Podozytenfunktion reguliert. Somit rekapitulieren Myo9AR701X/þ-Knock-in-Mäuse den Probanden-FSGS-Phänotyp, zeigen, dass p.R701X Myo9A eine FSGS-verursachende Mutation in Mäusen ist, und legen nahe, dass heterozygote MYO9A-Mutationen mit Funktionsverlust eine neue Form der menschlichen autosomal dominanten verursachen können FSGS. Daher Identifizierung von MYO9A pathogen

Varianten bei weiteren Personen mit familiärem oder sporadischem AuftretenFSGSwird benötigt, um den Genbeitrag zur Krankheit festzustellen.

Übersetzungserklärung

Diese Arbeit identifiziert eine Myosin 9A (MYO9A) Loss-of-Function-Mutation in einer Familie mit Proteinurie und fokaler segmentaler Glomerulärer Sklerose (FSGS) undMYO9A-Variantenvon ungewisser Bedeutung in einer FSGS-Kohorte. Myo9A-Knock-in-Mäuse mit p.Arg701*-Mutation entwickeln Proteinurie undFSGS, die den Phänotyp der Probanden reproduzieren. Dieses neue Tiermodell liefert neuartige mechanistische Einblicke in Myo9A-Funktionen in Podozyten und ermöglicht das Testen experimenteller Therapien für FSGS. Daten deuten darauf hin, dass heterozygote MYO9A-Mutationen mit Funktionsverlust dazu beitragen könnenFSGSPathogenese. Wir schlagen vor, MYO9A in FSGS-Gentestpanels aufzunehmen.

Fokale segmentale Glomerulosklerose(FSGS) ist eine histologische Läsion, die zu einer Nierenerkrankung im Endstadium führen kann.1 Genetische Studien zeigen, dass FSGS größtenteils eine Podozytopathie ist, da Podozyten die meisten ursächlichen mutierten Gene exprimieren.2,3 Die molekulare Ursache von FSGS ist jedoch unbekannt in über der Hälfte der Fälle.3 Daher ist die Identifizierung weiterer FSGS-verursachender Gene und ihrer molekularen Pathogenese klinisch relevant. Hier identifizieren wir Myosin 9A (MYO9A) als neues Kandidatengen für menschliches FSGS durch Whole-Exome Sequencing (WES). Das übergeordnete Ziel dieser Studie besteht darin, festzustellen, ob die bei Patienten identifizierte seltene MYO9A-Variante die Podozytenfunktion verändert und FSGS in vivo verursacht. MYO9A kodiert für ein unkonventionelles, nicht muskuläres Myosin, das zuvor nicht mit menschlichen Nierenerkrankungen in Verbindung gebracht wurde.4 MYO9A-Mutationen wurden bei Patienten mit Arthrogrypose und kongenitalem myasthenischem Syndrom berichtet.5,6 Myosine sind eine Familie molekularer Motoren, die Aktin binden, um Kraft und Bewegung zu erzeugen und mehreren Zellen zu dienen Funktionen, einschließlich Motilitäts- und Formregulation, Organellentransport und Signalübertragung.7–9 Es wurde berichtet, dass Mutationen von Myosin IIA (MYH9) und Myosin 1E (MYO1E) glomeruläre Erkrankungen und autosomal-rezessive FSGS verursachen.10–12 Klasse -9 Myosine umfassen MYO9A und MYO9B, die von Epithel- bzw. Immunzellen exprimiert werden.9,13 Ihre charakteristischen Merkmale sind ein prozessiver einzelner Kopf, der sich auf F-Aktin bewegt, und eine Schwanzdomäne des Rho-Guanosintriphosphatase-aktivierenden Proteins (Rho-GAP), die inaktiviert wird RhoA. Myo9A-mRNA wird im ependymalen Epithel des Gehirns und in den Hoden-, Lungen- und Nierenepithelien exprimiert.4 Myo9A-Knockout-Mäuse entwickeln einen fortschreitenden Hydrozephalus, eine leichte Hydronephrose und Tubulopathie.14,15 In vitro kontrolliert Myo9A die Bildung von Epithelzellverbindungen und die kollektive Zellmigration. 9 Wichtig ist, dass Myo9A ausreicht, um Aktinfilamente zu vernetzen und zu bündeln, wodurch die Bildung von Aktinnetzwerken induziert wird.16

RhoA moduliert die Podozyten-Aktin-Dynamik und erhält die glomeruläre Permeabilität aufrecht.17 Störungen der Aktivität der Rho-Guanosintriphosphatase (Rho-GTPase) in Podozyten führen zu einer glomerulären Erkrankung (Übersicht bei Mouawad et al.18). Mutationen von Downstream-Effektoren (INF2)19 und Regulatoren von Rho-Guanosindiphosphat-Dissoziationsinhibitor alpha (ARHGDIA)3 und Rho-GAP24 (ARHGAP24) 20 verursachen Proteinurie und FSGS. Also Feintuning vonRho-GTPase-Aktivitätist entscheidend für die Aufrechterhaltung eines normalen Podozyten-Phänotyps in vivo. 18

Hier berichten wir, dass MYO9A ein neuartiges Podozytenprotein ist, das, wenn es in Mäusen mutiert wird, zu Proteinurie, Fußfortsatzauslöschung (FPE) und FSGS führt und den menschlichen Phänotyp repliziert, der mit der p.Arg701* MYO9A-Variante assoziiert ist. Unsere Ergebnisse decken die Relevanz von Myo9A in Podozyten auf, zeigen, dass Myo9A Podozyten-RhoA reguliert, und liefern den ersten Beweis dafür, dass p.Arg701* Myo9A Podozyten-Dysfunktion verursacht, indem es RhoA nicht negativ reguliert und die Myo9A-Aktin-Calmodulin-Interaktion reduziert.

ZistanchekannNierenerkrankungen behandelnverbessernNierenfunktion

METHODEN

WIR S

WES von DNA-Proben von 2 betroffenen Geschwistern und 94 Kohorten-Probanden aus der klinischen Studie zur fokalen segmentalen Glomerulosklerose (FSGS-CT; NCT00135811) wurde im Yale Center for Genome Analysis and Yale DNA Clinical Lab auf Illumina-Plattformen durchgeführt.21–26 Die FSGS- Der CT-Kohorten-WES-Datensatz wurde abgefragt, um ihn zu identifizierenMYO9A-Variantenmit Minor Allel Frequency Cutoff #{{0}},01 Prozent für heterozygote Varianten und #0,1 Prozent für homozygote und zusammengesetzte heterozygote Varianten, bewertet mit Bioinformatik MetaSVM,27 SIFT28 und CADD29-Scores. MYO9A-Varianten wurden durch Sanger-Sequenzierung bestätigt. Ein Gen-Panel von 64 FSGS-verursachenden Genen basierend auf der OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man, Datenbank (omim.org) und Literatur, die mit „FSGS“, „glomerulärer Proteinurie“ oder „nephrotischem Syndrom“ (oder einer Kombination davon) in Verbindung steht diese Begriffe) wurden verwendet, um relevante Varianten zu identifizieren.

Generation von Knock-in-Myo9AR701X-Mäusen

Wir haben Myo9AR701X-Knock-in-Mäuse durch CRISPR/Cas9--vermittelte Genbearbeitung erzeugt.30 Vollständige Methoden sind in den ergänzenden Methoden enthalten. Myo9AR701X-Knockin- und Wildtyp-Wurfgeschwister, männlich und weiblich, wurden gemäß den vom Yale Animal Research Center Animal Care and Use Committee genehmigten Protokollen verwendet.

Histologie/IF

Humane Nierenbiopsie und Mäusenieren wurden für Histologie, Immunfluoreszenz (IF) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wie beschrieben verarbeitet.31,32 IF wurde in Mausnieren-Gefrierschnitten und kultivierten Podozyten durchgeführt. Primäre Antikörper waren Maus-Anti-MYO9A (Klon 4C11; Abnova, Taipei, Taiwan), Kaninchen-Anti-Podocin (P0372; Sigma, St. Louis, MO), Kaninchen-Anti-Laminin (L9393; Sigma), Kaninchen-Anti-Aquaporin2 (PAS -78809; Invitrogen, Carlsbad, CA) und Kaninchen-Anti-Megalin;33 sekundäre Antikörper waren Alexa Fluor-488- und 594--konjugiert (Invitrogen). Die Bilder wurden mit dem konfokalen Mikroskop Olympus IX71 (Olympus Corp, Shinjuku, Japan) oder Leica SP5- Spectral (Leica Camera, Wetzlar, Deutschland) aufgenommen.

