Gomisin N hemmt die Melanogenese durch Regulierung der PI3K/Akt- und MAPK/ERK-Signalwege in Melanozyten

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Abstrakt: Gomisin N, einer der in Schisandra Chinensis gefundenen Lignanverbindungen, wurde in verschiedenen Studien gezeigt, dass sie antioxidative, antitumorigene und entzündungshemmende Aktivitäten besitzt. Hier berichten wir zum ersten Mal über die antimelanogene Wirksamkeit von Gomisin N bei Säugetieren Zellen sowie in Zebrafischembryos. Gomisin N reduzierte signifikant den Melaningehalt ohne zelluläre Toxizität. Obwohl es nicht in der Lage war, die katalytische Aktivität von Pilzen zu modulierenTyrosinasein vitro,Gomisin Ndie Expressionsniveaus von Schlüsselproteinen herunterreguliert, die in funktionierenMelanogenese. Gomisin N herunterregulierter Melanocortin-1-Rezeptor (MC1R), Adenylylcyclase 2, Mikrophthalmie-assoziierter Transkriptionsfaktor (MITF), Tyrosinase,Tyrosinase-verwandtes Protein-1(TRP-1) und Tyrosinase-verwandtes Protein-2 (TRP-2). Darüber hinaus wiesen mit Gomisin N behandelte Melan-A-Zellen erhöhte p-Akt- und p-ERK-Spiegel auf, was impliziert, dass die Aktivierung der PI3K/Akt- und MAPK/ERK-Wege hemmend wirken kannMelanogenese. Wir haben auch validiert, dass Gomisin N die Melaninproduktion reduziert, indem es die Expression von MITF unterdrückt,Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2 in Maus- und menschlichen Zellen sowie in sich entwickelnden Zebrafischembryos. Gemeinsam schließen wir darausGomisin Nhemmt die Melaninsynthese durch Unterdrückung der Expression von MITF und melanogenen Enzymen, wahrscheinlich durch Modulation der PI3K/Akt- und MAPK/ERK-Signalwege.

Schlüsselwörter:Schisandra Chinensis;Gomisin N; Lignan;Melanogenese; Hautaufhellung

Cistanche haben eine hautaufhellende Funktion

1. Einleitung

Melanin ist ein Pigment, das in den meisten tierischen Organen vorkommt, darunter Haut, Haare, Augen, Innenohr, Knochen, Herz und Gehirn [1,2].Melanogeneseist ein komplexer Prozess, an dem mehrere Signalwege beteiligt sind. Der Melanocortin-1-Rezeptor (MC1R) ist ein Schlüsselregulator inMelanogenese, signalisiert durch seine Liganden wie Melanozyten-stimulierendes Hormon (MSH) und adrenocorticotropes Hormon (ACTH) [3]. Hautmelanin wird von Melanozyten in der Epidermis biosynthetisiert und dann auf Keratinozyten übertragen, wo sie eine wichtige Rolle beim Hautschutz spielen, indem sie UV-Strahlung des Sonnenlichts absorbieren und reaktive freie Radikale abfangen [4,5]. Melaninsynthese und -transfer in Haut und Haarfollikel werden durch die Verfügbarkeit seiner Vorläufer reguliert [6]. L-Tyrosin und L-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA), Hauptsubstrate melanogener Enzyme, fungieren auch als hormonähnliche Regulatoren bei der Melanogenese [7]. Andererseits führt die Überproduktion von Melanin zu unerwünschten Hautproblemen wie Sommersprossen und Melasma [8,9]. Die Melanogenese kann das Verhalten normaler und maligner Melanozyten beeinflussen, indem sie die elastischen Eigenschaften der Zellen moduliert [10]. Obwohl die in Hautzellen exprimierten Rezeptoren für Serotonin und Melatonin eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase spielen, kann die übermäßige Produktion von Melanin durch unkontrollierte hormonelle Veränderungen pathologische Zustände in der Haut verursachen [11].

