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Abstrakt:Weinreben sind Abfallbiomasse des Weinbaus, die bioaktive Polyphenole und wertvolle Kosmetika enthält. Während mehrere Studien über die kosmetischen Aktivitäten von E-Resveratrol berichteten, beschrieben nur wenige das Potenzial von E-ε-Vinifera, dem zweiten Hauptbestandteil von Traubenrohrextrakten (GCE), und keine von ihnen untersuchte GCE als natürliche Mischung von Polyphenolen für kosmetische Anwendungen . In dieser Studie betrachteten wir das Potenzial von GCE aus polyphenolreichen Rebsorten als multifunktionale kosmetische Inhaltsstoffe. HPLC-Analyse wurde durchgeführt, um die wichtigsten Polyphenole in GCE zu quantifizieren, dh Catechin, Epicatechin, E-Resveratrol, E-Piceatannol, Ampelopsin A, E-ε-Vinifera, Hopeaphenol, Isohopeaphenol, E-Miyabenol C und E-Vitamin B von ausgewählten Sorten . HautAufhellungPotenzial durchTyrosinaseInhibitionsassay und die Aktivierungskapazität des Zelllanglebigkeitsproteins (SIRT1) von GCE wurden mit reinem E-Resveratrol und E-ε-Vinifera verglichen. Die Arzneimittelähnlichkeit von GCE-Polyphenolen wurde berechnet, was die Vorhersage der Hautpermeabilität und Bioverfügbarkeit ermöglicht. Schließlich ermöglichten die vorliegenden Daten die Berücksichtigung von GCE aus polyphenolreichen Sorten als multifunktionale kosmetische Inhaltsstoffe gemäß den Praktiken der Grünen Chemie.

Schlüsselwörter:Traubenrohrextrakte; natürliche Zutaten; Polyphenole; E-Resveratrol; E-ε-Vinifera; Sirtuinaktivierung;TyrosinaseHemmung; Drogenähnlichkeit

Cistanche ist ein Tyrosinase-Hemmer

1. Einleitung

Die bewusste Gestaltung neuer Hautpflegeformulierungen auf Basis natürlicher Inhaltsstoffe ist zu einem Schlüsselthema in der Kosmetikindustrie geworden, um der Verantwortung für die Umwelt gerecht zu werden. Botanische Extrakte werden nach ihrer Zusammensetzung, biologischen Aktivität, Stabilität und Hautdurchlässigkeit ausgewählt. Diese Faktoren bestimmen die Gesamteffizienz des Inhaltsstoffs und sein kosmetisches Potenzial. Heutzutage besteht eine wachsende Nachfrage nach neuen natürlichen Ressourcen mit wirksamen Hautpflegekomponenten, die vor Stressquellen wie Umweltverschmutzung, schädlicher Strahlung sowie falscher Ernährung und einem stressigen Lebensstil schützen [1]. Darüber hinaus suchen Kunden nach umweltfreundlicher Naturkosmetik, und aus Pflanzenresten recycelte Biomoleküle bieten neue Perspektiven für eine nachhaltige Beschaffung.

Der Weinbau (und der Weinsektor) ist eine der ältesten und am weitesten entwickelten Industrien der Welt, in der etwa 80 Prozent der Grapefruits für die Weinherstellung verwendet werden [2]. Es ist bekannt, dass Traubenbeeren eine reiche Quelle wertvoller Verbindungen mit gesundheitlichem Nutzen wie Anthocyane, Phenolsäuren, Flavan-3-ole, Flavonole, Proanthocyanidine, Stilbenoide, Melanin, Fettsäuren, Mineralien sowie Vitamine sind [2]. Bei der Weinherstellung entstehen verschiedene an Biomolekülen reiche Nebenprodukte, darunter Trester (Haut und Samen), Weintrub sowie andere feste Abfälle wie Weinreben [3]. Unter ihnen stellt Traubenholz-Biomasse, die nach dem Winterschnitt entsorgt wird, ein großes Potenzial für die Entwicklung neuer Naturkosmetik-Inhaltsstoffe dar, da sie reichlich vorhanden sind und Polyphenole einschließlich Stilbenoide enthalten [2,4]. Frühere Studien berichteten, dass die Wahl der Rebsorte entscheidend für die Entwicklung von polyphenolreichem GCE ist [4–6].