Immunoblot/Immunpräzipitation

Proteine ​​wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und wie zuvor beschrieben immungeblottet;31,32 mit Anti-MYO9A (Klon 4C11), Aktin (A2066; Sigma), Calmodulin (EP799Y; Abcam, Cambridge, UK), Glyceraldehyd{{ 9}}Phosphatdehydrogenase (6C5; Millipore Corp, Burlington, MA), RhoA (67B9; Cell Signaling Technology, Beverly, MA) primäre Antikörper. Die Koimmunpräzipitation wurde wie beschrieben34,35 mit polyklonalem Anti-MYO9A-Kaninchen-Antikörper (A305-702AM; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) durchgeführt, gefolgt von Immunoblotting

Cistanche für fokale segmentale Glomerulosklerose

Quantitative PCR

Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des iScript-cDNA-Synthesekits (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) revers transkribiert, mit iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) und Myo9A-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Primern amplifiziert: 50 TCTGAGAAGTAGCAGGAATGC-30 und 50- AGCAACCACAGCTCTGAAA-30 unter Verwendung von CFX96-Touch-Real-Time-PCR (Bio-Rad). Myo9a-mRNA wurde wie beschrieben mit der 2-DDCt-Methode zu GAPDH-mRNA normalisiert.36

TEM/Immunelektronenmikroskopie

TEM wurde wie beschrieben durchgeführt.32 Für Immungold-EM wurde Wildtyp-Mausniere fixiert, ultradünne Kryoschnitte wurden gequencht, blockiert und mit primärem Maus-anti-MYO9A-Antikörper (Klon 4C11) inkubiert. Der sekundäre Antikörper war Kaninchen-Anti-Maus-IgG, das Goldkonjugat war Ziege-Anti-Kaninchen 10 nm Gold. Die Schnitte wurden nachfixiert, gefärbt und auf FEI Tecnai Biotwin (LaB6, 80 kV) TEM untersucht.

Primäre Podozyten-Isolierung und funktionelle Assays

Podozyten wurden wie beschrieben34 mit wenigen Modifikationen aus Wildtyp- und Myo9AR701X/þ-Nieren isoliert. 37,38 Adhäsionsassays wurden wie beschrieben durchgeführt und unter Verwendung von Kristallviolettfärbung quantifiziert.37

Myo9A-Knockdown

Myo9A-Knockdown (Myo9AKD) wurde in immortalisierten Maus-Podozyten vom Wildtyp unter Verwendung von Myo9A small interfering RNA (siRNA) (L-006539-ON-TARGETplus, Dharmacon; Horizon Discovery, Cambridge, UK) gemäß den Anweisungen des Herstellers induziert. Als Kontrollen dienten untransfizierte Podozyten und mit Non-Targeting-siRNA transfizierte Podozyten (D-001810-10-ON-TARGETplus Non-Targeting-Control, Dharmacon).

Figure 1 | Heterozygous nonsense MYO9A mutation in a family with focal segmental glomerular sclerosis (FSGS)/proteinuria. (a) A novel heterozygous single base-pair mutation that leads to a stop codon in exon 14 of MYO9A c.C2101T: p.R701X (p.Arg701*) in a patient with proteinuria and FSGS. Nucleotide sequence traces show the C>T-Mutation, die von Proband, Schwester und Mutter geteilt wird (oben, gekennzeichnet durch *) und Wildtyp (WT)-Sequenz vom Vater (unten), basierend auf der menschlichen MYO9A-Referenzsequenz NM_006901.4. (b) Nierenbiopsie des Probanden zeigt FSGS und leichtes interstitielles Infiltrat (Periodsäure-Schiff-Färbung, Originalvergrößerung X 400). (c) Der Familienstammbaum zeigt eine Genotyp-Phänotyp-Segregation: Individuen mit Proteinurie/FSGS und MYO9A p.R701X-Variante (ausgefüllte Symbole), Wildtyp (leeres Symbol) oder unbekannter MYO9A-Genotyp (gekennzeichnet durch #). (d) Wildtyp-MYO9A (NP_008832.2)-Proteindomänen: Motordomäne (grau) enthält Schleife 2 (gelb) und Calmodulin-Bindungsstelle (rot), Halsdomäne (blau), Schwanzdomäne (rosa ) einschließlich der Rho-Guanosintriphosphatase-aktivierenden Proteine ​​(Rho-GAP)-Domäne (grün); Domänengrenzen sind durch die Nummer der Aminosäurereste angegeben; das vorhergesagte p.R701X MYO9A endet innerhalb der Calmodulin-Bindungsstelle in Schleife 2, wobei die Hals- und Schwanzdomänen fehlen, Sternchen zeigen die Stelle von Missense anMYO9A-Variantenvon unbekannter Bedeutung identifiziert. (e) Evolutionäre Konservierung von Aminosäureresten, die durch MYO9A-Missense verändert wurden (Fortsetzung)

Abbildung 1|(Fortsetzung) Mutationen, die bei Patienten mit FSGS identifiziert wurden: MYO9A-veränderte Reste p.D156G (p.Asp156) und p.E765D (p.Glu765) (rote Pfeile) sind durch Phylogenie hochgradig konserviert. Zugangsnummern: H. sapiens (NP_008832.2), M. musculus (NP_766606.2), R. norvegicus (NP_599162.1), G. gallus (XP _015134553.1), D. rerio (E7EZG2.1) und X. tropicalis (XP_002934596.2) wurden für MYO9A multiples Sequenzalignment mit Clustal Omega, EMBL-EBI (European Molecular Biology Laboratory – European Bioinformatics Institute, https://www.ebi.ac.uk/Tools/MSA/clustalo/). Um die Anzeige dieses Bildes zu optimieren, lesen Sie bitte die Online-Version dieses Artikels unter www.kidney-international.org.

RhoA-Aktivität

Aktives RhoA wurde mit dem Rho-Aktivierungs-Pulldown-Assay (Millipore) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.39 Aktives RhoA wurde durch Immunoblotting nachgewiesen.40

statistische Analyse

Die Daten wurden unter Verwendung der Software GraphPad Prism 8 (San Diego, CA) mit ungepaartem Student-t-Test mit Welch-Korrektur oder Welch-Varianzanalyse, je nachdem, analysiert. P < 0,05="" wurde="" als="" statistisch="" signifikant="">

ERGEBNISSE

Identifizierung von MYO9A-Varianten bei Patienten mit Proteinurie und FSGS

WES21 identified a rare truncating MYO9A mutation in 2 siblings diagnosed with FSGS/proteinuria at 15 and 14 years of age (Figure 1a), presenting with asymptomatic proteinuria w1 to 2 g/d, normal blood pressure, normal renal ultra-sounds, and estimated glomerular filtration rate of 72 and 96 ml/min per 1.73 m2, respectively. Renal biopsy performed on the index case showed FSGS, mild interstitial fifibrosis, and no tubular abnormalities (Figure 1b). The proband's disease progressed over 3 years: estimated glomerular filtration rate decreased to 46 ml/min per 1.73 m2 and proteinuria >2 g/ d while his sister's estimated glomerular filtration rate and proteinuria remained stable. Relevant family history includes a maternal uncle with chronic kidney disease of unknown etiology, a mother with a history of proteinuria and a healthy father, and no consanguinity (Figure 1c). WES revealed a shared nonsense heterozygous MYO9A (NM_006901 c.2101C>T, p.Arg701* ) in the siblings (Figure 1a). This rare MYO9A variant was identified in 1 of 113,632 alleles tested in the Genome Aggregation Database, or gnomAD (http://gnomad. broadinstitute.org), the allele frequency of 8.8 X 10–6. The parents' genotype revealed that only the mother is heterozygous for c.2101C>T, p.Arg701* MYO9A-Variante, was auf eine autosomal-dominante Vererbung der Mutation hinweist (Abbildung 1c). Der Genotyp des Onkels mütterlicherseits mit chronischer Nierenerkrankung ist nicht verfügbar. Es wird erwartet, dass MYO9A p.Arg701* (p.R701X) zu einem Funktionsverlust aufgrund von Nonsense-vermitteltem mRNA-Zerfall oder einer Verkürzung in Schleife 2 der MYO9A-Kopfdomäne (Abbildung 1d) führt, die für Myo9A erforderlich ist, um Aktin zu vernetzen .16 Ergänzende Tabelle S1 zeigt alle Varianten, die von den Geschwistern geteilt werden. Bei keinem der Geschwister wurden bisher berichtete Mutationen in FSGS oder nephrotisches Syndrom verursachenden Genen festgestellt (Ergänzungstabelle S2). Unseres Wissens ist dies der erste Bericht, der eine MYO9A-Mutation mit Funktionsverlust mit einer Nierenerkrankung beim Menschen in Verbindung bringt.