Daher wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, um molekulare Mechanismen aufzuklären, die die Melanogenese als primären Schritt zur Behandlung von hyperpigmentären Hauterkrankungen steuern. Darüber hinaus verschiedene Arten vonHautaufhellungWirkstoffe, die die Melaninsynthese hemmen, wurden aus pflanzlichen und nicht-pflanzlichen Extrakten identifiziert und kommerziell in Cosmeceuticals verwendet [12,13]. Die am häufigsten verwendeten Bleichmittel sind Hydrochinon, Mequinol, Arbutin, Kojisäure, Ascorbinsäure und Retinsäure [12,14]. Es gibt jedoch verschiedene Beschränkungen ihrer Verwendung bei der Behandlung von akuten oder chronischen Symptomen der Hyperpigmentierung bei Menschen. Beispielsweise kann Hydrochinon, obwohl es seit den 1960er Jahren für die Depigmentierung verwendet wird, Hautreizungen und Kontaktdermatitis verursachen [15,16]. Es führt auch zu DNA-Schäden, indem es die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und die Entwicklung einer exogenen Ochronose in Säugetierzellen erhöht [17,18]. Andere bekannteTyrosinaseInhibitoren wie Kojisäure und Ascorbinsäure haben nicht nur eine schlechte Hautdurchdringung, Stabilität und Aufhellungswirkung, sondern können bei Langzeitanwendung auch Zytotoxizität, Dermatitis und Erythem verursachen [19,20]. In dieser Hinsicht besteht ein zunehmender Bedarf, sicherere und wirksamere Weißmacher zur Behandlung von Hyperpigmentierung der menschlichen Haut zu entwickeln. Natürliche Kräuter, die in der traditionellen Medizin verwendet werden, können alternative Quellen für die Identifizierung neuer Aufhellungsmittel bieten, die die wichtigsten Schritte kontrollierenMelanogenesemit weniger oder keinen Nebenwirkungen [21].

Schisandra chinensis, auch als nördliche Beere mit feinem Geschmack bekannt, kommt von Natur aus im Nordosten Chinas, im Fernen Osten Russlands, Japans und Koreas vor [22]. Diese Pflanze wird seit langem in der traditionellen orientalischen Medizin zur Behandlung von Nachtblindheit, Hautverbrennungen, aseptischen Entzündungen und Lebererkrankungen eingesetzt [23,24]. Es wurde gezeigt, dass S. chinensis-Fruchtextrakt und seine Lignanverbindungen verschiedene pharmakologische Wirkungen in murinen Zelllinien besitzen. Beispielsweise haben Schisandra A und C antioxidative Wirkungen, während Schisandra B antifibrotische, entzündungshemmende, antioxidative und antiapoptotische Wirkungen hat [25]. Eine weitere LignanverbindungGomisin N(Abbildung 1A) wurde berichtet, dass es die durch oxidativen Stress induzierte Apoptose unterdrückt, indem es die Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien in das Zytoplasma, die Spaltung von Caspase 3 und PARP und den Ca2 plus -induzierten mitochondrialen Permeabilitätsübergang in H9c2-Rattenkardiomyozyten hemmt [7,8]. Interessanterweise haben mehrere Studien mit Mausmodellen und menschlichen Hautzelllinien das therapeutische Potenzial von S. chinensis zur Behandlung von Hauterkrankungen aufgezeigt. Lee et al. berichteten, dass der Methanolextrakt aus S. chinensis-Früchten die Symptome der Kontaktdermatitis linderte, indem er die Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen wie TNF- und IFN- bei topischer Anwendung reduzierte [8,24]. Kanget al. zeigten, dass der Wasserextrakt von Schisandra Fructus die IκB-Aktivierung hemmte und dadurch die Produktion von TNF-, IL-6 und GM-CSF in der menschlichen Mastzelllinie HMC-1 unterdrückte [26]. Diese Ergebnisse veranlassten uns zu der Annahme dass S. chinensis-Lignane die Hautzellfunktionen umfassender beeinflussen könnten. In dieser Studie wollten wir die mutmaßlichen Rollen von untersuchenGomisin N, einer der wichtigsten Lignanverbindungen in S. Chinensis, bei der RegulierungMelanogenese, wodurch seine potentielle Verwendung als kosmetisches Mittel bewertet wird. Hier berichten wir darüberGomisin Nhemmt die Melaninbiosynthese ohne Zelltoxizität in menschlichen und Mauszellen sowie in Zebrafischembryos.

