Natalenamide A–C, cyclische Tripeptide aus der Termite-assoziierten Actinomadura sp. RB99

Abstrakt:

In den letzten Jahren haben Untersuchungen zur Biochemie von insektenassoziierten Bakterien zugenommen. In Kombination mit analytischen Dereplikationsprozessen bieten diese Studien eine leistungsstarke Strategie zur Identifizierung strukturell und/oder biologisch neuer Verbindungen. Nicht ribosomal synthetisierte zyklische Peptide haben ein breites Bioaktivitätsspektrum mit hohem medizinischem Potenzial.

Hier berichten wir über die Entdeckung von drei neuen cyclischen Tripeptiden: Natalenamide A–C (Verbindungen 1–3). Diese Verbindungen wurden aus der Kulturbrühe der pilzwachsenden Termiten-assoziierten Actinomadura sp. identifiziert. RB99 unter Verwendung einer auf Flüssigchromatographie (LC)/Ultraviolett (UV)/Massenspektrometrie (MS) basierenden Dereplikationsmethode. Die chemischen Strukturen der neuen Verbindungen (1–3) wurden durch Analyse umfassender spektroskopischer Methoden ermittelt, darunter eindimensionale (1H und 13C) und zweidimensionale (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC) Kernmagnetismus Resonanzspektroskopie (NMR), zusammen mit Daten der hochauflösenden Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (HR-ESIMS). Die absoluten Konfigurationen der neuen Verbindungen wurden unter Verwendung von Marfeys Analyse aufgeklärt. Durch mehrere Bioaktivitätstests für die Tripeptide fanden wir heraus, dass Verbindung 3 signifikante hemmende Wirkungen auf die durch 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) induzierte Melaninproduktion aufwies. Die Wirkung von Verbindung 3 war ähnlich der von Kojisäure, einer Verbindung, die ausgiebig als kosmetisches Material mit hautbleichender Wirkung verwendet wird.

Helle, glatte und zarte Haut war schon immer das Ziel orientalischer Frauen. Die Forschung und Entwicklung von Weißmachern für Hautpflegeprodukte basiert hauptsächlich auf der Hemmung der Tyrosinase-Aktivität.

Verbindungen, die Benzolringe oder phenolische Hydroxylstrukturen enthalten, haben potenzielle Aufhellungswirkungen, wie beispielsweise das derzeit allgemein verwendete Aufhellungsmittel Arbutin, das aufhellende Wirkungen ausüben kann, indem es die Aktivität von Tyrosinase hemmt.

Und wir haben festgestellt, dass Cistanche deserticola eine aufhellende Wirkung hat. Der Hauptwirkstoff von Cistanche deserticola, Phenylethanoidglykoside, ist eine Art natürlicher Glykosidverbindung. Studien haben ergeben, dass Phenylethanoidglykoside die Aktivität von Tyrosinase und die Produktion von Melanin in humanen epidermalen Melanozyten hemmen und eine aufhellende Wirkung haben können. Wirksamkeit des Mittels.

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Schlüsselwörter:

pilzwachsende Termiten; Actinomadura sp.; Tripeptide; Natalenamide A–C; hautaufhellende Wirkungen.

1. Einleitung

Die chemische Analyse von schützenden bakteriellen Symbionten von Nutzinsekten hat in den letzten Jahren viel Aufmerksamkeit unter Naturstoffchemikern auf sich gezogen [1–5]. Unter Verwendung modernster kernmagnetischer Resonanz (NMR)/Massenspektrometrie (MS)-basierter Dereplikationsverfahren und ökologisch relevanter Bioassays wurde eine beeindruckende Menge an strukturell faszinierenden Naturstoffen entdeckt, darunter mehrere nicht ribosomal synthetisierte zyklische Peptide von mikrobiellen Symbionten [6]. Zu den prominentesten Beispielen gehört das antimykotische Dentigerumycin, ein zyklisches Depsipeptid, das aus einer mit Pilzen wachsenden Ameise assoziierten Pseudonocardia sp. isoliert wurde. [7] und die Gerumycine A–C, Piperazinsäure-tragende cyclische Depsipeptide, identifiziert aus Pseudonocardia sp. [8].

Es wurde gezeigt, dass zyklische Peptide ein breites Spektrum biologischer Aktivitäten aufweisen, was mehrere Syntheseansätze für diese pharmakologisch vielversprechenden Strukturen fördert [9–12]. Derzeit werden über 40 zyklische Peptidmedikamente vermarktet und in klinischen Umgebungen weit verbreitet eingesetzt, und im Durchschnitt kommt jedes Jahr etwa ein neues zyklisches Peptidmedikament auf den Markt [13].