Analysis of WES data from 94 FSGS patients (from the FSGS-CT cohort)41 identifified 5 unrelated individuals with heterozygous MYO9A missense variants (Table 1) meeting a minor allele frequency cutoff #0.01%; 2 of these individuals' MYO9A variants, p.Asp156Gly and p.Glu765Asp (Figure 1d), are predicted to be deleterious by at least 2 bioinformatics scores: MetaSVM, SIFT, and CADD >18;27–29 Die anderen 3 Missense-Varianten werden basierend auf 3 Bioinformatik-Vorhersagewerten als gutartig eingestuft. Die in p.Asp156Gly- und p.Glu765Asp-Varianten substituierten Aminosäuren haben wahrscheinlich eine relevante Funktion, da diese Reste durch die Evolution konserviert werden (Abbildung 1e). Wir identifizierten auch 1 Patient, der eine MYO9A-Variante (p.Arg2283His) trug, die unsere Kriterien für die Nebenallelhäufigkeit, die zuvor beim kongenitalen Myasthenie-Syndrom berichtet wurden, nicht erfüllte.6 Keine pathogenen Mutationen oder schädlichen Varianten in FSGS/NS/Proteinurie-verursachenden Genen (Ergänzungstabelle S2 ) wurden bei den 5 Personen mit MYO9A-Varianten identifiziert.

MYO9A-Expression in Podozyten und glomeruläre Erkrankungen

Die Myo9A-Proteinexpression wurde durch Immunoblotting in Mausnieren und Maus- und menschlichen Podozyten nachgewiesen (Abbildung 2a). Die Immunzytochemie bestätigte die zytoplasmatische Expression von MYO9A in menschlichen Podozyten (Abbildung 2b). Immunreaktives Myo9A wird durch IF-Mikroskopie in Mausglomeruli nachgewiesen, wo es teilweise mit Podocin kolokalisiert (Abbildung 2c). Doppelmarkierung und konfokale Mikroskopie zeigen die Myo9A-Lokalisierung entlang der Außenseite der glomerulären Basalmembran (GBM), die eng aneinander angrenzt oder mit Podocin (Abbildung 2d) und Laminin (Abbildung 2e) kolokalisiert ist. Immunogold EM demonstriert die genaue Lokalisierung von Myo9A. Goldpartikel sind im Zytoplasma des Fußfortsatzes und im Zellkörper der Podozyten verteilt (Abbildung 2f und g, ergänzende Abbildung S1B und D). Spaltblenden sind einheitlich unbeschriftet. Mesangial- und Endothelzellen zeigen keine signifikante Markierung. Goldpartikel werden auch in proximalen Tubuluszellen nachgewiesen (ergänzende Abbildung S1C).

Um zu beurteilen, ob die Myo9A-Expression bei glomerulären Erkrankungen gestört ist, untersuchten wir 2 Mausmodelle, die mit einer Proteinurie im nephrotischen Bereich assoziiert sind.31,32 Sich entwickelnde Mäuse mit nephrotischem Syndrom, das durch eine Vegfa-Überexpression31 induziert wurde, zeigen eine verringerte glomeruläre Myo9A (Abbildung 3a). In ähnlicher Weise ist glomeruläres Myo9A bei Mäusen mit Streptozotocin-vermittelter fortgeschrittener diabetischer Glomerulosklerose, die durch Vegfa-Überexpression induziert wurde, verringert32 im Vergleich zu Myo9A, das bei diabetischen Mäusen nachgewiesen wurde, die Vegfa nicht überexprimieren (Abbildung 3b) und nicht diabetischen Mäusen (Abbildung 2c). Die Lokalisierung des Myo9A-Podozyten-Fußfortsatzes und ein vermindertes glomeruläres Myo9A in beiden proteinurischen Krankheitsmodellen deuten darauf hin, dass Myo9A eine Rolle bei der Funktion der glomerulären Filtrationsbarriere spielen könnte.

Tabelle 1|Missense-MYO9A-Varianten in FSGS-CT-Patientenkohorte identifiziert

p.D156G, p.Asp156Gly; p.E765D, Glu765Asp; p.M2384V, p.Met2384Val; S.P1704S, S.Pro1704Ser; p.T389M, Thr389Met. Varianten, gefiltert bei Nebenallelhäufigkeit #0,01 Prozent, n ¼ 94 Proben nach ANNOVAR-Anmerkung.

Gen-editierte MYO9AR701X-Mäuse zur Entwicklung von FSGS

Um zu bestimmen, ob p.Arg701* (p.R701X) MYO9A Nonsense-Mutation glomeruläre Erkrankungen bei Mäusen verursacht, erzeugten wir Knock-in p.Arg701* (hier Myo9AR701X)-Mäuse durch CRISPR/Cas9--vermittelte Genbearbeitung.30 Heterozygot Mutante Myo9AR701X/þ-Mäuse (Abbildung 4a) liefern lebensfähige mutierte Jungtiere in Mendelscher Manier, was zeigt, dass die Mutation nicht embryonal tödlich ist. Homozygote Mutanten entwickeln einen progressiven Hydrozephalus (ergänzende Abbildung S2), Ataxie und Krampfanfälle und sterben fast alle vor dem Alter von 3 Wochen, was an Myo9A-Null-Mäuse erinnert.14 Heterozygote Myo9AR701X/þ-Mutanten haben bei der Geburt keinen offensichtlichen Phänotyp, sind fruchtbar und überleben zum Erwachsenenalter.

Alle mutierten Myo9AR701X-Mäuse entwickeln FPE und Proteinurie, wenn auch in unterschiedlichem Alter. Homozygote Myo9AR701X/R701X-Mutanten zeigen im Alter von 2 Wochen dysmorphe Glomeruli, tubuläre Dilatation und Proteinabgüsse auf der Lichtmikroskopie (Abbildung 4b, ergänzende Abbildung S3A). TEM von 2- Wochen alten Myo9AR701X/R701X-Mutantennieren zeigt ausgedehnte FPE, dicke und unregelmäßige GBM und das Fehlen von geschlitzten Diaphragmen, die durch Adherens-Verbindungen ersetzt wurden (Abbildung 4d). Im Gegensatz dazu zeigen 2--wöchige heterozygote Myo9AR701X/þ-Mutanten eine normale Nierenhistologie und eine Ultrastruktur der glomerulären Filtrationsbarriere (Abbildung 4c und e), die nicht von Wildtyp-Wurfgeschwistern zu unterscheiden sind (Abbildung 4f), wie durch Quantifizierung der Fußfortsätze bestätigt wurde (FP/mm GBM) (Abbildung 4g). Albuminurie wird in Urinproben sowohl von heterozygoten als auch von homozygoten Myo9AR701X-Mutantenmäusen durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ( 4h ) im Alter von 2 Wochen nachgewiesen.