2. Ergebnisse

2.1. Wirkungen von Gomisin N auf die Melaninbildung und Zelllebensfähigkeit

Um die Wirkungen von Gomisin N auf zu überprüfenMelanogenesebehandelten wir Maus-Melanozyten mit unterschiedlichen Konzentrationen vonGomisin Nfür 72 h und bewertete dann die Veränderungen des Melaningehalts. Die Behandlung mit Gomisin N reduzierte den Melaningehalt sowohl in der normalen Melanozyten-Zelllinie Melan-A als auch in B16F10-Melanomzellen dosisabhängig ohne zelluläre Toxizität (Abbildung 1B, C). Wir beobachteten, dass Gomisin N die -MSH-induzierte Melaninproduktion in B16F10-Zellen hemmte, was mit den Ergebnissen vergleichbar war, die durch PTU-Behandlung erzielt wurden [27] (Abbildung 1C). Um zu beurteilen, ob die Reduktion von Melanin aufGomisin NBehandlung auf eine verringerte Tyrosinase-Aktivität zurückzuführen ist, führten wir einen L-DOPA-Färbungsassay in normalen humanen epidermalen Melanozyten (NHEM)-Zellen durch. Wie in Abbildung 1E gezeigt, zeigten mit Gomisin N behandelte NHEM-Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen verringerte L-DOPA-Spiegel. Die hemmende Wirkung von Gomisin N auf die Melaninproduktion war jedoch bei menschlichen Melanom-MNT-1-Zellen nicht signifikant (Abbildung 1D). .

2.2. Wirkungen von Gomisin N auf die Tyrosinase-Aktivität

Um zu prüfen, obGomisin NhemmtTyrosinaseIn-vitro-Aktivität verwendeten wir Pilztyrosinase und B16-Melanomzelllysate. Kojisäure, ein bekannter Tyrosinase-Inhibitor, wurde als positive Kontrolle verwendet. Bei Behandlung mit Pilz-Tyrosinase führte Gomisin N zu keiner Veränderung der Umwandlung von L-DOPA in Dopachrom (Abbildung 2A), während Kojisäure die enzymatische Aktivität signifikant reduzierte. Bei Behandlung mit B16-Melanomzellen führte Gomisin N jedoch zu einer Abnahme inTyrosinaseAktivität des Zelllysats dosisabhängig (Abbildung 2B). Darüber hinaus, bei Co-Behandlung mit -MSH in B16-Zellen,Gomisin Nkehrte die Zunahme der durch -MSH stimulierten Dopachrombildung um (Fig. 3C). Bemerkenswerterweise schien Gomisin N wirksamer zu sein als Kojisäure, um die zelluläre zu hemmenTyrosinase-Aktivitätvon B16-Zellen nach -MSH-Stimulus. Diese Ergebnisse implizieren, dass die hemmende Wirkung von GomisinN auf die Melaninproduktion, die in Maus- und menschlichen Zellen beobachtet wird ( 1 ), nicht auf seiner Funktion beruht, die katalytische Aktivität von Tyrosinase direkt zu hemmen. Es ist jedoch immer noch möglich, dass Gomisin N die Expression von Tyrosinase oder anderen Proteinen reguliert, die dabei eine Schlüsselrolle spielenMelanogenese.

2.3. Wirkungen von Gomisin N auf die Inaktivierung des MC1R-Signalwegs

Wir versuchten, den zugrunde liegenden Mechanismus aufzuklären, der für die hemmende Wirkung von GomisinN auf die Melaninproduktion verantwortlich ist. Das haben wir begründetGomisin Nkönnte Signalproteine ​​regulieren, an denen sie beteiligt sindMelanogeneseund hemmen dadurch die Melaninsynthese. Der Melanocortin-1-Rezeptor (MC1R) ist ein amelanozytischer G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der als Schlüsselregulator bei der Melaninsynthese fungiert. Die Aktivierung von MC1R durch seinen Liganden -MSH oder adrenocorticotropes Hormon (ACTH) führt zu einem Anstieg der Adenylylcyclase, die wiederum die intrazellulären cAMP-Spiegel hochreguliert [2,3]. Folglich wird der Transkriptionsspiegel von MITF über den Signalweg Proteinkinase-C (PKA)/responsives Element-bindendes Protein (CREB) erhöht [2,28]. Um die regulatorische Wirkung von Gomisin N auf den MC1R-Signalweg zu bewerten, überprüften wir die Expressionsniveaus von MC1R und seinen nachgeschalteten Signalmolekülen nach der Behandlung von Melan-A-Zellen mit Gomisin N. Wir beobachteten, dass Gomisin N die Proteinniveaus von MC1R und Adenylylcyclase 2 signifikant herunterregulierte dosisabhängig (Abbildung 3A–C). Wie erwartet,Gomisin N-behandelten Zellen zeigten auch verringerte Proteinspiegel von MITF und seinen bekannten Zielen Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2 (Abbildung 3A, D–G). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Gomisin N melaninproduzierende Enzyme hemmt, indem es MITF über den MC1R-Signalweg inaktiviert.

