Glukose übt eine anti-melanogene Wirkung durch indirekte Inaktivierung von Tyrosinase in Melanozyten und einem Äquivalent der menschlichen Haut aus

Abstrakt:

Zucker sind in Organismen allgegenwärtig und bekannte kosmetische Inhaltsstoffe zur Befeuchtung der Haut mit minimalen Nebenwirkungen. Glukose, ein Einfachzucker, der lebenden Zellen als Energiequelle dient, wird häufig in Hautpflegeprodukten verwendet. Mehrere Berichte haben gezeigt, dass Zucker und zuckerverwandte Verbindungen antimelanogene Wirkungen auf Melanozyten haben. Der zugrunde liegende molekulare Mechanismus, durch den Glukose die Melaninsynthese hemmt, ist jedoch unbekannt, obwohl Glukose sowohl als aufhellender als auch als feuchtigkeitsspendender Inhaltsstoff in Kosmetika verwendet wird. Hier fanden wir heraus, dass Glukose den Melaningehalt von -Melanozyten-stimulierendem Hormon (MSH)-stimulierten B16-Zellen und dunkel pigmentierten normalen menschlichen Melanozyten ohne Anzeichen von Zytotoxizität signifikant reduzierte.

Darüber hinaus zeigte die topische Behandlung von Glukose ihre Aufhellungswirksamkeit durch Fotografie, Fontana-Masson (F&M)-Färbung und Multiphotonenmikroskopie in einem pigmentierten 3D-Modell der menschlichen Haut, MelanoDerm. Glukose veränderte jedoch nicht die Genexpression oder die Proteinspiegel wichtiger melanogener Proteine ​​in Melanozyten. Während Glukose die intrazelluläre Tyrosinase-Aktivität in Melanozyten stark verringerte, verringerte sie die Pilz-Tyrosinase-Aktivität in einem zellfreien experimentellen System nicht. Glucose wurde jedoch zu Milchsäure metabolisiert, die die Tyrosinase-Aktivität stark unterdrücken kann. Daraus schlossen wir, dass Glucose indirekt die Tyrosinase-Aktivität durch Umwandlung in Milchsäure hemmt, was ihre anti-melanogene Wirkung in Melanozyten erklärt.

Aufhellende Tyrosinase ist ein Schlüsselenzym bei der Synthese von Melanin. Gesamtglykoside von Cistanche Deserticola – eine Verbindung, die aus der natürlichen chinesischen Kräutermedizin Cistanche Deserticola isoliert wurde, kann die Aktivität von Tyrosinase signifikant herunterregulieren. Der Effekt ist eine kompetitive reversible Hemmung, die die Pigmentierung der Haut, einen großartigen Schönheitseffekt, effektiv hemmen kann. Die experimentellen Daten zeigten Folgendes: Wenn die Konzentration der Gesamtglykoside von Cistanche deserticola im Bereich von 0.5-3.0 mg·mL-1 lag, wirkte es hemmend Wirkung auf die Aktivität von Tyrosinase, und eine gute Dosis-Wirkungs-Beziehung wurde im Bereich von 0.5-2.0 mg·mL-1 gefunden.

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Schlüsselwörter:

Melanogenese; Zucker; Glucose; Tyrosinase; Äquivalent zur menschlichen Haut

1. Einleitung

Die Melanogenese ist der Prozess der Melaninproduktion und ist für den Hautschutz unerlässlich. Melanin absorbiert ultraviolettes (UV) Licht und schützt die Haut vor den schädlichen Auswirkungen von UV-Licht und freien Radikalen [1]. Da jedoch eine übermäßige Produktion von Melanin Hyperpigmentierung wie Sommersprossen und Lentigo verursacht, die als unästhetisch angesehen werden können, wurde viel Forschung darauf verwendet, wirksame depigmentierende Inhaltsstoffe für Kosmetika oder Medikamente zu finden [2–4].

Zucker ist ein starkes Feuchthaltemittel zur Hautbefeuchtung und wird als kosmetischer Inhaltsstoff zur Befeuchtung der Haut mit minimalen Nebenwirkungen verwendet. Darüber hinaus beeinflussen Zucker und zuckerverwandte Wirkstoffe die Melanogenese [5,6]. Die Glykosylierung von Tyrosinase, einem Schlüsselenzym, das an der Melaninsynthese beteiligt ist, kann verändert werden, wodurch seine katalytische Aktivität gehemmt und sein Abbau beschleunigt wird [7]. Die Rolle von Zuckern bei der Melanogenese wurde durch Studien hervorgehoben, die die Wirkung der Glykosylierung auf den Pigmentierungsphänotyp von Melanozyten und die Rolle von Zuckerresten auf die katalytische Aktivität von Tyrosinase untersuchten [5–7]. Einige Studien haben berichtet, dass Zuckerderivate die Tyrosinase-Reifung hemmen und ihre Glykosylierung beeinflussen können. Beispielsweise stört N-Acetylglucosamin (NAG), eine Aminohexose, die physiologisch durch Anfügen einer Aminogruppe an Glucose entsteht, die Tyrosinase-Glykosylierung, was zu depigmentierenden Effekten in Meerschweinchenhaut und menschlicher Haut führt [8].