Im Alter von 4 Monaten zeigen heterozygote Myo9AR701X/þ-Mäuse lichtmikroskopisch FSGS (Abbildung 5a und g) und TEM zeigt FPE (weiße Pfeile), abnormale Schlitzdiaphragmen (kurze schwarze Pfeile), unregelmäßige GBM und mesangiale Ausdehnung (Abbildung 5b) . Die Quantifizierung der Fußfortsätze zeigt eine signifikante FPE in Myo9AR701X/þ im Vergleich zu erwachsenen Wildtypnieren (Abbildung 5c). Dieser glomeruläre Phänotyp ist dem in der Nierenbiopsie des Probanden beobachteten bemerkenswert ähnlich (Abbildung 1b). Erwachsene heterozygote Myo9AR701X/þ-Mutantenmäuse haben signifikant höhere Albumin-Kreatinin-Verhältnisse im Urin als gleichaltrige Wildtypmäuse (Abbildung 5d) und zeigen keine Anzeichen von Polyurie oder Gewichtsverlust (Abbildung 5e und f). Bei der periodischen Säure-Schiff-Untersuchung zeigen erwachsene Myo9AR701X/þ-Nieren FSGS unterschiedlichen Schweregrades (Pfeile, Abbildung 5g) und das Fehlen von tubulärer Atrophie und Dilatation oder interstitiellen Infiltraten. Doppelmarkierung und konfokale Mikroskopie erkennen Myo9A in proximalen Tubuli, peripher zu Megalin (Pfeilspitzen, Abbildung 5h und k), während Myo9A nicht in distalen Nephronsegmenten nachgewiesen wird, die Aquaporin2 exprimieren (Abbildung 5h und i). Die Markierung beider röhrenförmiger Marker in erwachsenem Myo9AR701X/þ ist durch konfokale Mikroskopie nicht von Wildtypnieren zu unterscheiden (Abbildung 5h und k sowie i und l). Im Gegensatz dazu ist die Myo9A-Färbung in den proximalen Tubuli und in den Glomeruli bei Myo9AR701X/þ (Abbildung 5h und i) im Vergleich zu Wildtyp-Nieren (Abbildung 5k und l) verringert. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass p.Arg701* eine FSGS-verursachende Myo9A-Mutation in Mäusen ist, die den Phänotyp und die autosomal-dominante Vererbung der heterozygoten MYO9A p.Arg701*-Variante rekapituliert, die im Probanden identifiziert wurde.

Wie funktioniert p. Arg701* Myo9A-Mutation induziert FSGS?

Wir verwendeten Myo9AR701X-Knock-in-Mäuse, um die molekulare Pathogenese von FSGS zu untersuchen, die durch eine p.Arg701*-MYO9A-Mutation verursacht wird. Die Myo9A-Expression in Knockin-Myo9AR701X-Nieren nimmt bei Heterozygoten signifikant ab und wird bei Homozygoten durch IF (Abbildung 6a) und Immunoblotting (Abbildung 6b und c) nicht erkannt. Wir führten eine quantitative PCR durch, um zu beurteilen, ob bei Myo9AR701X/þ-Mutanten eine durch Nonsense-mRNA-Zerfall42 vermittelte Haploinsuffizienz auftritt. Die Myo9A-mRNA-Expression in Myo9AR701X/þ-Nieren ist um 50 Prozent niedriger als in Wildtyp-Nieren (48,3 ± 5,6 Prozent; P < 0,0001)="" (abbildung="" 6d),="" was="" mit="" einer="" haploinsuffizienz="">

Verringertes Myo9A verringert seine Interaktion mit Aktin und Calmodulin

Wir untersuchten, ob Myo9A-Haploinsuffizienz die Myo9A-Aktin-Calmodulin-Interaktion verändert. Koimmunpräzipitationsexperimente, die Wildtyp- und Myo9AR701X/þ-Nieren und -Podozyten vergleichen, bestätigen die Myo9A-Interaktion mit Actin und mit Calmodulin und zeigen, dass die Myo9A-Interaktion mit beiden Proteinen in Myo9AR701X/þ-Mutantennieren und -Podozyten um w50 Prozent abnimmt (Abbildung 6e und f), eine Reduktion ähnlich dem von Myo9A in voller Länge. Im Gegensatz dazu bleiben die Expressionsniveaus von Aktin und Calmodulin intakt (Eingabe, Abbildung 6e und f). Um Myo9A-Wechselwirkungen bei reduzierter Expression zu analysieren, induzierten wir w50 Prozent Myo9AKD in unsterblich gemachten Wildtyp-Maus-Podozyten mit siRNA, bewertet durch quantitative PCR und Immunoblotting (Abbildung 7a und b), und führten dann Koimmunpräzipitationsexperimente durch. Myo9AKD verringert die Myo9A-Actin-Calmodulin-Interaktion proportional zur Myo9A-Expression (Abbildung 7c). Zusammengenommen weisen die Ergebnisse der Koimmunpräzipitation darauf hin, dass die heterozygote p.Arg701* Myo9A-Mutation und Myo9AKD die Myo9A-Häufigkeit und damit seine Wechselwirkung mit Actin und Calmodulin verringern. Da Myo9A Aktin in einem molaren Verhältnis von 1:1 quervernetzt,16 deuten unsere Daten darauf hin, dass verringertes Myo9A in heterozygoten Myo9AR701X/þ-Podozyten die Myo9A-vermittelte Aktinvernetzung und -bündelung beeinträchtigen kann.

Abbildung 2|(Fortsetzung) zu Podocin (grün) auf seiner GBM-Seite (Pfeilspitzen). Einsätze zeigen eine stärkere Vergrößerung. Stangen=25 mm. (e) Konfokale Mikroskopie zeigt Myo9A-Färbung eng benachbart oder kolokalisiert mit Laminin (grün) entlang der Außenseite des GBM (Einschübe und Pfeilspitze). Stangen=25 mm. (f,g) Immunogold-Elektronenmikroskopie-Lokalisierung von Myo9A in Glomeruli von Wildtyp-Mausnieren: Goldpartikel (schwarze Pfeile) werden im Podozyten-Zellkörper (POD) und im Zytoplasma der Fußfortsätze (FP) beobachtet, einige Goldpartikel sind zu sehen an der FP-Basis neben der glomerulären Basalmembran, aber nicht an Schlitzdiaphragmen. Balken ¼ 500 nm. Um die Anzeige dieses Bildes zu optimieren, lesen Sie bitte die Online-Version dieses Artikels unter www.kidney-international.org.

Die Myo9AR701X-Mutation erhöht die Rho-A-Aktivität

Wir haben die RhoA-Aktivität mithilfe eines Pulldown-Assays in Myo9AR701X-Mutanten- und Wildtypmäusen gemessen, wobei wir uns auf heterozygote Myo9AR701X/þ konzentrierten, um mechanistische Einblicke in den menschlichen p.Arg701*-MYO9A-Phänotyp zu erhalten. Aktives RhoA ist in Myo9AR701X/þ-Gesamtnieren (Abbildung 8a), isolierten Glomeruli (Abbildung 8b) und primären Podozyten (Abbildung 8c) im Vergleich zu den entsprechenden Wildtyp-Kontrollproben signifikant erhöht. Das Ausmaß des GTP-RhoA-Anstiegs in Myo9AR701X/þ-Proben reicht von w60 % in isolierten Glomeruli bis zum w2--fachen in ganzen Nieren und in Podozyten (Abbildung 8a–c). Aktives RhoA ist in homozygoten als in heterozygoten Mutantennieren etwas höher, aber der Unterschied ist nicht signifikant (Fig. 8a). Zusammen zeigen diese Experimente, dass Myo9AR701X eine erhöhte RhoA-Aktivität verursacht