2.4. Wirkungen von Gomisin N auf die Phosphorylierung von Akt und ERK1/2 in Melan-A-Zellen

Es ist bekannt, dass die PI3K/Akt- und MAPK/ERK-Signalwege an der Melanogenese beteiligt sind, indem sie MITF transkriptionell oder posttranskriptionell regulieren [29,30]. Um zu bewerten, ob GomisinN diese Signalwege beeinflusst, bewerteten wir den Phosphorylierungsstatus von Akt und ERK1/2 durch Western-Blot-Analyse. Wie in Abbildung 3H–J gezeigt, hochdosierte Behandlung (30 µM) vonGomisin Ndie Phosphorylierung sowohl von Akt als auch von ERK signifikant verbessert. Diese Daten weisen darauf hin, dass die inhibitorische Wirkung von Gomisin N anMelanogeneseist wahrscheinlich mit den Signalwegen P13K/Akt und MAPK/ERK assoziiert.

2.5. Gomisin N hemmte die Melanogenese in Zebrafischembryos

Als nächstes wollten wir untersuchen, ob Gomisin N bei der Hemmung wirksam istMelanogenesein vivo. Zu diesem Zweck behandelten wir Zebrafischembryonen 72 h lang mit Gomisin N in Konzentrationen von 1, 10, 20 und 30 µM und maßen dann die Expressionsniveaus melanogener Proteine. Wir beobachteten, dass die Behandlung mit Gomisin N die Melaninbildung in sich entwickelnden Zebrafischembryos hemmte.Gomisin N-behandelte Embryonen zeigten konzentrationsabhängig eine Verringerung des Melaningehalts im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (Abbildung 4). Wir fanden auch, dass der Proteingehalt vonTyrosinase, MITF, TRP-1 und TRP-2 wurden durch die Behandlung mit Gomisin N verringert (Abbildung 5). Diese Ergebnisse zeigen, dass Gomisin N die Melanogenese in vivo hemmt, indem es den Transkriptionsfaktor MITF und seine Ziele reguliertTyrosinase, TRP-1 und TRP-2.

2.6. Gomisin N kehrte die Rapamycin-induzierte Melanogenese in menschlicher MNT um-1

Obwohl Gomisin N signifikant gehemmtMelanogenesein Melan-A- und B16-Zellen sowie Inzebrafischembryos haben wir seine Wirkung auf menschliche MNT-1-Melanomzellen nicht beobachtet. Wir erwarteten, dass die Wirkung von Gomisin N in MNT-1-Zellen unter der Bedingung nachweisbar sein könnte, dass die Melanogenese durch einen geeigneten Stimulus hochreguliert wird. Es wurde gezeigt, dass Rapamycin die Melanogenese durch Erhöhung der Tyrosinaseaktivität und der Proteinspiegel von MITF, Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2 [31] induziert, teilweise durch die Aktivierung der Autophagie [32]. Wir überwachten die Niveaus vonTyrosinase, MITF, TRP-1 und TRP-2 in MNT-1-Zellen durch Western-Blot-Analyse nach gleichzeitiger Behandlung mit Gomisin N Andrapamycin. Die Behandlung mit Rapamycin induzierte signifikant die MITF-, TRP-1- und TRP-2-Spiegel, hatte aber keine Wirkung aufTyrosinaseEbenen (Abbildung 6). Die Behandlung mit Gomisin N kehrte jedoch die Wirkungen von Rapamycin auf MITF, TRP-1 und TRP-2 in einer konzentrationsabhängigen Weise signifikant um. Der umgekehrte Effekt vonGomisin Ngegen Rapamycin war bei Konzentrationen von 20 und 30 µM vielversprechender als bei 10 µM. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Gomisin N inhibiertMelanogenesein den menschlichen MNT-1-Melanomzellen durch Regulierung des Transkriptionsfaktors MITF und seiner Ziele TRP-1 und TRP-2.