Darüber hinaus haben neuere Studien gezeigt, dass zuckerverwandte Verbindungen die Tyrosinase-Expression oder -Aktivierung hemmen sowie ihre Glykosylierung verändern. Beispielsweise haben wir die aufhellende Wirksamkeit von Galacturonsäure (GA) bewertet, einer Zuckersäure, die eine oxidierte Form von Galactose und der Hauptbestandteil von Pektin ist. Galacturonsäure übt eine aufhellende Wirkung durch die Regulierung der Tyrosinase-Aktivität und -Expression in B16-Mäuse-Melanomzellen und einem menschlichen Hautäquivalent aus [9]. In einem anderen Bericht zeigte eine neue Art von zyklischem Oligosaccharid, bekannt als zyklische Nitrosylnigerose (CNN), eine schwache, aber signifikante direkte hemmende Wirkung auf die enzymatische Aktivität von Tyrosinase, was auf einen möglichen Mechanismus der Hypopigmentierung hindeutet [10]. Ähnlich wie bei der Tyrosinase-Reifung durch richtige Glykosylierung könnte die Expression oder Aktivität von CNN ein Ziel von anti-melanogenen Wirkstoffen sein [11]. Zahlreiche antimelanogene Mittel haben jedoch schwere Nebenwirkungen, wie z. B. Vitiligo [12,13]. Es besteht daher ein großes Interesse an sichereren Depigmentierungsverbindungen.

Hier untersuchten wir die anti-melanogene Wirkung von Glukose auf B16-Mäuse-Melanomzellen und normale menschliche Melanozyten. Darüber hinaus untersuchten wir die Gewebefarbe und den epidermalen Status unter Verwendung von Gewebeschnittfärbungen eines menschlichen Hautäquivalents. Basierend auf unseren Ergebnissen schlagen wir vor, dass die aufhellende Wirkung von Glukose von der Milchsäureproduktion abhängt, was zu einer Tyrosinase-Inaktivierung führt.

2. Ergebnisse

2.1. Antimelanogene Wirksamkeit von Glukose in B16 und NHMs

Um die antimelanogene Wirkung von Glukose zu untersuchen, verwendeten wir zwei Arten von Melanozyten, B16-Melanomzellen (eine murine Melanomzelllinie) und normale menschliche Melanozyten (NHMs). Zuerst stellten wir fest, ob Glukose für B16-Zellen toxisch war. Glucose zeigte keine Zytotoxizität bei Konzentrationen bis zu 100 mM in B16-Zellen, wie in 1A gezeigt. Basierend auf den Zytotoxizitätsdaten wurden B16-Zellen mit verschiedenen Glucosekonzentrationen für 72 h in Gegenwart des Melanozyten-stimulierenden Hormons (MSH), einem Induktor der Melanogenese, behandelt. Wie in Abbildung 1B gezeigt, regulierte Glukose den intrazellulären Melaningehalt in dosisabhängiger Weise deutlich und signifikant herunter. Kojisäure (KA) wurde als Referenzverbindung für die Anti-Melanogenese verwendet, da sie häufig als hautaufhellender kosmetischer Inhaltsstoff verwendet wird [1,3,4]. Die Farbe der Lysate in mit Glukose behandelten Zellen war heller als die Farbe der Kontrollzellen (Abbildung 1C).

Darüber hinaus bestätigten wir, dass die Menge an Melanin, die in die Kulturmedien abgesondert wurde, abnahm und die Farbe der Medien aufhellte (Abbildung 1D). Als nächstes untersuchten wir die anti-melanogene Wirkung von Glukose auf dunkel pigmentierte NHMs. Glucose in Konzentrationen von bis zu 100 mM war bis zu vier Tage lang nicht zytotoxisch (Abbildung 1E). Als der Melaningehalt nach 4-tägiger Glukosebehandlung von NHMs bestimmt wurde, stellten wir fest, dass der Melaningehalt dosisabhängig abnahm (Abbildung 1F). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Glucose die Melaninsynthese in Melanozyten unterdrückt.