Myo9AR701X/D-Mutation und Myo9AKD verändern das Podozytenverhalten

Um die Auswirkung einer beeinträchtigten Myo9A-Aktin-Interaktion und einer erhöhten RhoA-Aktivität, die in mutierten Myo9AR701X/þ-Podozyten nachgewiesen wurden, auf ihre Funktion zu beurteilen, haben wir die Podozyten-Adhäsion und -Motilität mithilfe von Anhaftungs- und Migrationsassays gemessen und Wildtyp- mit mutierten primären Podozyten unter Kontrollbedingungen und darüber verglichen Hemmung des RhoA-Signalwegs mit dem Rho-assoziierten Kinase-Inhibitor Y27632. Diese Experimente zeigen deutlich, dass Myo9AR701X/þ die Podozytenmotilität (Abbildung 8d; ergänzende Abbildung S4) und die Podozytenanhaftung (Abbildung 8e) in Abhängigkeit von der RhoA-Aktivität beeinträchtigt. Um die Wirkung der Myo9A-Haploinsuffizienz auf die Podozytenfunktion direkt zu bewerten, führten wir Anhaftungs- und Migrationsassays durch, in denen Wildtyp-Maus-Podozyten mit Myo9AKD-Podozyten verglichen wurden, die w50 Prozent Myo9A-mRNA und -Protein exprimieren (Abbildung 7a und b). Non-Targeting siRNA-behandelte Podozyten dienten als zusätzliche Kontrolle. Myo9AKD verringert signifikant die Anhaftung und Migration von Podozyten, derselbe Defekt, der bei Myo9AR701X/þ-Podozyten beobachtet wurde (Abbildung 8f und g). Zusammenfassend deuten mechanistische Daten darauf hin, dass die heterozygote p.Arg701* Myo9A-Mutation zu einer Myo9A-Haploinsuffizienz führt, die zu einer verringerten Myo9A-Aktin-Calmodulin-Interaktion und einem erhöhten aktiven RhoA in der Niere, insbesondere in Podozyten, führt. Wir interpretieren, dass diese Mechanismen zusammengenommen die Podozytenfunktion stören, was durch eine verringerte Anheftung und Beweglichkeit in vitro und durch das Vorhandensein von Proteinurie in vivo angezeigt wird.

DISKUSSION

Diese Studie identifiziert Myo9A als eine neuartige Komponente des Podozyten-Zytoskelettapparats, die die Podozytenfunktion beeinflusst, indem sie die RhoA-Aktivität negativ reguliert. Wir beschreiben eine seltene unsinnige MYO9A-Mutation (p.Arg701*), die mit assoziiert ist

familiäre FSGS/Proteinurie und zeigen, dass diese Mutation FSGS-ähnliche Läsionen bei Mäusen verursacht, was einen Einblick in den Krankheitsmechanismus liefert.

Unsere Ergebnisse stützen die Vorstellung, dass MYO9A ein FSGS-Kandidatengen ist und dass p.Arg701* MYO9A eine Variante ist, die an menschlicher FSGS beteiligt ist, basierend auf den Richtlinien des American College of Medical Genetics zur Zuordnung von Kausalität unter Verwendung von Genvorhersagealgorithmen, Allelfrequenzen und experimentellen Tiermodellen und funktionelle Assays.43,44 Die Probanden-Geschwister, die p.Arg701* MYO9A beherbergen, haben keine bis heute bekannten Mutationen in FSGS-verursachenden Genen und zeigen keine Hinweise auf sekundäre Ursachen für FSGS. Diese Variante cosegregiert in einer kleinen Verwandtschaft nach einem autosomal-dominanten Vererbungsmuster mit variabler Expressivität. MYO9A p.Arg701* ist voraussichtlich eine Variante mit Funktionsverlust, fehlt in Kontrollexomen und weist eine Allelfrequenz auf<0.0001 in="" population="" databases,="" in="" compliance="" with="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" standards="" to="" support="" pathogenicity="" and="" consistent="" with="" parameters="" used="" in="" a="" recent="" comprehensive="" report="" on="" genetic="" contributions="" to="" fsgs.43–45="" moreover,="" loss-of-function="" observed/expected="" upper="" bound="" fraction="" for="" myo9a="" is="" 0.3,="" suggestive="" of="" low="" tolerance="" to="" gene="" inactivation="" with="" a="" constraint="" similar="" to="" genes="" known="" to="" cause="" autosomal="" dominant="" fsgs="" (e.g.,="" wt1,="" 0.25="" or="" inf2,="">

Das WES-Screening einer großen Kohorte nicht verwandter FSGS-Kinder und junger Erwachsener41 identifizierte 2 Patienten mit seltenen heterozygoten MYO9A-Mißense-Varianten (p.Asp156Gly und p.Glu765Asp). Beide MYO9A-Missense-Varianten umfassen hochkonservierte Reste und haben geringe Allelfrequenzen<0.01%, are="" predicted="" to="" be="" deleterious="" and="" have="" not="" previously="" been="" associated="" with="" human="" disease.="" three="" additional="" myo9a="" missense="" variants="" (thr389met,="" p.pro1704ser,="" p.met2384val)="" identified="" in="" this="" fsgs="" cohort="" were="" deemed="" benign="" by="" bioinformatics="" scores.="" these="" 5="" individuals="" do="" not="" carry="" mutations="" in="" known="" fsgs-causing="" genes.="" for="" clinical="" purposes,="" these="" missense="" variants="" should="" be="" considered="" variants="" of="" unknown="" significance="" given="" the="" absence="" of="" experimental="" data="" evaluating="" how="" they="" impact="" myo9a="" function.43,44="" to="" our="" knowledge,="" no="" myo9a="" mutation="" has="" been="" proven="" to="" cause="" a="" specific="" human="" disease="" by="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" guidelines.43,44="" association="" of="" compound="" heterozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.g2282e="" and="" p.y203c)="" with="" arthrogryposis="" was="" reported="" in="" 1="" patient,5="" and="" compound="" heterozygote="" or="" homozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.r1517h/p.r2283h="" and="" p.d1698g,="" respectively)="" were="" described="" in="" association="" with="" congenital="" myasthenia="" syndrome.6="" a="" nonsense="" homozygous="" myo9a="" (p.r513x)="" was="" associated="" with="" severe="" ventriculomegaly="" and="" fetal="" demise.47="" elegant="" expression="" studies="" support="" a="" role="" for="" myo9a="" at="" the="" neuromuscular="" junction="" and="" its="" intriguing="" regulation="" of="" agrin="" secretion="" and="" actin="">

Abbildung 3|Glomeruläre Myo9A-Expression in Mausmodellen für glomeruläre Erkrankungen. (a) Entwicklungsbedingtes nephrotisches Syndrom, induziert durch Vegfa-Überexpression31: Immunfluoreszenz zeigt Myo9A (rot) in Glomeruli von normalen, nicht induzierten 2- Wochen alten Mäusen und deutlich verringerte Myo9A-Expression in Glomeruli von nephrotischen Mäusen, die Vegfa überexprimieren, während Podocin (grün) ist unverändert. (b) Streptozotocin-induzierter Diabetes mit oder ohne Vegfa-Überexpression32: Immunfluoreszenz weist Myo9A (grün) in Glomeruli von nicht induzierten diabetischen Nieren (DM-Kontrolle) und deutlich verringertes immunreaktives Myo9A in Glomeruli von diabetischen Mäusen nach, die Vegfa überexprimieren und eine diabetische Glomerulosklerose entwickeln (fortgeschrittene DN), 40,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (blau) zeigt Zellkerne aus beiden Abschnitten mit umrandeten Glomeruli (schraffierte weiße Linie). Stangen=50 mm. Um die Anzeige dieses Bildes zu optimieren, lesen Sie bitte die Online-Version dieses Artikels unter www. Nieren-international.