Als Teil unserer fortwährenden Bemühungen, strukturell neue und/oder bioaktive sekundäre Metaboliten von Termiten-assoziierten Mikroben zu identifizieren [14–17], konzentrierten wir uns auf die Termiten-assoziierte Actinomadura sp. RB99, isoliert aus der pilzzüchtenden Termite Macrotermes natalensis. Unsere auf Flüssigchromatographie (LC)/Ultraviolett (UV)/Massenspektrometrie (MS) basierende Dereplikationsstrategie führte zu potenziell neuartigen bioaktiven Naturstoffen. In dieser Studie berichten wir über die Isolierung und chemische Identifizierung von drei neuen zyklischen Tripeptiden, Natalenamid A–C (Verbindungen 1–3, Abbildung 1), unter Verwendung einer LC/UV/MS-basierten Dereplikationsmethode sowie über ihre biologischen Bewertungen für zytotoxisch , entzündungshemmende und hautaufhellende Aktivitäten.

2. Ergebnisse und Diskussion

2.1. Auf Flüssigchromatographie (LC)/Ultraviolett (UV)/Massenspektrometrie (MS) basierende Isolierung der Verbindungen 1–3

Actinomadura sp. RB99 wurde von der Oberfläche einer Termitenarbeiterin (M. natalensis) isoliert. Die phylogenetische Analyse einer nahezu vollständigen ribosomalen 16S-Ribonukleinsäure (rRNA)-Sequenz legt nahe, dass der Stamm RB99 zur Gattung Actinomadura gehört, wobei der nächste Nachbar Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T ist. Die anschließende LC/UV/MS-basierte Analyse der angereicherten Kulturextrakte ergab eine Reihe charakteristischer UV-Absorptionen mit einzigartigen Molekülionenpeaks, die Stickstoffatome enthielten.

Um die jeweiligen Metaboliten zu identifizieren und deren Aktivität zu untersuchen, wurden großtechnische Fermentation unter optimierten Wachstumsbedingungen (100 Agarplatten von 2 L ISP2-Agar, pH 6, 10 Tage bei 30 ◦C) und ein etabliertes Aufarbeitungs- und Vorreinigungsverfahren durchgeführt angewendet [17]. Die anschließende LC-UV/MS-geführte Fraktionierung und wiederholte semipräparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) führte zur Isolierung von drei Metaboliten mit einem einzigartigen NMR/MS-Muster. Wir führten Wachstums- und Medienstudien mit verschiedenen Salzen (NaCl, KBr 1–3 Prozent) und Medienzusammensetzungen (ISP1-6-Medien) durch, um die natürliche Umgebung nachzuahmen und die Metabolitenproduktion zu stimulieren, was auch zum Vorhandensein der drei neuen führte Metaboliten (siehe ergänzende Abbildung S19).

2.2. Strukturaufklärung der Verbindungen

Natalenamid A (1) wurde als amorphes Pulver erworben. Die Summenformel von 1 wurde als C19H25N3O5 aus dem natriumadduzierten Molekülion bei m/z 398,1691 [M plus Na] plus (berechnet für C19H25N3O5Na, 398,1692) unter Verwendung von hochauflösender Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie im Positiv-Ionen-Modus (HR- ESIMS)-Daten. Das Infrarot(IR)-Spektrum zeigte eine starke Absorptionsbande bei 1670 cm−1, was auf das Vorhandensein von Amidgruppen im Molekül hindeutet. Die detaillierte Analyse der 1H-NMR-Daten von 1 (Tabelle 1) zeigte die typischen Signale eines Peptidskeletts mit zwei Methylsignalen (δH 0.91 (3H, d, J=7.{{29 }} Hz, H-3) und 0.92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)), drei Methylensignale (δH 1,95 (1H, m, H-7a), 2,27 (1H, m, H-8a), 2,36 (1H, m, H-8b), 2,48 (1H , m, H{{50}}b), 2.97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{58} }a) und 3.20 (1H, dd, J=14.0, 5.0 Hz, H-12b)), vier Methinsignale (δH 2.02 (1H , m, H-2), 4.16 (1H, d, J=7.5 Hz, H-1), 4.20 (1H, dd, J=8.5, 4,5 Hz, H-6) und 4,63 (1H, dd, J=8.0, 5,0 Hz, H-11)) und fünf überlappende aromatische Protonen (δH 7,18 (1H, m, H-16), 7,23 (2H, m, H-14/18) und 7,24 (2H, m, H-15/17)).