3. Diskussion

Die Hauptfunktion von Melanin besteht darin, Hautzellen vor UV-Strahlung zu schützen [33–35]. Hyperpigmentierung, das Ergebnis einer Überproduktion von Melanin in der Haut, verursacht unerwünschte kosmetische Bedenken und wird mit Dermatitis und Hautkrebs in Verbindung gebracht. Mehrere Berichte haben vorgeschlagenMelanogeneseals wichtiges Ziel für die Behandlung von metastasierendem Melanom [36,37]. Daher besteht ein zunehmender Bedarf an der Entwicklung antimelanogener Wirkstoffe, die die Melanogenese ohne Zelltoxizität regulieren [38]. An der Melanogenese der Haut sind mehrere Wege beteiligt [39,40]. Nach der Ligandenbindung verstärkt MC1R die Aktivität der Adenylylcyclase, die anschließend die intrazellulären Spiegel von cAMP erhöht [41,42]. Es wurde vielfach berichtet, dass die cAMP-abhängige Aktivierung des PKA/CREB-Signalwegs die Transkriptionsspiegel von MITF hochreguliert und dadurch die Melaninsynthese verstärkt [43]. MITF fungiert als Hauptregulator der drei wichtigsten melanogenen Enzyme Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2 bei Wirbeltieren [3,21,44]. Diese Enzyme sind Transmembranproteine, die sich in der Melanosomalmembran von Melanozyten befinden. Tyrosinase reguliert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt inMelanogenesedurch Umwandlung von L-Tyrosinase in L-DOPA [23]. TRP-1 und TRP-2 spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Melaninsynthese, obwohl ihre Funktionen noch nicht vollständig verstanden sind.

In dieser Studie zeigte Gomisin N, eine Lignanverbindung von S. chinensis, depigmentierende Aktivität ohne zelluläre Toxizität. Gomisin N hemmte die Melaninsynthese in kultivierten Säugetierzelllinien sowie in Zebrafischembryos. Gomisin N schien bei der Hemmung der Melaninproduktion in Melan-A-Zellen wirksamer zu sein als die positive Kontroll-PTU (Fig. 1B). Gomisin N senkte konzentrationsabhängig den Melaningehalt. Verglichen mit der unbehandelten Kontrollgruppe wurden 10 &mgr;M vonGomisin Nreduziert den Melaningehalt um etwa 40 Prozent, ohne zelluläre Toxizität. Die anti-melanogene Aktivität von 10- µM Gomisin N war vergleichbar mit der von 100- µM PTU in Melan-A-Zellen. In ähnlicher Weise erwies sich Gomisin Nappeare als wirksamer als PTU in -MSH-aktivierten B16F10-Zellen, wo die Wirkungen von 5- und 10- µM Gomisin N mit denen von 10- und {{12) vergleichbar waren }} µM PTU (Fig. 1C). NHEM-Zellen, die mit Gomisin N behandelt wurden, zeigten verringerte L-DOPA-Spiegel, was darauf hindeutet, dass Gomisin N hemmtTyrosinaseAktivität in kultivierten Zellen (Abbildung 1E). Diese Ergebnisse veranlassten uns, den zugrunde liegenden Mechanismus, durch den Gomisin N die Melanogenese hemmt, weiter zu untersuchen.

Wir haben geprüft, obGomisin Nmoduliert direkt die katalytische Aktivität vonTyrosinasein vitro. Im Gegensatz zu Kojisäure zeigte Gomisin N keine hemmenden Wirkungen auf die Pilz-Tyrosinase-Aktivität (Abbildung 2A). Die zelluläre Tyrosinaseaktivität in B16-Melanomzelllysaten wurde jedoch durch Gomisin N sowohl mit als auch ohne -MSH-Behandlung signifikant herunterreguliert (Abbildung 2B, C). Es wurde festgestellt, dass die Hemmung der zellulären Tyrosinase-Aktivität von Gomisin N bei -MSH-Stimulus signifikanter war als die der Positivkontrolle Kojisäure (Fig. 2C).