Figure 4 | Genotype and phenotype analysis of knockin Myo9AR701X mice at 2 weeks of age. (a) Sanger sequencing traces and deduced amino acid sequences from exon 14 are shown from mutant mice: heterozygous (Het) Myo9AR701X/þ (top), homozygous (Hom) Myo9AR701X/R701X (middle), and wild-type (WT) littermate (bottom). C>Die T-Mutation ersetzt CGA, das Arg (R) codiert, durch TGA, ein Stoppcodon, das die Termination der Translation bei Aminosäure 701 vorhersagt. (b) Repräsentative Periodsäure-Schiff-Färbung aus einer 2- Woche alten homozygoten Myo9AR701X/R701X-Mutantenniere zeigt abnorme Glomeruli, tubuläre Dilatation und Proteinabgüsse. Balken =20 mm. (c) Repräsentative Periodsäure-Schiff-Färbung aus einer 2- Woche alten heterozygoten Myo9AR701X/þ-Niere zeigt eine normale Histologie. Balken =20 mm. (d) Repräsentative Transmissionselektronenmikroskopie des 2- Wochen alten Myo9AR701X/R701X-Glomerulus zeigt eine massive Auslöschung des Fußfortsatzes (weiße Pfeile), das Fehlen von geschlitzten Diaphragmen, die durch anhaftende Verbindungen (schwarze Pfeile) ersetzt wurden, und ein verdicktes, unregelmäßiges glomeruläres Fundament Membran (GBM). Stange =1 mm. (e) Repräsentative Transmissionselektronenmikroskopie eines 2- Wochen alten heterozygoten Myo9AR701X/þ-Glomerulus zeigt normale Fußfortsätze (schwarze dünne Pfeile) und normale Schlitzdiaphragmen (weiße dünne Pfeile). Balken =1 mm. (f) Transmissionselektronenmikroskopie eines 2- Wochen alten WT-Wurfsgeschwisters zeigt eine normale glomeruläre Filtrationsbarriere: dünne Fußfortsätze, die durch geschlitzte Diaphragmen verbunden sind, gefensterte Endothelzellen (ECs) und dünne GBM. Stange =1 mm. (g) Quantifizierung der Auslöschung der Fußfortsätze im Alter von 2 Wochen: Homozygote Myo9AR701X/R701X-Nieren zeigen weniger als halbe Fußfortsätze (FPs)/mm GBM als WT- oder heterozygote Myo9AR701X/þ-Wurfgeschwister, was auf eine schwere Auslöschung der Fußfortsätze hinweist. P < 0,0001="" (varianzanalyse).="" (h)="" coomassie-blau-färbung="" von="" natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gelelektrophorese-aufgelösten="" urinproben="" zeigt="" albuminurie="" (alb)="" sowohl="" bei="" myo9ar701x/r701x="" (plus/-)="" als="" auch="" bei="" myo9ar701x/þ="" (þ/="" plus),="" während="" wt-urin="" albuminfrei="" ist.="" rinderserumalbumin="" (10="" mg)="" dient="" als="" molekulargewichtskontrolle.="" pod,="" podozyten.="" um="" die="" anzeige="" dieses="" bildes="" zu="" optimieren,="" lesen="" sie="" bitte="" die="" online-version="" dieses="" artikels="" unter="">

Abbildung 5|Phänotypanalyse adulter heterozygoter Myo9AR7{{20}}1X/D-Knockin-Mäuse. (a) Eine repräsentative Periodsäure-Schiff (PAS)-Färbung aus einer 4- Monate alten Myo9AR701X/þ-Niere zeigt einen Glomerulus mit ausgedehnter fokaler segmentaler Glomerulusklerose und mesangialer Proliferation. Balken=50 mm (b) Repräsentative Transmissionselektronenmikroskopie einer 4- Monate alten Myo9AR701X/þ-Niere zeigt ausgedehnte Auslöschung des Fußfortsatzes (weiße Pfeile), teilweisen Ersatz von geschlitzten Diaphragmen (dünne schwarze Pfeile) durch Adhärenz-Verbindungen (dicke schwarze Pfeile). Balken =2 mm (c) Quantifizierung der Auslöschung des Fußfortsatzes bei erwachsenen Myo9AR701X/þ-Mutantenmäusen: 4 Monate alte heterozygote (Het) Myo9AR701X/þ zeigen 2,2 ± 0,06 FP/mm im Vergleich zum Wildtyp (WT ) 3,7 ± 0,13 FP/mm. ****P<0.0001. (d)="" urine="" (u)="" albumin/creatinine="" (creat)="">

Figure 5 | (continued) ratio at 4 months of age is higher in Myo9AR701X/þ (Het, red dots) than in WT mice (black dots). ***P>0.001. (e) Urinvolumen (24 Stunden) und (f) Körpergewicht sind bei WT (n=18)- und Myo9AR701X/þ (Het, n=16)-Mäusen nicht unterschiedlich. (g, j) Repräsentative PAS-Färbung von Myo9AR701X/þ (g) und WT (j) Nieren: (g) zeigt frühe fokale Sklerose (Pfeile) und mesangiale Proliferation in 2 Glomeruli, normale Rücken-an-Rücken-Tubuli und keine Infiltrate; (j) zeigt normale Glomeruli und Tubuli in der WT-Niere. Stangen =50 mm. (h,k) Konfokale Mikroskopie der Myo9A/Megalin-Immunfluoreszenz: (h) Myo9AR701X/þ-Niere zeigt begrenztes Myo9A-Signal (rot) (Pfeilspitzen) in proximalen tubulären Zellen, die mit Megalin (grün) markiert sind, proximale Tubuli sind nicht erweitert; (k) WT-Niere zeigt reichlicheres Myo9A (Pfeilspitzen) angrenzend an Megalin in proximalen Tubuluszellen. Stangen =25 mm. (i,l) Konfokale Mikroskopie von Myo9A/Aquaporin2 (AQP2)-Immunfluoreszenz: (i) Myo9AR701X/þ-Niere zeigt begrenztes Myo9A (rot) im Glomerulus (Pfeilspitzen), Myo9A wird nicht in distalen Nephronsegmenten nachgewiesen, die mit AQP2 (grün) markiert sind , die nicht erweitert sind; (l) WT-Niere zeigt Myo9A-Färbung im Glomerulus und AQP2-Färbung in distalen Nephronsegmenten. Stangen =25 mm. EC, Endothelzelle; FP, Zytoplasma der Fußprozesse; GBM, glomeruläre Basalmembran. Um die Anzeige dieses Bildes zu optimieren, lesen Sie bitte die Online-Version dieses Artikels unter www.kidney-international.org.

Abbildung 6|Myo9A-Expression und Myo9A-Aktin-Calmodulin-Interaktion in Myo9AR701X-Knock-in-Nieren und Podozyten. (a) Immunfluoreszenz weist glomeruläres Myo9A und Podocin nach: Die glomeruläre Myo9A-Immunfärbung (rot) ist in Wildtyp(WT)-Nieren stark, nimmt in Myo9AR701X/þ-Glomeruli signifikant ab und wird in Myo9AR701X/R701X-Glomeruli nicht nachgewiesen; Podocin (grün) lokalisiert sich bei allen Mäusen an Podozyten; Teilweise Podozyten-Myo9A-Kolokalisation wird durch Verschmelzen (gelb) angezeigt. Stangen =50 mm. (b) Immunoblotting: Die Expression von intaktem Myo9A (280 kDa) nimmt in Myo9AR701X/þ-Nieren (heterozygot [Het]) auf etwa die Hälfte ab und wird in Myo9AR701X/R701X-Nieren (homozygot [Hom]) nicht nachgewiesen, *kleinere Banden (<75 kda)="" are="" considered="" nonspecific,="" w50="" kda="" bands="" correspond="" to="" igg="" heavy="" chain="" in="" all="" genotypes.="" (c)="" myo9a/actin="" quantification="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" pool="" from="" 3="" mice="" each.=""><0.001. (d)="" quantitative="" polymerase="" chain="" reaction="" (qpcr):="" myo9a="" mrna="" expression="" normalized="" to="" gapdh="" mrna,="" fold="" change="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" n="3" individual="" mice="" each.="">< 0.0001.="" (e,f)="" coimmunoprecipitation="" (ip)="" of="" kidney="" lysates="" (e)="" and="" primary="" podocytes="" (f)="" show="" decreased="" myo9a-actin-calmodulin="" interaction="" in="" myo9ar701x/þ="" (het)="" proportionally="" to="" the="" reduced="" myo9a="" expression="" (input);="" note="" input="" of="" actin="" and="" calmodulin="" is="" equal="" in="" both="" genotypes.="" ab,="" antibody.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

We demonstrate Myo9A protein expression in podocyte cell lines and mouse kidney glomeruli and Myo9A subcellular localization in podocytes. Dual immunolabeling and confocal microscopy localized Myo9A along the external aspect of the GBM stained by laminin, tightly contiguous to podocin. Immunogold EM determined precisely Myo9A localization to the cytoplasm of foot processes and podocyte cell bodies, leaving slit diaphragms unlabeled. The apparent Myo9A mesangial localization in nonconfocal IF images was not confirmed by immunogold EM. Our findings are consistent with glomerular MYO9A immunohistochemical localization in human renal biopsies (www.proteinatlas.org/ ENSG00000066933-MYO9A/tissue/kidney). Myo9A was also detected in proximal tubules by IF and immunogold-EM, extending a previous report that did not detect Myo9A in glomeruli.15 The discrepancy in Myo9A tissue localization is probably due to different affinities of the primary antibodies used by Thelen et al.15 and in this study. Similar discrepancies in glomerular MYO9A staining of the same human renal biopsies were noticed using 2 affinity-purified polyclonal antibodies, the higher specificity antibody by protein array resulting in the stronger glomerular signal. Localization of Myo9A mRNA in the kidney by in situ hybridization has also been discrepant;4,15 Myo9A developmental regulation might be involved. RNA-sequencing data suggest Myo9A expression along with most nephron segments in mice and humans, raising the possibility that loss-of-function mutations may lead to phenotypes involving several cell types. Interestingly, we observed a clear decrease in glomerular Myo9A expression in 2 mouse models of proteinuria: developmental nephrotic syndrome and advanced diabetic disease. The latter is consistent with a >2-fache Abnahme der Myo9A-Expression durch DNA-Array, berichtet bei diabetischen Zuckerratten.49 Zusammengenommen deuten die Myo9A-Expressionsdaten darauf hin, dass Myo9A eine Rolle bei der glomerulären Filtrationsbarriere spielen könnte.