Das 13C-NMR-Spektrum (Tabelle 1) zeigte mit Hilfe der HSQC- und HMBC-Spektren insgesamt 19 Kohlenstoffresonanzen, die für zwei Methylsignale (δC 18,9 und 19,9), drei Methylensignale (δC 27,0, 30.6 und 38.8), neun Methinsignale (δC 32.1, 55.6, 58.0, 60.4, 127.8, 129.5 (×2) und 130.6 (×2)), darunter fünf aromatische Kohlenstoffe, ein olefinischer Kohlenstoff Signal (δC 138,8) und vier Carbonylkohlenstoffsignale (δC 173,2, 173,3, 174,8 und 181,3). In Kombination mit den obigen spektroskopischen Daten zeigte eine detaillierte Untersuchung der zweidimensionalen (2D) NMR (1H-1H COSY-, HSQC- und HMBC-Experimente) das Vorhandensein von drei Aminosäuren in 1: Glutamat (Glu), Phenylalanin ( Phe) und Valin (Val) (Abbildung 2). Die Konnektivität dieser Aminosäuren wurde durch die HMBC-Korrelationen von H-1/C-5 und C-19, H-11/C-10 und C{ bestimmt. {50}} und H-6/C-5 und C-10 (Abbildung 2).

Um die absolute Konfiguration von 1 zu identifizieren, wurde Marfeys Methode angewendet, um die Stereochemie von -H-Vielfachen (C-1, C-6 und C-11) zu bestimmen. Die Säurehydrolysate von 1 und Standardaminosäuren (L/D-Glu, Phe und Val) wurden mit 1-Fluor-2,4-Dinitrophenyl-5-L-Alanin derivatisiert Amid (L-FDAA). Anschließend wurde die derivatisierte Mischung aus 1 und den Standardaminosäuren mittels LC/MS analysiert, um ihre Retentionszeit zu untersuchen. Die absoluten Konfigurationen der Glu-, Phe- und Val-Einheiten wurden alle als L-Formen bestimmt, basierend auf den Retentionszeiten der L-FDAA-Derivate von 1 im Vergleich zu denen der Standardaminosäuren. Somit wurde die Struktur von 1 als das in Abbildung 1 gezeigte cyclische Tripeptid aufgeklärt.

Natalenamid B (2) wurde als amorphes Pulver isoliert. Seine Molekularformel (C20H27N3O5) wurde von Wasserstoff- und Natriumaddukt-Molekülionenpeaks bei 390,2032 [M plus H] plus (berechnet für C20H28N3O5, 390,2029) bzw. 412,1849 [M plus Na] plus (berechnet für C20H27N3O5Na, 412,1848) abgeleitet. Verglichen mit der Summenformel und den NMR-Spektraldaten von 1 scheint Verbindung 2 eine zusätzliche CH2-Gruppe im Peptidgerüst aufzuweisen. Eine umfassende Untersuchung der eindimensionalen (1D) ( 1H- und 13C-NMR) und 2D-NMR-Spektren (1H-1H-COSY, TOCSY, HSQC und HMBC) von 2 ergab die Existenz von drei Aminosäureresten: Glu, Phe und Leu (Leucin). Die Sequenz dieser Aminosäuren wurde basierend auf den HMBC-Korrelationen von H-1/C-6 und C-20, H-12/C-11 und C konstruiert -20 und H-7/C-6 und C-11 (Abbildung 2). Um die absolute Konfiguration von 2 zu bestimmen, wurde eine Derivatisierung der Glu-, Phe- und Leu-Reste mit L-FDAA durchgeführt und dann durch LC/MS analysiert. In den LC/MS-Daten wurden L-Glu, L-Phe und L-Leu nachgewiesen, indem die Retentionszeiten für die L-FDAA-Derivate von 2 mit denen der Standardaminosäuren verglichen wurden. Somit wurde die chemische Struktur von 2 als das in Abbildung 1 gezeigte cyclische Tripeptid bestimmt.

Die HR-ESIMS-Daten im positiven Modus von Natalenamid C (3) zeigten Wasserstoff- und Natriumaddukt-Molekülionen bei 424,1870 [M plus H] plus (berechnet für C23H26N3O5, 424,1872) und 446,1694 [M plus Na] plus (berechnet für C23H25N3O5Na, 424.1692). Dies legte nahe, dass seine Summenformel C23H25N3O5 war. Eine detaillierte Analyse der 1D- und 2D-NMR-Spektren von 3 zeigte, dass seine chemische Struktur der von 2 ähnlich war, außer dass Leu in 3 durch Phe ersetzt wurde. Die Konnektivität der drei identifizierten Aminosäuren in 3 wurde unter Verwendung der HMBC-Korrelationen von verifiziert H-1/C-9 und C-23, H-15/C-14 und C-23 und H-10/ C-9 und C-14 (Abbildung 2). Durch Anwendung der Methode von Marfey auf Verbindung 3 wurden die absoluten Konfigurationen der Vielfachen von -H (C-1, C-10 und C-15) als ein L-Glu und zwei L aufgeklärt -Phe-Einheiten. Dementsprechend wurde die vollständige Struktur von 3 bestimmt, wie in Abbildung 1 gezeigt.