Wir postulierten, dass die anti-melanogene Funktion von Gomisin N durch transkriptionelle oder posttranskriptionelle Regulation von Tyrosinase und Tyrosinase-verwandten Proteinen (TRPs) erfolgen könnte Quantität und Qualität der Melaninproduktion in Melanozyten. Erwartungsgemäß beobachteten wir, dass Gomisin N die Spiegel von MC1R und Adenylylcyclasen 2 in Melan-A-Zellen reduzierte (Abbildung 3A–C). Außerdem,Gomisin Nregulierte die Expression von MITF und seinen Zielproteinen einschließlich Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2 herunter (Abbildung 3A,D–G). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die verringerten Melaningehalte nach der Behandlung mit Gomisin N aus der Deaktivierung des MC1R-Signalwegs resultieren.

Andererseits können die PI3K/Akt- und MAPK/ERK-Wege MITF phosphorylieren und dadurch seine Aktivität posttranskriptionell modulieren [45]. Der Gesamteffekt der Aktivierung der PI3K/Akt- und MAPK/ERK-Signalwege ist jedoch inMelanogeneseist umstritten. Sowohl der PI3K/Akt- als auch der MAPK/ERK-Signalweg sind in menschlichen Melanomen aufgrund akkumulierter Mutationen konstitutiv aktiviert [46]. Es ist bekannt, dass C2--Ceramid-vermittelte Depigmentierung in Mel-Ab-Zellen durch eine Verringerung der p-Akt-Spiegel auftritt [47]. Es gibt mehrere natürliche Verbindungen, die die Melanogenese aktivieren, indem sie die p-ERK-Spiegel in B16-Melanomzellen hochregulieren [28]. Im Gegensatz dazu gibt es auch Hinweise darauf, dass erhöhte p-ERK- und p-Akt-Spiegel die Melaninsynthese hemmen [28,48]. Die Komplexität der Regulation der Melanogenese kann teilweise durch die Tatsache erklärt werden, dass die Phosphorylierung die Transkriptionsaktivität von MITF verstärkt, aber gleichzeitig einen Ubiquitions-Proteosom-abhängigen Abbau von MITF induziert [26,49–51]. Unsere Daten zeigten, dass sowohl die p-Akt- als auch die p-ERK-Spiegel in mit Gomisin N behandelten Melan-A-Zellen hochreguliert waren (Abbildung 3H–J). Dies impliziert, dass die PI3K/Akt- und MAPK/ERK-Signalwege zur Hemmung der Melaninproduktion beitragen können.

Wir haben die anti-melanogene Aktivität von Gomisin N im In-vivo-Zebrafischmodell weiter validiert. Mit Gomisin N behandelte Zebrafischembryos zeigten eine signifikante Verringerung der Melaninpigmentierung (Abbildung 4). Darüber hinaus senkte Gomisin N deutlich die Spiegel vonTyrosinase, MITF, TRP-1 und TRP-2 bei der Entwicklung von Zebrafischembryos. Diese Ergebnisse deuten zusammen darauf hinGomisin Ninduziert eine Depigmentierung durch Herunterregulieren der Expression von MITF und melanogenen Enzymen in vivo. Die anti-melanogene Aktivität von Gomisin N wurde weiter in humanen Melanom-MNT-1-Zellen bestätigt, die durch Rapamycin stimuliert wurden. Obwohl Gomisin N nur zu geringen Änderungen des Melaningehalts in MNT-1-Zellen führte (Abbildung 1D), war es wirksam, die Rapamycin-induzierte Hochregulierung von MITF, TRP-1 und TRP-2 umzukehren eine konzentrationsabhängige Weise (Abbildung 6A,C–E). Zusammengenommen ist die regulatorische Wirkung vonGomisin Nauf MITF und melanogene Enzyme wurde reproduzierbar in Maus- und menschlichen Zellen sowie in Zebrafischembryos gefunden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit darauf hindeutet, dass Gomisin N ein hohes Potenzial als Roman haben könnteHautaufhellungAgent. Gomisin N scheint zu inhibierenMelanogeneseindem die Expression von MITF über den MC1R-Weg unterdrückt wird, anstatt direkt die katalytische Aktivität von zu modulierenTyrosinaseundTRPs. Obwohl die detaillierten Mechanismen noch aufgeklärt werden müssen, ist die durch Gomisin N induzierte Depigmentierung wahrscheinlich mit der Aktivierung der PI3K/Akt- und MAPK/ERK-Wege verbunden (Abbildung 7).