Um die Relevanz der p.Arg701* MYO9A-Nonsense-Mutation in vivo zu verstehen, haben wir Myo9AR701X-Knock-in-Mäuse durch Gen-Editierung erzeugt. Homozygote Myo9AR701X/R701X-Mutanten entwickeln einen progressiven Hydrozephalus, der im Alter von 3 Wochen zum Tod führt, ähnlich wie bei Myo9A-Null-Mäusen.14 Im Alter von 2 Wochen zeigen homozygote Myo9AR701X/R701X-Nieren einen schweren glomerulo-tubulären Phänotyp: ausgedehnte FPE, GBM-Anomalien, und Mangel an Schlitzdiaphragmen und erweiterten Tubuli, verbunden mit Albuminurie. Erwachsene Myo9A-Null-Mäuse zeigten proximale Tubulopathie, Polyurie und Proteinurie mit niedrigem Molekulargewicht.15 Leider wurden keine glomerulären ultrastrukturellen Daten in den Bericht aufgenommen;15 überraschenderweise 3- bis 6- Monate altes Myo9A -null-Mäuse erlagen nicht wie zuvor beschrieben einem progressiven Hydrozephalus.14 Da homozygote Myo9AR701X/R701X-Mutanten nicht bis ins Erwachsenenalter überleben, können wir nur den hier beschriebenen frühen glomerulären Phänotyp feststellen. Tubuläre Dilatation, die bei 2- Wochen alten Myo9AR701X/R701X-Mutanten beobachtet wurde, könnte einen frühen Hinweis auf die bei erwachsenen Myo9A-Null-Mäusen beschriebene Tubulopathie darstellen.

Figure 8 | RhoA activity and podocyte function in Myo9AR701X kidneys and Myo9A knockdown (Myo9AKD) podocytes. (a–c) Active RhoA (guanosine triphosphate [GTP]–RhoA) is increased in Myo9A R701X mutants versus wild-type (WT): >2-fold in whole kidneys (a), w60% in isolated glomeruli (b), >2-falten in primären Podozyten (c), Western Blots repräsentativ für n=3 bis 4 unabhängige Experimente, gepoolte Lysate von jeweils 3 Mäusen, Quantifizierung (Mittelwert ± Standardabweichung), Varianzanalyse (ANOVA) (a ) oder ungepaarter t-Test (b,c). *P<0.05,><0.001. (d)="" podocyte="" migration="" assay="" (wound="" assay)57:="" quantification="" of="" the="" migration="" area="" shows="" that="" myo9ar701x/þ="" (heterozygous="" [het])="" podocyte="" migration="" is="" decreased;="" preincubation="" with="" y26732="" partially="" abrogates="" the="" migration="" defect.="" ***p="" <="" 0.0005="" (anova),=""><0.0001 (unpaired="" student's="" t-test).="" (e)="" podocyte="" attachment="" assay="" shows="" decreased="" attachment="" of="" myo9ar701x/þ="" (het)="" podocytes;="" preincubation="" with="" y26732="" corrects="" the="" attachment="" defect.=""><0.0005 (anova).="" (d,e)="" data="" are="" mean±sd,="" n="3" to="" 4="" independent="" experiments,="" n="" ¼="" 3="" mice="" per="" genotype="" per="" experiment.="" (f)="" podocyte="" migration="" assay:="" small="" interfering="" rna="" (sirna)–mediated="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" migration=""><0.05, anova;=""><0.01, unpaired="" t-test),="" whereas="" migration="" of="" nontargeting="" (n-t)="" sirna-treated="" podocytes="" is="" not="" different="" from="" normal="" podocytes="" (wt).="" (g)="" attachment="" assay:="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" attachment,="" as="" compared="" to="" podocytes="" treated="" with="" nontargeting="" sirna="" and="" untreated="" wt="" podocytes.="" myo9akd="" data="" are="" mean±sd,="" n="" >="" 3="" independent="" experiments.=""><0.05,><0.01. hom,="" homozygous;="" ns,="" not="" significant;="" od,="" optical="">

Ein wichtiges Ergebnis dieser Studie ist, dass heterozygote Myo9AR701X/þ-Knock-in-Mäuse bei der Geburt phänotypisch normal sind, aber im Alter von 4 Monaten Albuminurie, FSGS und Podozyten-FPE entwickeln, was zeigt, dass p.Arg701* Myo9A eine FSGS-verursachende Mutation in ist erwachsene Mäuse. Bemerkenswerterweise rekapitulieren die histologischen und ultrastrukturellen Veränderungen der Myo9AR701X/þ-Mutantennieren die diagnostischen Merkmale der Nierenbiopsie des Probanden. Darüber hinaus entwickeln mutierte Myo9AR701X/þ-Mäuse eher eine signifikante Albuminurie als eine massive Albuminurie, was die nicht nephrotische Proteinurie reproduziert, die bei den Geschwistern der Probanden und bei vielen FSGS-Patienten im Erwachsenenalter beobachtet wurde.50 Es wurde vermutet, dass eine Myo9A-Deletion eine glomeruläre Sklerose als Folge einer polyurischen Tubulopathie verursachen kann .15 Unkonventionelle Myosine wurden durch ihre Wechselwirkungen mit Dab2 und Cubilin mit der Albuminreabsorption durch proximale Tubuli in Verbindung gebracht, aber eine Beteiligung von Myo9A an diesem Prozess wurde nicht nachgewiesen.51 Wir fanden keine Hinweise auf Tauopathien wie Polyurie, tubuläre Dilatation, Atrophie oder abnormale Verteilung von proximalen oder distalen tubulären Markern in erwachsenen heterozygoten Myo9AR701X/þ-Mäusen. Diese Daten stützen nicht die Hypothese, dass die bei Myo9AR701X/þ-Mäusen beobachtete FSGS auf Obstruktion oder tubuläre Defekte zurückzuführen ist.

Mechanistisch haben wir festgestellt, dass die Myo9A-mRNA und das Myo9A-Protein in voller Länge um w50 Prozent reduziert sind, was stark darauf hindeutet, dass die Mutation aufgrund des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfalls zu einer Myo9A-Haploinsuffizienz führt Die Regulierung folgt den Standardregeln des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfalls für das Verkürzen von Mutationen, die sich stromaufwärts des vor dem letzten Exons befinden.42,52 In Übereinstimmung damit wurden bei homozygoten Myo9AR701X/R701X-Mutanten, die Myo9A-Nullmäuse nachahmen, Hydrozephalus und vorzeitiger Tod beobachtet.14 Das haben wir festgestellt w50-prozentige Reduktion der Myo9A-Proteinexpression in Myo9AR701X/þ-mutierten Nieren und primären Podozyten sowie in immortalisierten Myo9AKD-Podozyten verringert proportional die Wechselwirkung zwischen Myo9A, Aktin und Calmodulin. Diese Ergebnisse stützen die Interpretation, dass Myo9A-Haploinsuffizienz die Grundlage für die reduzierte Myo9A-Aktin-Calmodulin-Interaktion ist, die bei Myo9AR701X/þ-Mutanten beobachtet wurde.