Die Natalenamide A–C sind tricyclische Peptide, vermutlich nicht-ribosomalen Ursprungs. Derzeit wurden mehrere bioaktive cyclische Tripeptide als Naturstoffe charakterisiert: zytotoxische 17--gliedrige cyclische Tripeptide (z. B. OF4949 I–IV), isoliert aus Penicillium rugulose [18]; antimykotische Sklerotomien A–K, identifiziert aus der Fermentationsbrühe von halotoleranten Bakterien [10]; und antiproliferatives psychrophiles E, isoliert aus einer Mischkultur zweier von Meeresalgen stammender Pilzstämme der Gattung Aspergillus [19].

2.3. Biologische Aktivitäten der Verbindungen 1-3

Da berichtet wurde, dass cyclische Peptide ein breites Spektrum an biologischen Aktivitäten aufweisen, wurden die biologischen Wirkungen der isolierten cyclischen Tripeptide ({{0}}) unter Verwendung von drei Bioaktivitäten bewertet. Die Zytotoxizität der Verbindungen 1-3 wurde gegen vier Krebszelllinien (MCE7-Brustkrebszellen, HeLa-Zervixkrebszellen, A549-Human-Lungenkrebszellen und HepG2-Leberkrebszellen) in verschiedenen Konzentrationen untersucht (0, 6.25 , 12,5, 25, 50 und 100 uM). Verbindung 1 beeinflusste die Zelllebensfähigkeit von MCF-7-, HeLa- oder A549-Zellen nicht. Die Behandlung von HepG2-Zellen mit 100 M Verbindung 1 verringerte jedoch die Zelllebensfähigkeit auf 78,5 plus 3,2 Prozent (Abbildung 3). Verbindung 2 verringerte die Zelllebensfähigkeit von HeLa- und A549-Zellen auf 82,9  2,1 Prozent bzw. 73,5=3,0 Prozent, beeinflusste aber nicht die Lebensfähigkeit von MCF-7 oder HepG2-Zellen (Abbildung 3). Verbindung 3 beeinflusste die Lebensfähigkeit keiner der Zelllinien (Abbildung 3).

Als nächstes wurden RAW264.7-Makrophagen verwendet, um die entzündungshemmenden Wirkungen der isolierten Verbindungen zu untersuchen. Um Fehler bei der Produktion von NO zu eliminieren, die durch sich ändernde Zellüberlebensraten verursacht wurden, wurden nicht-toxische Konzentrationen jeder Verbindung untersucht. Wie in Abbildung 4 gezeigt, hatten die Verbindungen 1–3 nur wenige zytotoxische Wirkungen in RAW264.7-Zellen (Abbildung 4A–C) und übten keine hemmende Wirkung auf die NO-Produktion in Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierten RAW264.7-Zellen aus (Abbildung 4D–F). .

Die inhibitorischen Wirkungen der Verbindungen 1–3 auf den Melaningehalt in B16F10-Zellen wurden als Beweis für ihre hautaufhellenden Aktivitäten untersucht (Abbildung 5). Da Änderungen der Zelllebensfähigkeit Fehler bei der Produktion und Messung von Melanin verursachen, untersuchten wir zunächst die Auswirkungen der Verbindungen 1–3 auf das Überleben von B16F10-Zellen. Die Verbindungen 1–3 übten in B16F10-Zellen bei keiner der verwendeten Konzentrationen zytotoxische Wirkungen aus (Abbildung 5A–C). Anschließend bewerteten wir die hemmenden Wirkungen der Verbindungen auf die durch 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) induzierte Melaninproduktion in B16F10-Zellen (Abbildung 5D–F). IBMX, ein bekannter Stimulator der Melanogenese, induziert eine signifikante Steigerung der Melaninproduktion nach einer einzigen Behandlung in Melanomzellen. Unter den bewerteten Verbindungen zeigte Verbindung 3 (bei 5–100 µM) dosisabhängig signifikante Hemmwirkungen auf die IBMX-vermittelte Melaninsynthese. Kojisäure, unsere positive Kontrolle, wurde ausgiebig als kosmetisches Material mit hautaufhellender Wirkung verwendet [20]. Die hemmende Wirkung von Verbindung 3 auf die IBMX-induzierte Melaninproduktion war ähnlich der von Kojisäure (Abbildung 5F), was darauf hindeutet, dass Verbindung 3 als potenter Inhibitor der IBMX-induzierten Melaninproduktion in B16F10-Melanomzellen fungiert.

Darüber hinaus war Verbindung 3 mit einer kleinen Anzahl von Verunreinigungen verunreinigt, die durch Interpretation von NMR-spektroskopischen Daten und LC/MS-Analyse als Fettsäureanaloga bestimmt wurden (Ergänzende Materialien, Abbildungen S11–S15 und S23). Um die Aktivität der Verunreinigungen zu identifizieren, wurden zusätzliche Experimente mit den Fettsäureanaloga hinsichtlich ihrer hemmenden Wirkung auf die IBMX-induzierte Melaninproduktion in B16F10-Zellen durchgeführt, die zeigten, dass die getesteten Verbindungen keine aufhellende Wirkung hatten (Ergänzungsmaterialien, Abbildung S24). Obwohl wir nicht ausschließen können, dass die Verunreinigungen in Verbindung 3 für die hemmende Wirkung auf die IBMX-induzierte Melaninproduktion verantwortlich sind, scheint dies unwahrscheinlich.