Abbildung 1. Wirkung von Glukose auf B16-Zellen und normale menschliche Melanozyten (NHMs). (A) Wirkung von Glucose auf die Lebensfähigkeit von B16-Zellen. (B) Intrazellulärer Melaningehalt in -MSH-stimulierten B16-Zellen. Die intrazellulären Melaningehalte wurden unter Verwendung von Zelllysaten bestimmt, wie im Methodenabschnitt beschrieben. (C) Die Farbe des Zelllysats. (D) Extrazelluläre Melaningehalte wurden unter Verwendung von Kulturmedien, die sekretiertes Melanin enthielten, nach gleichzeitiger Behandlung mit Glucose und -MSH für 72 h bestimmt. KA steht für Kojisäure (100 µg/mL), die als Referenzverbindung verwendet wurde. Das Foto zeigt die Farben kultureller Medien. (E) Wirkung von Glucose auf die Lebensfähigkeit von NHMs. (F) Wirkungen von Glucose auf die Melaninsynthese in NHMs. NHMs wurden mit den angegebenen Glucosekonzentrationen für 4 d behandelt, gewaschen und mit NaOH lysiert, um den intrazellulären Melaningehalt zu bestimmen. Der Melaningehalt wurde durch Absorption bei 405 nm geschätzt und durch den Gesamtproteingehalt normalisiert. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Messungen ausgedrückt (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

2.2. Aufhellungseffekt von Glukose auf ein 3D-Äquivalent menschlicher Haut

Um die antimelanogene Wirkung von Glukose weiter zu definieren, haben wir ein pigmentiertes 3D-Modell der menschlichen Haut, MelanoDerm, verwendet. Wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben, wurde Glucose 18 Tage lang topisch auf das MelanoDerm aufgetragen, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den CCK-8-Assay bestimmt. Wie in Fig. 2A gezeigt, wurde nach 18 Tagen Glucosebehandlung keine Gewebezytotoxizität beobachtet. Änderungen der Gewebefarbe wurden durch Photographie bewertet. Wie in Fig. 2B gezeigt, hatte mit Glukose behandeltes Gewebe eine hellere Farbe als mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) behandeltes Gewebe. Darüber hinaus zeigte die Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (H & E), dass Glukose keinen Gewebekollaps induziert, während die Färbung mit Fontana-Masson (F & M) zeigte, dass Glukose die Anzahl der hyperpigmentierten Melanozyten (wie durch Pfeile angezeigt) in der Basalschicht verringerte (Abbildung 2C) .

Um Änderungen im Melaningehalt weiter zu untersuchen, verglichen wir die Autofluoreszenzsignale von Melanin in den Melanozytenschichten von PBS- und Glukose-behandelten Geweben unter Verwendung der Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenz (TPEF)-Mikroskopie, wie in Abbildung 2D gezeigt. Eine Analyse dieser Bilder zeigte, dass das Melaninvolumen um etwa 36 Prozent und die TPEF-Signalintensität für Melanin im melanozytenreichen Bereich um etwa 38 Prozent in Glucose-behandelten Geweben im Vergleich zu PBS-behandelten Geweben verringert war.

Abbildung 2. Wirkung von Glukose auf das menschliche Hautäquivalent MelanoDerm. (A) Lebensfähigkeit von menschlichen Hautäquivalenten, die mit Glucose behandelt wurden. (B) Äquivalente menschlicher Haut (MelanoDerm; n=3) wurden topisch mit Glucose für 18 d behandelt und dann fotografiert. Der ∆L-Wert gibt den Helligkeitsgrad im Vergleich zu PBS-behandeltem Gewebe an. (C) H&E- und F&M-Färbung von Gewebeschnitten. Die Objektträger wurden in einer Formaldehydlösung fixiert und zum Färben in Paraffinwachs eingebettet (Maßstab, 5{{10}} µm). Schwarze Pfeile zeigen pigmentierte Melanozyten an. (D) Melanin-Bildgebung (200 × 200 × 60 &mgr;m 3 ) von menschlichen Hautäquivalenten wurde unter Verwendung von TPEF-Mikroskopie durchgeführt. Pseudogefärbte (rote) Signale zeigen Melanin an (Skalenbalken, 50 &mgr;m). Die Diagramme zeigen die Quantifizierung des Melaninvolumens und der TPEF-Signale. Die Daten werden als Mittelwert ± SD von mindestens drei unabhängigen Messungen ausgedrückt (*p < 0,05, ***p < 0,001).