4. Materialien und Methoden

4.1. Materialien

RPMI1640 wurde von Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, USA) gekauft. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), fötales Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin (PS) wurden von Hyclone (Carlsbad, CA, USA) bezogen. Melanozyten-Wachstumsmedium wurde von PromoCell (Heidelberg, Deutschland) erworben. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA), Kojisäure, 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU), Pilztyrosinase, 3,{{ 9}}Dihydroxy-1-phenylalanin (L-DOPA), -MSH, Dimethylsulfoxid (DMSO) und Paraformaldehyd wurden von SigmaChemical Co. (St. Louis, MO, USA) erworben.Gomisin NDie Verbindung wurde von Chul Young Kim (Hanyang University, Ansan, Korea) bereitgestellt. Rapamycin wurde von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) gekauft.

4.2. Zellkultur

Die Maus-Melanom-Zelllinie B16F10 wurde von der Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea) bereitgestellt. Murine Melanozyten Melan-A-Zellen [52] waren ein großzügiges Geschenk von Dr. Byeong Gon Lee (das SkinResearch Institute, Amore Pacific Co., Yongin -si, Korea). Menschliche MNT-1-Melanomzellen wurden großzügigerweise von Aeyeong Lee (Collage of Medicine in Dongguk University, Goyang-si, Korea) zur Verfügung gestellt. Primäre normale humane epidermale Melanozyten (NHEM) wurden von PromoCell (Heidelberg, Deutschland) erworben. Melan-A-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) gezüchtet, das mit 10 Prozent FBS, 1 Prozent PS und 200 nM TPA ergänzt war. DMEM, ergänzt mit 10 Prozent FBS und 1 Prozent PS, wurde verwendet, um Melan-A-Zellen und NHEM-Zellen zu erhalten. Alle Zellen wurden bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 inkubiert.

4.3. Messung des Melaningehalts

Melan-A-Zellen wurden in eine 24-Well-Platte (1 × 105 Zellen/Well) ausgesät, behandelt mitGomisin N, unddann für 72 h inkubiert. Nach 72 h wurde der Melaningehalt wie zuvor beschrieben gemessen [53]. Kurz nach Entfernen des Kulturmediums wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Danach wurde jeder Vertiefung Natriumhydroxidlösung (1 ml, 1 N) zugesetzt, um Melanin aufzulösen. Die Extinktion bei 405 nm wurde unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts gemessen. Dieser Assay wurde mit B16F10-Zellen (2 × 104 Zellen/Vertiefung) und MNT-1-Zellen nach demselben Verfahren wiederholt.

4.4. Western-Blot-Analyse

Melan-A-Zellen wurden in 100-mm-Schalen (1 × 106 Zellen/Schale) ausgesät und mit 1, 5 oder 10 μM behandeltGomisin Nfür drei Tage bei 37 ◦C. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und dann unter Verwendung eines Schabers geerntet. Abgelöste Zellen wurden in 1 ml PBS gegeben und bei 75 00 U/min für 5 min zentrifugiert. Nach dem Entfernen der oberen Lösung wurden Zellpellets mit Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 Prozent SDS, 150 mM NaCl, 1 Prozent NP-40, lysiert). 0,02 Prozent Natriumazid, 0,5 Prozent Natriumdesoxycholat, 100 µg/ml PMSF, 1 g/ml Aprotinin) für 24 h bei 4 °C. Gesamtproteine ​​wurden unter Verwendung einer Ultrazentrifuge bei 12,000 U/min für 30 min bei 4◦C extrahiert. Der Proteingehalt wurde unter Verwendung des Bradford-Assays gemessen. Proteine ​​(30 ug) wurden unter Verwendung eines 10-prozentigen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophoresegels (SDS-PAGE) aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Membran wurde 1 h lang mit 5 % Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBST) blockiert und dann 12 h lang bei 4 °C mit Primärantikörpern gegen -Tubulin (Santa Cruz, CA, USA) inkubiert ), MITF (Zellsignalisierung, Danvers, MA, USA), Tyrosinase (Zellsignalisierung), ERK (Zellsignalisierung), Phospho-ERK (Zellsignalisierung), AKT (Zellsignalisierung), Phospho-AKT (Zellsignalisierung), MC1R ( Santa Cruz), Adenylylcyclasen 2 (Santa Cruz), TRP-1 (Santa Cruz) und TRP-2 (Santa Cruz). Nach dem Entfernen der primären Antikörper wurden die Membranen dreimal mit TBST gewaschen und mit sekundären inkubiert Antikörper (Kaninchen-anti-Ziege-IgG-HRP; Maus-anti-Kaninchen-HRP, Santa Cruz) für 1 h. Die Membranen wurden mit verstärktem Chemilumineszenz-Reagenz unter Verwendung des ChemiDoc XRS plus-Bildgebungssystems (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) behandelt. Die densitometrische Analyse der Banden wurde unter Verwendung der Software Image MasterTM 2D Elite (Version 3.1, GE Healthcare, Chicago, IL, USA) durchgeführt.