3. Materialien und Methoden

3.1. Allgemeine experimentelle Verfahren

Infrarotspektren wurden auf einem Bruker IFS-66/S FT-IR-Spektrometer (Bruker, Billerica, MA, USA) aufgenommen. Die Elektrospray-Ionisations- und HR-ESIMS-Spektren wurden auf einem SI-2/LCQ DecaXP-Flüssigchromatographie-(LC)-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemessen. NMR-Spektren, einschließlich 1H-1H-COSY-, HSQC- und HMBC-Experimenten, wurden mit einem Varian UNITY INOVA 800-NMR-Spektrometer (Varian, Palo Alto, CA, USA) durchgeführt, das bei 800 MHz (1H) und 200 MHz (13C) betrieben wurde chemische Verschiebungen in ppm (δ). Die präparative HPLC verwendete eine Waters 1525 binäre HPLC-Pumpe mit Waters 996 Photodioden-Array-Detektor (Waters Corporation, Milford, CT, USA). Silicagel 60 (230–400 Mesh, Merck, Kenilworth, NJ, USA) und RP-C18 Silicagel (230–400 Mesh, Merck, wurden für die Säulenchromatographie verwendet. Semipräparative HPLC verwendete ein Shimadzu Prominence HPLC System mit SPD{ {22}}A/20AV Series Prominence HPLC Ultraviolett–Visible (UV–Vis) Detektoren (Shimadzu, Tokio, Japan). LC/MS-Analysen wurden auf einem Agilent HPLC-System der Serie 1200 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ausgestattet mit einem Diodenarray-Detektor und einem ESI-Massenspektrometer der Serie 6130 mit einem analytischen Kinetex (4,6 × 100 mm, 3,5 µm).Vorbeschichtete Merck-Kieselgel-F254-Platten und RP-18-F254s-Platten wurden für dünne Platten verwendet -Schicht-Chromatographie (DC) Flecken wurden auf DC unter UV-Licht oder durch Erhitzen nach Besprühen mit einer Anisaldehyd-Schwefelsäure-Lösung nachgewiesen.

3.2. Mikrobielles Material

Actinomadura sp. RB99 wurde am 2. Januar von der Oberfläche einer Termitenarbeiterin der Gattung M. natalensis (Kolonie Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) isoliert { {13}}10. Das Biomaterial wurde in saubere Plastiktüten gefüllt und innerhalb eines Tages nach der Entnahme verarbeitet. Termiten wurden in sterilem deionisiertem Wasser gewaschen, und Bakterien wurden durch Ausplattieren der resultierenden Suspensionen auf nährstoffarmen Medien mit Chitin isoliert (pro Liter: 4 g Chitin, 0,7 g K2HPO4, 0,3 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4·5H2O, 0,01 g FeSO4·7H2O, 0,001 g ZnSO4, 0,001 g MnCl2 und 20 g Agar) [21]. Isolate mit Actinobakterien-ähnlicher Morphologie wurden auf ISP2-Agar (pro Liter: 10 g Malzextrakt, 4 g Hefeextrakt, 4 g Glucose und 20 g Agar) übertragen und subkultiviert, bis reine Isolate erhalten wurden.

3.3. DNA-Extraktion und Polymerase-Kettenreaktions-Amplifikation

Actinomadura sp. RB99 wurde fünf bis sieben Tage bei 30 °C in nährstoffreichem Flüssigmedium ISP2 gezüchtet. Die Zellen wurden geerntet, und genomische DNA wurde unter Verwendung des GenJet-Genom-DNA-Reinigungskits (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) nach den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Änderungen extrahiert: (a) Lysozymbehandlung wurde auf 40 min verlängert, und (b) Proteinase-K-Behandlung wurde auf 40 min ausgedehnt. DNA wurde photometrisch unter Verwendung eines Nanodrop Lite-Spektrometers (Thermo Scientific) quantifiziert.

Für phylogenetische Studien wurde das 16S-rRNA-Gen unter Verwendung des Primersets 1492R/27F amplifiziert. Jede Amplifikationsreaktion wurde in einem Endreaktionsvolumen von 25 µl hergestellt, das 7,25 µl destilliertes Wasser, 5 µl HF-Puffer, 5 µl jedes Primers (2,5 µM), {{10}},5 µl dNTPs enthielt (10 µM), 0,25 µL Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) und 2 µL extrahierte DNA (Template). Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 98 °C für 38 s; 32 Zyklen von 98 ◦ für 30 s, 52 ◦C für 45 s, 72 ◦C für 1 min 20 s; und eine Endverlängerung von 72 ◦C für 8 min. Das PCR-Produkt wurde durch Agarose-Gelelektrophorese sichtbar gemacht, und die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung eines PCR-Reinigungskits (Thermo Scientific) gereinigt. DNA-Fragmente wurden bei GATC (Konstanz, Deutschland) sequenziert.