2.3. Wirkung von Glukose auf die Expression melanogener Proteine ​​in Melanozyten

Um den Depigmentierungsmechanismus von Glucose in Melanozyten aufzuklären, untersuchten wir als Nächstes seine Wirkung auf die Expression melanogener Enzyme wie Tyrosinase und Tyrp-1 in B16-Zellen und NHMs. B16-Zellen wurden mit Glucose für die angegebenen Zeiten in Gegenwart von -MSH behandelt. Dann wurden die Proteinspiegel von Tyrosinase und Tyrp-1 durch Western-Blot-Assay bestimmt (Abbildung 3A). Die Expressionsniveaus von Tyrosinase und Tyrp-1 wurden zu keinem Zeitpunkt durch Glucose verringert. Darüber hinaus wurden die Transkriptspiegel von Tyrosinase durch Glucose in -MSH-stimulierten B16-Zellen nicht beeinflusst (Fig. 3B). Ähnlich wie bei B16-Zellen wurden die Proteinspiegel von Tyrosinase, Tyrp-1 und MITF nicht durch Glucose (Abbildung 3C) in mit Glucose behandelten NHM-Zellen gehemmt, und die mRNA-Spiegel von Tyrosinase und Tyrp-1 waren es auch nicht verringert, aber eher leicht erhöht durch Glucose (Abbildung 3D).

Abbildung 3. Wirkung von Glukose auf die Expression melanogener Proteine ​​in B16-Zellen und NHMs. (A, B) B16-Zellen wurden mit -MSH für die angegebene Zeit in Gegenwart oder Abwesenheit von 20 mM Glucose behandelt. Dann wurden Western Blot (A) und qRT-PCR (B) Assays durchgeführt. (C) NHMs wurden 48 h lang mit den angegebenen Glucosekonzentrationen behandelt. Dann wurde der Western-Blot-Assay durchgeführt. (D) NHMs wurden mit der angegebenen Zeit in Gegenwart von 50 mM Glucose behandelt. Dann wurden qRT-PCR-Assays durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Messungen ausgedrückt.

2.4. Wirkung von Glucose auf die Tyrosinase-Aktivität

Um den Wirkungsmechanismus von Glukose weiter zu definieren, haben wir getestet, ob es eine hemmende Wirkung auf die Pilz-Tyrosinase-Aktivität hat. Wie in Abbildung 4A gezeigt, fanden wir heraus, dass Glucose keine hemmende Wirkung auf die Pilz-Tyrosinase-Aktivität hatte, was darauf hinweist, dass Glucose die Tyrosinase-Aktivität nicht direkt beeinflusst. Als nächstes führten wir einen Assay für die gesamte intrazelluläre Tyrosinase-Aktivität unter Verwendung von Glucose-behandelten Zelllysaten sowohl von B16-Zellen als auch von NHMs durch. Interessanterweise wurde die intrazelluläre Tyrosinase-Aktivität in Glucose-behandelten B16-Zellen in Gegenwart von -MSH dosisabhängig gehemmt (Fig. 4B). In NHMs hemmte Glucose auch die intrazelluläre Tyrosinaseaktivität (Abbildung 4C). Diese Daten stützen die Möglichkeit, dass Glucose Tyrosinase in Melanozyten indirekt inaktiviert.

Abbildung 4. Wirkung von Glucose auf die Tyrosinase-Aktivität. (A) Wirkung von Glucose auf die Pilz-Tyrosinase-Aktivität in einem zellfreien System. (B, C) Zellulärer Tyrosinase-Aktivitätsassay. (B) B16-Zellen wurden 24 h lang mit den angegebenen Glucosekonzentrationen behandelt. Dann wurde der zelluläre Tyrosinase-Aktivitätsassay durchgeführt, wie im Methodenabschnitt beschrieben. (C) NHMs wurden mit 5 0 mM Glukose für die angegebene Zeit behandelt. Dann wurde der zelluläre Tyrosinase-Aktivitätsassay durchgeführt, wie im Methodenabschnitt beschrieben. Die zelluläre Tyrosinaseaktivität wurde durch den Gesamtproteingehalt normalisiert. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Messungen ausgedrückt (*p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