Ein entscheidendes Ergebnis dieser Arbeit ist, dass p.Arg701* Myo9A einen Verlust der Rho-GAP-Funktion induziert, was zu einer erhöhten aktiven RhoA in ganzen Myo9AR701X-Nieren, isolierten Glomeruli und primären Podozyten führt. Darüber hinaus zeigen mutierte Myo9AR701X/þ-Podozyten eine RhoA-abhängige reduzierte Anheftung und Beweglichkeit. Die Myo9A-GAP-Signalgebung reduziert das aktive RhoA und hat wenig Einfluss auf Rac1 und Cdc42.9,53 Der Rho-GAP-Funktionsverlust nimmt zuRho-GTPase-Aktivitätund führt zu Podozytenverletzungen, Proteinurie und FSGS.3,18,20 Somit kann das abnormale Verhalten von Myo9AR701X/þ-mutierten Podozyten im Laufe der Zeit zur Entwicklung von FPE und FSGS in Myo9AR701X/þ-Mäusen beitragen. Unsere Daten stimmen mit der berichteten Wirkung einer RhoA-Dysregulation auf die Podozytenfunktion in vivo und in vitro überein. 54–56

Da Myo9A Aktin vernetzt und die Bildung von Aktinbündeln in vitro in regelmäßigen 36- nm-Intervallen durch kooperative Wechselwirkung mit Aktin und Calmodulin induziert, wird angenommen, dass die Stöchiometrie ihrer Wechselwirkung entscheidend ist.16 Daher ist Myo9A-Haploinsuffizienz wahrscheinlich um Myo9A-vermittelte Aktin-Vernetzungen und -Bündel zu verringern, wodurch weniger Stellen entlang der Aktinfilamente bereitgestellt werden, an denen eine RhoA-Inaktivierung auftritt, wodurch die Aktindynamik in unmittelbarer Nähe und das Podozytenverhalten auf zellulärer Ebene verändert werden. Der Rho-assoziierte Kinase-Inhibitor Y27632 stellte den durch Myo9AR701X/þ induzierten Bindungs- und Migrationsdefekt teilweise wieder her, was darauf hindeutet, dass zusätzliche nachgeschaltete RhoA-Effektoren wie mDia1 beteiligt sind. Alternativ können verringerte Aktin-Quervernetzungen in Myo9AR701X/þ direkt dazu beitragen, die Anhaftung und Migration von Podozyten zu beeinträchtigen. Eine Myo9A-Haploinsuffizienz könnte auch die Transportmechanismen beeinflussen.7–9 Die genauen molekularen Mechanismen, durch die Myo9A die Podozyten-Aktin-Dynamik reguliert, müssen noch aufgeklärt werden. Zusammenfassend identifizierten wir Myo9A als eine neue Komponente des Podozyten-Zytoskelettapparats und eine unsinnige MYO9A-Mutation, die MYO9A als Kandidatengen für menschliches FSGS impliziert, indem wir den menschlichen Proteinurie-/FSGS-Phänotyp in Myo9AR701X/þ-Knock-in-Mäusen und autosomal reproduzierten dominante Cosegregation des Phänotyps in einer kleinen Verwandtschaft. Insgesamt weisen die Daten stark darauf hin, dass Myo9A-Haploinsuffizienz die molekulare Grundlage für den bei erwachsenen Myo9AR701X/þ-Mäusen beobachteten Phänotyp ist. Wir haben gezeigt, dass Anheftung und Migration in Myo9AR701X/þ-Podozyten mit Knockin-Mutation beeinträchtigt sind, was sowohl eine erhöhte RhoA-Aktivität als auch eine verringerte Myo9A-Aktin-Calmodulin-Interaktion beinhaltet. Angesichts der Tatsache, dass Myo9A die Quervernetzung und Bündelung von Aktin in einem Molverhältnis von 1:1 induziert16 und unserer Beobachtung, dass Myo9AR701X/þ zu Haploinsuffizienz, Podozytenauslöschung und FSGS-Überstunden führt, spekulieren wir, dass Myo9A für die normale Aktindynamik von Podozyten entscheidend sein könnte, ähnlich wie andere Aktin-bindende Proteine ​​(ACTN4, INF2), von denen bekannt ist, dass sie bei Erwachsenen autosomal dominante FSGS verursachen, wenn sie mutiert sind. Zusätzliche Studien sind gerechtfertigt, um aufzuklären, wie Myo9A mit Podozyten-RhoA, Zytoskelett- und Schlitzdiaphragma-Proteinen interagiert und ob Myo9A-vermittelte Defekte in der Aktin-Quervernetzung und Bündelbildung die Struktur des Podozyten-Zytoskeletts direkt verändern. Zu den Einschränkungen dieser Studie zum Nachweis der Kausalität gehören die Unfähigkeit, den Stammbaum des Probanden-Genotyps zu erweitern, und das Fehlen zusätzlicher Verwandter mit derselben Mutation. Weitere Studien sind notwendig, um unsere WES-Ergebnisse bei weiteren Patienten mit familiärer oder sporadischer FSGS vor p.Arg701 zu validieren*MYO9A-Varianteals krankheitsverursachend angesehen werden und diese Informationen können für die klinische Entscheidungsfindung verwendet werden.

OFFENLEGUNG

Alle Autoren erklärten keine konkurrierenden Interessen.

DANKSAGUNGEN

Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Institutes of Health für AT (NIH-RO1DK109434) und das Yale Center for Mendelian Genomics (NIH-U54-HG006504) unterstützt.

Wir danken M. Saleem (University of Bristol, UK) für die Bereitstellung immortalisierter menschlicher Podozyten, G. Moeckel (Yale School of Medicine, Department of Pathology) für die Bereitstellung von Biopsiebildern, S. Ishibe Lab (Yale School of Medicine, Department of Medicine/ Nephrologie) für Beratung zu Podozyten-Isolierung und Adhäsionsassay, T. Ardito (Yale School of Medicine, Department of Pathology) und V. Kakade (Yale School of Medicine, Department of Medicine/Nephrology) für Beiträge zu IF

und konfokale Bildgebung, SueAnn Mentone (Yale School of Medicine, Department of Cell and Molecular Physiology) für Beiträge zu EM-Studien,fokale segmentale GlomerulosklerosePatienten und Familien und das National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Repository (FSGS-CT, NCT00135811) für die Bereitstellung von DNA-Proben.

ERGÄNZUNGSMATERIAL

Ergänzende Datei (PDF)

Ergänzende Methoden. WES- und Bioinformatik-Datenanalyse, Generierung von Knock-in-Myo9AR701X-Mäusen und andere detaillierte Methoden.

Abbildung S1. Immuno-EM lokalisiert die Myo9A-Expression in glomerulären Podozyten und tubulären Epithelien der Maus.

Abbildung S2. Myo9AR701X/R701X verursacht bei Neugeborenen einen progressiven Hydrozephalus.

Abbildung S3. Postnatale Nierenhistologie bei Mäusen mit Myo9AR701X-Mutation.

Abbildung S4. Podozyten-Migrationsassay (Wundassay).

Tabelle S1. Liste aller Varianten, die von Probandengeschwistern geteilt werden.

Tabelle S2. Liste von 64 FSGS-Proteinurie-NS-Genen, die in der FSGS-CT-Kohorte abgefragt wurden. Ergänzende Referenzen.

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Copyright ª 2021, Internationale Gesellschaft für Nephrologie. Veröffentlicht von Elsevier Inc. Dies ist ein Open-Access-Artikel unter der Lizenz CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Korrespondenz: Alda Tufro, Abteilung für Pädiatrie/Nephrologie, Yale University School of Medicine, 333 Cedar Street, New Haven, Connecticut 06520, USA. E-Mail: alda.tufro@yale.edu 6 Derzeitige Zugehörigkeit: Nephrologie, Children's National Hospital, Washington, DC, USA. 7 Aktuelle Zugehörigkeit: Nephrologie, Hospital for Sick Children, University of Toronto, Toronto, Ontario, Kanada. Eingegangen am 21. Mai 2020; überarbeitet am 4. Dezember 2020; angenommen 10. Dezember 2020; online veröffentlicht am 4. Januar 2021