4.5. Tyrosinase-Aktivitätsassay

Abschätzung der hemmenden Wirkung von Gomisin N auf PilzeTyrosinaseAktivität wurde Tyrosinase mit 1, 5 oder 10 &mgr;M inkubiertGomisin Noder die Positivkontrolle Kojisäure. Jede Probe wurde in Methanol gelöst. L-DOPA (8,3 mM) und Pilztyrosinase (125 U) wurden in 80 mM Phosphatpuffer (pH 6,8) verdünnt. 40 µl jeder Probe und 120 µl L-DOPA wurden in einer Platte mit 96--Wells gemischt, gefolgt von der Zugabe von 40 µl verdünnter Pilz-Tyrosinase. Die Platten wurden dann für 15 min inkubiert und die Extinktion wurde bei 490 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts gemessen.

TyrosinaseAktivität in B16-Melanomzelllysaten wurde mit oder ohne -MSH-Behandlung gemessen, wie zuvor von Ohguchi et al. [54], mit leichten Modifikationen. Zelllysat wurde wie oben im Western-Blot-Analyseteil beschrieben hergestellt. Gesamtproteine ​​im Überstand wurden mit dem Bradford-Assay unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard gemessen [55]. Eine gleiche Menge an Proteinen wurde verdünnt und für den Tyrosinase-Aktivitätsassay verwendet.

hemmen die Tyrosinase-Aktivität

4.6. L-DOPA-Färbung in NHEM-Zellen

NHEM-Zellen wurden in eine {{0}}-Well-Platte ausgesät und für 72 h mit Gomisin N inkubiert. Die Zellen wurden mit 4 % Paraformaldehyd für 4 0 min fixiert, gefolgt von einer Behandlung mit 0,1 % Triton X{ {6}} für 2 min. L-DOPA (0,1 Prozent) wurde zu jeder Vertiefung gegeben, gefolgt von einer Inkubation für 2 h. Nach Entfernen der Lösung wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Die Bilder wurden mit dem Mikroskop fotografiert.

4.7. Zebrafisch-Experimente

Zebrafischembryos wurden von der Zebrafish Resource Bank (Daegu, Korea) erhalten. Embryonen wurden 72 h mit Gomisin N behandelt. Die depigmentierende Wirkung vonGomisin Nan Zebrafischembryos wurde unter dem Stereomikroskop beobachtet. Für die Western-Blot-Analyse wurden mit Gomisin N behandelte Embryonen unter Verwendung von Lysepuffer lysiert, aus dem Gesamtproteine ​​wie oben erwähnt hergestellt wurden.

5. Schlussfolgerungen

Unser Ergebnis stützt die Ansicht, dass Gomisin N ein hohes Potenzial zur Verwendung als funktionelles Lebensmittel hatHautaufhellungAgent.Gomisin Nist eine der wichtigsten Lignanverbindungen in S. Chinensis. Eigentlich. Chinensis ist ein pflanzliches Arzneimittel, das zur Heilung vieler menschlicher Krankheiten verwendet wird. Allerdings sind weitere epidemiologische Studien notwendig, um die Unbedenklichkeit von Gomisin N auf der Haut nachzuweisen. Folglich können In-vivo-Studien und klinische Studien die Wirksamkeit von GomisinN deutlicher belegen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie darauf hindeutetGomisin Nkann ein potenzielles hypopigmentäres und natürliches Mittel seinHautaufhellungKandidat für die Kosmetikindustrie.

Cistanche verbessert die Aufhellung

Verweise

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