2.5. Tyrosinase-Inaktivierung durch die Produktion von Milchsäure in Glucose-behandelten Melanozyten

Glukose wird in den zellulären Metaboliten Laktat umgewandelt, das die Milchsäure in Lösung ist und von dem berichtet wurde, dass es bei der Behandlung von Pigmentläsionen wirksam ist [14,15]. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass Glukose in Melanozyten in Milchsäure umgewandelt wird und dass erhöhte Milchsäurespiegel die Melanogenese durch Tyrosinase-Inaktivierung hemmen. Um diese Hypothese zu bewerten, bewerteten wir zuerst die Produktion von Milchsäure in Medien von mit Glukose behandelten Melanozyten. Wie erwartet regulierte Glukose den Milchsäuregehalt in B16-Zellen-Kulturmedien signifikant hoch (Abbildung 5A). Da Milchsäure bekanntermaßen die Tyrosinase-Aktivität direkt hemmt [15], haben wir außerdem untersucht, ob Milchsäure die Pilz-Tyrosinase-Aktivität unterdrückt. Wie in Abbildung 5B gezeigt, hemmte Milchsäure im Gegensatz zu Glucose die Aktivität der Pilztyrosinase dramatisch. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Umwandlung von Glucose in Milchsäure über die Tyrosinase-Inaktivierung durch die Milchsäure eine antimelanogene Wirkung hat.

Abbildung 5. Produktion von Laktat durch Glucose und Wirkung von Milchsäure auf die Tyrosinase-Aktivität. (A) Laktatproduktion in mit Glukose behandelten B16-Zellen. (A) B16-Zellen wurden 3 Tage lang mit den angegebenen Glukosekonzentrationen behandelt. Dann wurde ein Laktatassay unter Verwendung der Kulturmedien durchgeführt, wie im Methodenabschnitt beschrieben. (B) Wirkung von Milchsäure auf die Pilz-Tyrosinase-Aktivität in einem zellfreien System. Die Daten werden als Mittelwert ± SD von mindestens drei unabhängigen Messungen ausgedrückt (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001) .

3. Diskussion

Zucker oder von Zucker abgeleitete Materialien werden häufig als kosmetische Inhaltsstoffe zum Schutz der Haut und zur physiologischen Kontrolle verwendet. Beispielsweise erhöht Raffinose die mTOR-unabhängige Autophagie und reduziert den Zelltod in UVB-bestrahlten Keratinozyten, was darauf hindeutet, dass der natürliche Wirkstoff Raffinose einen potenziellen Wert bei der Begrenzung von Lichtschäden hat [16]. Trehalose und Saccharose sind neuartige Aktivatoren der Autophagie in menschlichen Keratinozyten über einen mTOR-unabhängigen Signalweg [17]. Diese Ergebnisse liefern neue Einblicke in die zuckervermittelte Regulation der Autophagie in Keratinozyten. Im Fall von Glukose wurde gezeigt, dass topische Glukose die Claudin-1- und Filaggrin-Expression in einem Mausmodell für atopische Dermatitis und Keratinozytenkultur induziert, was darauf hindeutet, dass es eine entzündungshemmende Wirkung hat, indem es die Hautbarrierefunktion repariert [18]. Darüber hinaus hemmt Glukose die Proliferation und fördert die Differenzierung von Hautkeratinozyten [19]. Daher reguliert Glukose verschiedene Aspekte der epidermalen Physiologie, wie beispielsweise Hautbarrierefunktionen und Keratinozyten-Hydratationsniveaus.

Zucker können über verschiedene Mechanismen, an denen Tyrosinase beteiligt ist, als depigmentierende Mittel wirken. Beispielsweise hemmen einige Wirkstoffe die Tyrosinase-Reifung, während andere Wirkstoffe die Hemmung der Tyrosinase-Genexpression oder -Aktivität induzieren [5,8–10]. Allerdings haben nur wenige Studien die Mechanismen untersucht, die den Depigmentierungseffekten von Glukose zugrunde liegen.

Um die Wirkung von Glukose auf die Melanogenese zu bestimmen, konzentrierten wir uns zuvor auf Leber-X-Rezeptoren (LXRs), bei denen es sich um Liganden-aktivierte Kernrezeptoren handelt, die eine zentrale Rolle im Fettstoffwechsel und in der Cholesterin-Homöostase spielen [20]. Wir fanden heraus, dass die Aktivierung des Leber-X-Rezeptors die Melanogenese durch die Beschleunigung des durch extrazelluläre signalregulierte Kinase (ERK) vermittelten Abbaus des Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktors (MITF) hemmt [21].

Darüber hinaus ist Glucose ein endogener LXR-Ligand [22]. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass Glukose aufgrund der Aktivierung eines LXR-abhängigen Signalwegs antimelanogene Wirkungen hat. Wie in 3C gezeigt, veränderte Glucose jedoch nicht die Expressionsniveaus von Tyrosinase oder MITF, obwohl die LXR-Aktivierung die Expressionsniveaus dieser Proteine ​​in Melanozyten verringerte. Daher schlossen wir, dass Glukose unabhängig von der LXR-Aktivierung depigmentierende Wirkungen auf Melanozyten hatte.