3.4. Sequenzierung und Artenidentifikation

Die Sequenzen wurden mit BioEdit [22] auf Reinheit und Fehlpaarungen untersucht. Die für jeden Stamm erhaltenen Vorwärts- und Rückwärtssequenzen wurden mit BioEdit zusammengesetzt und unter Verwendung von DECIPHER (http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html) auf Chimären getestet. Die resultierenden Sequenzen wurden bei GenBank hinterlegt (Zugangsnummer: KY558684). Blast-Analysen mit fast vollständigen 16S-rRNA-Sequenzen (1368 bp) wurden unter Verwendung der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Referenz-RNA-Sequenzen) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass der Stamm RB99 ein Mitglied der Gattung Actinomadura ist. Sequenzen der ersten 10-Treffer wurden aus der NCBI-Datenbank heruntergeladen und mit der 16S-rRNA-Sequenz von Actinomadura sp. abgeglichen. RB99 unter Verwendung des Sina-Sequenzalignment-Dienstes [23]. Zwei verschiedene phylogenetische Bäume wurden mit Neighbour-Joining- oder Maximum-Likelihood-Algorithmen unter Verwendung der MEGA-Softwareversion 7.0.26 [24–26] rekonstruiert. Das evolutionäre Distanzmodell von Tamura und Nei wurde verwendet, um evolutionäre Distanzmatrizen für die Maximum-Likelihood- und Neighbour-Joining-Algorithmen zu generieren, wobei vollständige Lücken und fehlende Daten gelöscht wurden [27]. Für den Maximum-Likelihood-Algorithmus wurde eine diskrete Gammaverteilung verwendet (plus G), und das Ratenvariationsmodell ermöglichte, dass einige Stellen evolutionär unveränderlich sind (plus I). Für den Neighbour-Joining-Algorithmus wurde die Ratenvariation zwischen Standorten mit einer Gamma-Verteilung (plus G) modelliert. Die Konfidenzwerte der Knoten wurden durch Bootstrap-Analysen basierend auf 1000 Resampling-Schritten bewertet [28].

3.5. Extraktion und Isolierung

Actinomadura sp. RB99 wurde sieben Tage lang bei 30 ◦C (Vorkultur) in 50 ml ISP2-Brühe gezüchtet und zum Beimpfen von 100 ISP2-Agarplatten verwendet. Die Platten wurden 10 Tage bei 30 °C inkubiert, in kleine Stücke geschnitten, konsolidiert und über Nacht in MeOH getaucht. Die MeOH-Phase wurde filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft. Der MeOH-Extrakt (20 g) wurde in destilliertem Wasser (700 ml) gelöst und dann dreimal mit EtOAc (700 ml) lösungsmittelverteilt, was 1,1 g Rückstand ergab. Die EtOAc-lösliche Fraktion (1,1 g) aus dem MeOH-Extrakt wurde zur Chromatographie auf eine Kieselgelsäule (230–400 mesh) geladen und mit einem Gradientenlösungsmittelsystem aus CH2Cl2-MeOH (100:1 bis 1:1) eluiert. 1, v/v). Dies lieferte sechs Fraktionen (A–F), die einer LC-UV/MS-basierten Analyse unterzogen wurden. Dereplikationsanalyse unter Verwendung einer hauseigenen UV-Spektralbibliothek deutete auf die Existenz kleinerer Peptidanaloga in Fraktion E hin. Diese zeigten ein einfaches UV-Muster bei etwa 220 nm und einzigartige Molekularformel-Ionenpeaks, die Stickstoffatome enthielten. Die polare Fraktion E (233 mg) wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC (Phenomenex Luna C18, 250 × 21,2 mm ID, 5 µm, Torrance, CA, USA) unter Verwendung von CH3CN/H2O (1:9 bis 9:1, v /v, Gradientensystem, Flussrate: 5 ml/min) zu fünf Unterfraktionen (E1–E5). Unterfraktion E2 (27 mg) wurde durch eine semipräparative Umkehrphasen-HPLC (Phenomenex Luna C18, 250 × 10,0 mm ID, 5 µm) mit 33 Prozent MeOH/H2O (isokratisches System, Flussrate: 2 ml/min) gereinigt ), um Verbindung 1 (5,8 mg, tR=57,0 min) zu ergeben. Die Verbindungen 2 (1,6 mg, tR=42,0 min) und 3 (1,5 mg, tR=55,0 min) wurden aus der Unterfraktion E3 (15 mg) durch halbpräparative Umkehrphase isoliert HPLC mit 43 Prozent MeOH/H2O (isokratisches System, Flussrate: 2 ml/min) als Elutionsmittel.