Glukose ist das Hauptsubstrat für die Energieerzeugung und wird durch serielle Reaktionen mehrerer Enzyme, die als Glykolyse bekannt sind, hydrolysiert. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Glykolyse nur ein Endprodukt hat, Milchsäure, ob unter aeroben oder anaeroben Bedingungen. Unter aeroben Bedingungen (O2) wird Laktat als Substrat der mitochondrialen Laktatdehydrogenase (MLD) verwertet. LDHs wandeln es in Pyruvat um, das in den Tricarbonsäure(TCA)-Zyklus eintritt. Unter anaeroben Bedingungen (N2) wird Laktat im Zytosol angereichert. Daher beginnt der Glykolyseweg mit Glukose als Substrat und endet mit der Produktion von Laktat als Hauptendprodukt [23]. Außerdem haben David et al. maßen den Anteil von Glukose, der in Milchsäure oder Pyruvat in normalen menschlichen Melanozyten umgewandelt wurde [24]. Die meisten Metaboliten von Glucose waren eher Milchsäure als Pyruvat.

Milchsäure ist eine Alpha-Hydroxysäure (AHA); diese Säuren werden häufig in kosmetischen Formulierungen als oberflächliche Peelingmittel verwendet [25]. Darüber hinaus unterdrückt Milchsäure die Melaninbildung durch direkte Hemmung der Tyrosinaseaktivität, eine Wirkung, die unabhängig von ihrer Säurenatur ist, was bedeutet, dass die Wirkungen von Milchsäure auf Pigmentläsionen nicht nur auf die Beschleunigung des epidermalen Zellumsatzes, sondern auch auf die direkte Hemmung der Melaninbildung zurückzuführen sind Melanozyten [15]. Daher schlussfolgerten wir, dass Glukose ihre anti-melanogene Wirkung über die Milchsäureproduktion ausüben könnte, da Glukose in Milchsäure umgewandelt werden kann.

Wie erwartet stellten wir fest, dass die Glukosebehandlung zu einer Milchsäureproduktion in Melanozyten führte (Abbildung 5A). Darüber hinaus haben wir bestätigt, dass Milchsäure die Tyrosinase-Aktivität stark und direkt hemmt (Abbildung 5B). Usukiet al. entdeckten auch, dass Milchsäure die intrazelluläre Tyrosinase-Aktivität in B16-Zellen und menschlichen HM3KO-Zellen verringerte [15]. In dem Bericht wurden die mRNA- und Proteinspiegel von Tyrosinase und Tyrp-1 nicht durch Milchsäure beeinflusst. Zusammengenommen weisen diese Daten darauf hin, dass Glucose die Milchsäureproduktion erhöht und dass diese Milchsäure die Tyrosinaseaktivität direkt hemmt, ohne die Genexpressionsniveaus zu beeinflussen, was darauf hinweist, dass Glucose eine antimelanogene Wirkung in Melanozyten über eine indirekte Tyrosinaseinaktivierung in Abhängigkeit von der Milchsäureproduktion hat. Es sind jedoch weitere Experimente erforderlich, um die Rolle von Milchsäure und Glukose bei der Depigmentierung zu validieren.

Die gesammelten Daten aus dieser Studie liefern vorläufige Beweise, die den Nutzen von topischer Glukose als wirksames Bleichmittel sowie als feuchtigkeitsspendendes Reagenz unterstützen, das sicher in Kosmetika und medizinischen Formulierungen verwendet werden kann.

4. Materialien und Methoden

4.1. Materialien

D-Glucose, -MSH, Kojisäure (KA), L-Tyrosin, L-DOPA und Milchsäure wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Antikörper gegen Tyrosinase und Actin wurden von Abcam (Cambridge, UK) erworben. Antikörper gegen Tyrp-1 wurden von Santa Cruz Biotechnology (CA, USA) bezogen. Antikörper gegen MITF wurden von Proteintech (Stadt, IL, USA) bezogen.

4.2. Zellkultur- und Lebensfähigkeitsassay

Wir kauften B16-Mäusemelanomzellen, Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und fötales Rinderserum (FBS) von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). B16-Zellen wurden in DMEM kultiviert, das 4500 mg/l hohe Glukose (ATCC 30-2002) enthielt, wie vom Hersteller empfohlen (ATCC), ergänzt mit 5 % FBS, und bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 95 % Luft und inkubiert 10 Prozent CO2. Dunkel pigmentierte primäre NHMs wurden von Thermo Fisher Scientific (#C2025C; Waltham, MA, USA) bezogen. Die Zellen wurden in Medium 254 (#M254500), ergänzt mit Human Melanocyte Growth Supplement (#S0025), kultiviert und bei 37 °C unter einer 5-prozentigen CO2-Atmosphäre inkubiert. Für Experimente wurden primäre NHMs zwischen den Passagen 4 und 7 verwendet. Die Lebensfähigkeit der kultivierten Zellen wurde mit einem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) wie vom Hersteller beschrieben (DOJINDO, Tokyo, Japan) bewertet.

4.3. Messung des Melaningehalts

Der Melaningehalt wurde wie in früheren Berichten beschrieben bestimmt [2–4]. Kurz gesagt wurden B16-Zellen mit den angegebenen Glucosekonzentrationen in Gegenwart von -MSH (200 nM) für 72 h behandelt. NHMs wurden 4 Tage lang mit den angegebenen Glukosekonzentrationen behandelt. Danach wurden alle Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in 1 N NaOH bei 60 °C für 1 h gelöst. Zelllysate wurden auf eine 96-Well-Platte übertragen und die Extinktion wurde bei 405 nm gemessen. Die Werte wurden basierend auf den Proteinkonzentrationen in jeder Probenvertiefung normalisiert.

4.4. Pilz-Tyrosinase-Aktivitätsassay

Wir untersuchten die direkten Wirkungen der angegebenen Glukosekonzentrationen auf die Pilztyrosinaseaktivität. Kurz gesagt, 100 ul Phosphatpuffer, der Glucose enthielt, wurde mit Pilztyrosinase (10 Einheiten/Vertiefung) gemischt und mit 50 ul 0,03 % L-Tyrosin oder L-DOPA in destilliertem Wasser kombiniert. Dann wurde die Mischung zusammen bei 37°C für 10 min inkubiert und die Extinktion wurde bei 405 nm gemessen. Als Referenzverbindung wurde Kojisäure (KA), ein bekanntes Anti-Tyrosinase-Mittel, verwendet.

4.5. Intrazellulärer Tyrosinase-Aktivitätsassay

Kurz gesagt wurden B16-Zellen oder NHMs mit den angegebenen Glucosekonzentrationen für die angegebenen Zeiten behandelt. Dann wurden die Zellen mit PBS gewaschen und durch Inkubation in 5 0 mM Phosphatpuffer (pH 6,8), der 1 Prozent Triton X-100 und 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt, lysiert. Zelllysate wurden dann bei 12, 000 U/min bei 4 ◦C für 20 min zentrifugiert. Der zelluläre Tyrosinase enthaltende Überstand wurde gesammelt und der Proteingehalt zur Normalisierung bestimmt. Der Zellextrakt wurde mit L-DOPA in Phosphatpuffer inkubiert und die Dopachrombildung wurde durch Messung der Extinktion bei 405 nm innerhalb von 30 min überwacht.

4.6. RNA-Isolierung und quantitative Echtzeit-Reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR)

Zur Bestimmung der relativen mRNA-Expression ausgewählter Gene wurde Gesamt-RNA mit TRIzol (Invitrogen, CA, USA) nach Herstellerangaben isoliert und 4 µg RNA mittels RT-Premix (Bioneer, Seoul, South Korea). Quantitative PCR wurde mit einem ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Die qRT-PCR-Primer-Sets für Tyrosinase und Tyrp-1 wurden von Applied Biosystems erworben, und TaqMan Gene Expression Assay-Kits (Applied Biosystems) wurden zur Amplifikation verwendet. Die Zielgenexpression wurde auf die des Housekeeping-Gens normalisiert, das die ribosomale Protein-Lateral-Stalk-Untereinheit P0 (RPLP0) kodiert. Die relative Quantisierung wurde mit der vergleichenden ∆∆Ct-Methode gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

4.7. Western-Blotting

Die Zellen wurden zweimal mit kaltem PBS gewaschen und dann in eiskaltem modifiziertem RIPA-Puffer (Cell Signaling Technology, MA, USA) lysiert, der Protease-Inhibitoren (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) enthielt. Die Gesamtproteinkonzentration wurde bestimmt, und die Proteine ​​wurden durch SDS-PAGE auf Bis-Tris-Gelen mit 4–12 Prozent Gradienten (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) aufgelöst und auf Nitrozellulosemembranen (Thermo Fisher Scientific) übertragen. Nach dem Transfer wurden die Membranen in einer 5-prozentigen Blockierungslösung blockiert. Die Membranen wurden 24 h bei 4 °C mit primären Antikörpern inkubiert, mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (TBST) gewaschen und 1 h Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörpern ausgesetzt bei Raumtemperatur. Die Membranen wurden dreimal mit TBST gespült. Unter Verwendung von Western-Blotting-ECL-Reagenz (GE Healthcare, Hatfield, UK) wurde ein chemilumineszentes Signal entwickelt.