3.5.1. Natalenamid A (1)

3.5.2. Natalenamid B (2)

3.5.3. Natalenamid C (3)

3.6. Säurehydrolyse der Verbindungen 1–3

Eine Menge von insgesamt 0,4 mg jeder Verbindung (1–3) wurde mit 6 N HCl (500 µL) für 1 h bei 110 ◦C hydrolysiert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die Hydrolysate von 1–3 eingedampft, um Spuren von HCl zu entfernen. Destilliertes Wasser (500 &mgr;l) wurde zu den Hydrolysatmischungen gegeben und dann eingedampft, um Spuren von HCl zu entfernen; Dieser Vorgang wurde dreimal durchgeführt.

3.7. Bestimmung der absoluten Konfiguration von Aminosäuren in 1–3

Die Hydrolysatmischungen (1–3) sowie die Standardaminosäuren (L/D-Leu, Glu, Phe und Val) wurden in 1 N NaHCO3 (100 µL) gelöst und dann behandelt mit 50 µL L-FDAA (10 mg/mL in Aceton). Anschließend wurde jedes Hydrolysat für 10 min auf 80 °C erhitzt. Jede Mischung wurde mit 2 N HCl (50 &mgr;l) gequencht und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in 300 &mgr;l MeOH gelöst. Jedes Aliquot (5 µl), das aus den Hydrolysatmischungen gewonnen wurde, wurde direkt auf das LC/MS (Phenomenex Luna C18, 4,6 × 100 mm, 3,5 µm, Flussrate von 0,3 ml/min) injiziert und ein vollständiger Scan in positiv und negativ durchgeführt Ionenmodi (Scanbereich von m/z 100 bis 1000) wurde angewendet, um die Retentionszeiten der L-FDAA-derivatisierten Aminosäuren zu identifizieren.

Die mobile Phase, bestehend aus Ameisensäure in destilliertem Wasser ({{0}},1 Prozent v/v) (A) und Acetonitril (B), wurde mit einem Lösungsmittelgradientensystem wie folgt getragen: 20–40 Prozent (B) für 10 Minuten, 100 Prozent (B) isokratisch für 5 Minuten und dann 20 Prozent (B) isokratisch für 5 Minuten, um ein Waschverfahren nach dem Lauf für die Säule durchzuführen. Die Retentionszeiten der als Standards verwendeten L-FDAA-derivatisierten Aminosäuren betrugen 16,7 min (L-Glu, m/z 400 [M plus H] plus ), 18,2 min (D-Glu, m/z 400 [M plus H] plus ), 22,1 min (L-Val, m/z 370 [M plus H] plus ), 25,1 min (D-Val, m/z 370 [M plus H] plus ), 25,6 min (L-Phe, m/ z 418 [M plus H] plus ), 27,0 min (D-Phe, m/z 418 [M plus H] plus ), 25,5 min (L-Leu, m/z 384 [M plus H] plus ) und 28.2 min (D-Leu, m/z 384 [M plus H] plus ). Die Retentionszeiten der derivatisierten Hydrolysate von 1–3 waren L-Glu (16.9 min), L-Phe (25.7 min) und L-Val (22.5 min) von 1; L-Glu (16,7 min), L-Phe (25,7 min) und L-Leu (25,6 min) aus 2; und L-Glu (16,9 min) und L-Phe (25,7 min) aus 3.

3.8. Zytotoxische Assays unter Verwendung von Krebszellen

MCF7-, HeLa- und A549-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) erworben. HepG2-Zellen wurden von der Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea) bezogen. MCF7-Zellen wurden in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium, ergänzt mit 10 Prozent fötalem Rinderserum, kultiviert. HeLa- und A549-Zellen wurden in Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, USA), ergänzt mit 10 Prozent fötalem Rinderserum, kultiviert. HepG2-Zellen wurden in essentiellem Minimalmedium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, kultiviert. Die Kulturbedingungen wurden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 gehalten. Die Zytotoxizität wurde an diesen vier menschlichen Zelllinien (MCF7, HeLa, A549 und HepG2) unter Verwendung des EZ-CyTox-Zelllebensfähigkeits-Assay-Kits (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) getestet. Kurz gesagt, 5 × 10 3 Zellen/Vertiefung wurden in Platten mit 96- Vertiefungen ausgesät. Nach 24 h wurden die Zellen mit Verbindungen in den angegebenen Konzentrationen behandelt. Nach 72 h Inkubation wurde das EZ-CyTox Cell Viability Assay Kit verwendet. Nach 2 h Inkubation wurde die Extinktion bei 450 nm mit einer Referenz bei 620 nm gemessen. Die Zelllebensfähigkeit wurde als Prozentsatz der Kontrolle berechnet.