4.8. Dreidimensionales (3D) menschliches Hautäquivalent

Wir verwendeten MelanoDerm (MEL-300-B; MatTek Corp., Ashland, MA, USA) als menschliches Hautgewebemodell. Dieses lebensfähige, rekonstituierte menschliche 3D-Hautäquivalent stammt von schwarzen Spendern und enthält normale Melanozyten und Keratinozyten. MelanoDerm wurde an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche in EPI-100-NMM-113-Medium (MatTek Corp, Ashland, MA, USA) gezüchtet. Vor der Glucosebehandlung wurden die Gewebe mit 1 ml PBS gewaschen, um restliche Verbindungen zu entfernen. Glucose wurde in PBS gelöst. Die Endkonzentration von Glucose betrug 2 Prozent. Die Kontrollprobe wurde nur mit PBS behandelt. Glucose wurde an den Tagen 1, 4, 6, 8, 11, 13 und 15 auf MelanoDerm aufgetragen. Nach 18 Tagen wurden MelanoDerm-Gewebe in 4 % gepuffertem Formaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet, auf eine Dicke von 3 µm geschnitten und ausgesetzt nach H&E- und F&M-Färbung. Die Lebensfähigkeit der Gewebeproben wurde mit einem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) wie vom Hersteller (DOJINDO, Tokio, Japan) beschrieben beurteilt. Die Pigmentierung des MelanoDerm wurde durch Vergleich der Veränderung des L*-Wertes beurteilt.

4.9. Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenz (TPEF)-Bildgebung

Um die Verteilung von Melanin im 3D-Äquivalent der menschlichen Haut zu visualisieren, führten wir eine TPEF-Bildgebung durch, wie in unseren früheren Berichten beschrieben [3,4]. Kurz gesagt wurde jede MelanoDerm-Zubereitung in 4 % Formalin für 24 h bei 4 °C fixiert und dann mit PBS/0,1 % BSA (Rinderserumalbumin, Merck, Branchburg, NJ, USA) gewaschen. Die TPEF-Bilder wurden von der Basalschicht aufgenommen, um das intrazelluläre Melanin in der Melanozytenschicht zu messen. Relative TPEF-Signalintensitäten für Melanin im Messvolumen wurden unter Verwendung der Image-Pro Premier 3D-Software (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA) quantifiziert.

4.10. L-Lactat-Assay

B16-Zellen wurden mit 1,0 × 105 Zellen pro Vertiefung in einer 12--Well-Platte ausgesät. Nach 3-tägiger Behandlung mit Glucose wurden die extrazellulären Laktatspiegel unter Verwendung eines kolorimetrischen L-Lactat-Testkits (Abcam, ab65331, Cambridge, UK) gemäß dem Protokoll des Herstellers quantifiziert.

4.11. Statistische Analyse

Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichungen (Standardabweichungen) ausgedrückt, und die statistische Signifikanz wurde durch den Student-t-Test bestimmt. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Autorenbeiträge:

Konzeptualisierung, H.-JK, JL und CSL; Datenpflege, SHL; Untersuchung, SHL; Methodik, SHL, I.-HB und E.-SL; Aufsicht, JL und CSL; Schreiben – Originalentwurf, SHL und CSL; Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, JL Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Finanzierung:

Diese Forschung wurde vom Basic Science Research Program durch die National Research Foundation of Korea (NRF) finanziert, die vom Bildungsministerium finanziert wurde (Fördernummer: 2018R1D1A1B07049402).

Interessenskonflikte:

Die Autoren geben keinen Interessenkonflikt an.

Abkürzungen

-MSH -Melanozyten-stimulierendes Hormon

Tyrp-1-Tyrosinase-verwandtes Protein 1

MITF-Mikrophthalmie-assoziierter Transkriptionsfaktor

NHMs sind normale menschliche Melanozyten

TPEF-Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenz

LXR-Leber-X-Rezeptor

AHAs Alpha-Hydroxysäuren

H&E Hämatoxylin und Eosin

F&M Fontana-Masson

Verweise

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