3.9. Entzündungshemmende Aktivität

Die Maus-Makrophagen-Zelllinie RAW264.7 wurde von der American Type Culture Collection bezogen. Die Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, kultiviert und bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubiert. Die Zelllebensfähigkeit wurde unter Verwendung des Ez-Cytox Zelllebensfähigkeits-Nachweiskits gemessen. Die Zellen wurden in Platten mit 96- Vertiefungen bei einer Konzentration von 2500 Zellen pro Vertiefung für 24 h inkubiert und mit den angegebenen Konzentrationen der Verbindungen 1–3 für 24 h behandelt. Als nächstes wurden Ez-Cytox-Reagenzien zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die optische Dichte bei 450 nm wurde nach 1 h unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) gemessen, um die Lebensfähigkeit der Zellen abzuschätzen. In einem separaten Experiment wurden RAW264.7-Zellen in 96--Well-Platten bei einer Konzentration von 30,000-Zellen pro Well für 24 Stunden inkubiert. Nach Serumentzug für 12 h wurden die Zellen mit den Verbindungen 1–3 für 1 h vorbehandelt und dann mit 1 &mgr;g/ml LPS für 24 h stimuliert. Die Extinktion von Kulturmedien in einer Griess-Reaktion wurde bei 540 nm unter Verwendung eines PowerWave XS-Mikroplatten-Lesegeräts gemessen, um den NO-Gehalt abzuschätzen.

3.10. Messung des Melaningehalts

Die Maus-Melanom-Zellinie B16F10 wurde von der American Type Culture Collection erworben. Die Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 Prozent FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, kultiviert und bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 Prozent CO2 inkubiert. B16F10-Zellen wurden in 6-cm-Kulturschalen mit 250 000 Zellen pro Vertiefung in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, 100 µg/ml Streptomycin und 100 U/ml Penicillin, für 24 h inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und dann mit IBMX stimuliert und mit unterschiedlichen Konzentrationen der Verbindungen 1–3 oder Kojisäure (Positivkontrolle) in Phenolrot-freiem RPMI-Medium, ergänzt mit 10 Prozent FBS, 100 Einheiten, inkubiert /ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin für 24 h und 48 h. Die Extinktion des Kulturmediums wurde bei 405 nm unter Verwendung eines PowerWave XS-Mikroplattenlesegeräts gemessen, um den Melaningehalt abzuschätzen. Die Ergebnisse sind als fold change im Vergleich zur Kontrolle (Zellen, die nicht durch IBMX stimuliert wurden) ausgedrückt.

3.11. Statistische Analyse

Alle Daten, einschließlich Zelllebensfähigkeit, NO und Melaninproduktion, wurden als Mittelwert und Standardabweichung (SD) dargestellt. Alle Assays wurden dreifach durchgeführt und mindestens dreimal wiederholt. In dieser Studie wurden nur wenige Wiederholungen jedes Zellexperimentes eingeschlossen, daher wurde die nicht-parametrische Analysemethode für die statistische Analyse übernommen. Der Kruskall-Wallis-Test wurde für die statistische Analyse jeder Variablen verwendet. Für alle Analysen wurde das Statistikpaket SPSS verwendet (International Business Machines Corporation (IBM) SPSS Statistics Version 21, Boston, MA, USA). Statistische Signifikanz wurde bei einem p-Wert von weniger als 0,05 betrachtet.

4. Schlussfolgerung

Unser Bericht enthält eine chemische Analyse mikrobieller Isolate einer pilzzüchtenden Termite. Drei neue cyclische Tripeptide, Natalenamide A–C (1–3), wurden aus der Kulturbrühe der pilzwachsenden Termiten-assoziierten Actinomadura sp. isoliert und strukturell charakterisiert. RB99 unter Verwendung einer LC-UV/MS-basierten Dereplikationsmethode. Alle isolierten Verbindungen wurden mit zellbasierten Assays auf ihre biologischen Aktivitäten untersucht. Die Verbindungen 1 und 2 zeigten eine schwache Zytotoxizität gegenüber HepG2- bzw. HeLa/A549-Zellen. Keine der isolierten Verbindungen zeigte signifikante inhibitorische Wirkungen auf die NO-Produktion in LPS-stimulierten RAW264.7-Zellen. Verbindung 3 zeigte dosisabhängig signifikante Hemmwirkungen auf die IBMX-vermittelte Melaninsynthese. Die Wirkung war ähnlich der von Kojisäure, die als kosmetisches Material mit hautaufhellender Wirkung verwendet wird.

Danksagungen:

Wir sind Michael Thomas-Poulsen (Fakultät für Biologie, Universität Kopenhagen, Dänemark) zutiefst dankbar für die Unterstützung unserer Feldarbeit.

Interessenskonflikte:

Die Autoren geben keinen Interessenkonflikt an.

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Probenverfügbarkeit:

Proben der Verbindungen sind von den Autoren nicht erhältlich.

For more information:1950477648nn@gmail.com