E-Resveratrol, ein bekannter Wirkstoff zur Abwehr von Trauben, weist mehrere biologische Aktivitäten auf, darunter antioxidative [7], krebshemmende [8,9], antimykotische [10] und entzündungshemmende Eigenschaften [11]. Es zeigt auch eine signifikante Aktivität gegenüber der Haut Alterungsprozess durchTyrosinaseHemmung [12,13], die ein Schlüsselmechanismus zur Hemmung von Hautverfärbungen ist. Der Prozess der Hautpigmentierung hängt mit dem Vorhandensein von Melanin und Lipofuszin zusammen, deren übermäßige und abnormale Verteilung in der Haut dunkle Flecken verursacht. Ein ungleichmäßiger Hautton ist eines der Hauptsymptome dieses Alterungsprozesses. Melanin wird unter dem Einfluss von gebildetTyrosinasewährend der Melanogenese, reguliert die Biosynthese von Vitamin D3 und erhöht die Widerstandskraft der Haut gegen Sonnenbrand und Tumore [13,14]. Wenn eine lokale Hyperpigmentierung auftritt, kann sie neben ästhetischen Problemen auch das Melanomrisiko erhöhen. Daher können Tyrosinase-Inhibitoren wie E-Resveratrol in der kosmetischen und medizinischen Industrie als Depigmentierungsmittel attraktiv sein [15].

Auch die Verlangsamung von Hautalterungsprozessen kann durch die Aktivierung natürlicher Zellreparaturmechanismen erfolgen. Dies kann durch die Anwendung von Sirtuin-aktivierenden Verbindungen erreicht werden [1]. Es wurde berichtet, dass eine Stimulation der SIRT1-Aktivität, die die Zelllebensdauer, Transkriptionsfaktoren und andere DNA-Reparaturproteine ​​aufrechterhält [16], entscheidend für die Kontrolle von oxidativem Stress und inthe ist Regulation des Alterungsprozesses [17]. Sirtuine werden normalerweise auf Transkriptionsebene, Translation, Proteinstabilität und Oxidation durch natürliche Inhibitoren wie Nicotinamid reguliert. Säugetier-Sirtuine wie SIRT1 wirken als Transkriptionsregulatoren für die ausgewählten Rezeptoren und DNA-Reparaturproteine. Sie steuern auch den Energiestoffwechsel, das Zellüberleben, die DNA-Reparatur, die Geweberegeneration, Entzündungsmechanismen sowie die neuronale Signalübertragung [1].

Das Vorhandensein von E-Resveratrol und seinen Derivaten in Weinstöcken bietet eine große Chance für den Einsatz dieses Naturkosmetik-Inhaltsstoffs in der Kosmetikindustrie als effiziente Anti-Aging-Wirkstoffe via Sirtuin-Aktivierung undTyrosinase-hemmende Aktivitäten [1,16].

Zu den Anforderungen an moderne Kosmetikinhaltsstoffe gehören ihre Multifunktionalität, Sicherheit und Wirksamkeit. Die nachgewiesene biologische Wirkung eines aktiven Moleküls reicht in der Regel nicht aus, um die innovative kosmetische Formulierung zu erhalten. Zahlreiche physikalisch-chemische Eigenschaften einer biologisch aktiven Verbindung sind entscheidend, um einen Gesamtnutzen nach topischer Anwendung zu gewährleisten [18]. Bioverfügbarkeit und Hautdurchlässigkeit sind einschränkende Faktoren für den kosmetischen Einsatz vieler potentieller Wirkstoffe [19]. Eine neue Bedeutung erhält die Verwendung von Naturstoffen als kosmetische Inhaltsstoffe bei natürlichen Extrakten, die eine Mischung von Molekülen mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften enthalten Dazu stellt sich noch die Frage nach dem Vergleich der Hautresorption von reinen Verbindungen wie E-Resveratrol oder E-ε-Vinifera mit den stilbenoidreichen Mischungen (zB GCE). Entscheidend ist der physikalisch-chemische Charakter einer Reinsubstanz Parameter, der seine Durchlässigkeit einschränken kann. Unter einem anderen Gesichtspunkt würde die Anwendung solcher Mischungen einen weiten Bereich biologischer Aktivitäten von der Oberfläche des Stratum corneum über die Epidermis bis zu tiefen Schichten der Dermis sicherstellen.

In dieser Studie haben wir das kosmetische Potenzial von GCE von zuvor ausgewählten polyphenolreichen Sorten [20] als multifunktionale Verjüngungsmittel durch zwei verschiedene Mechanismen bewertet; (1) HautAufhellungüberTyrosinaseHemmung unter Verwendung von enzymatischen Assays und Docking-Daten, (2) Verzögerung der zellulären Seneszenz unter Verwendung von Sirtuin-Aktivierungsassays. Die Aktivitäten von reinen Bestandteilen von GCE wie E-Resveratrol und E-ε-Vinifera wurden mit GCE verglichen, einer Mischung aus natürlichen Bioquellen von Stilbenoiden. Schließlich bewerteten wir die Verfügbarkeit der Hauptbestandteile von GCE und ihre Fähigkeit, die Hautbarriere zu durchdringen.

2. Ergebnisse und Diskussion

2.1. Konzentration von Polyphenolen in GCE

Die Konzentration der wichtigsten Polyphenole in GCE von fünf zuvor ausgewählten Sorten wurde durch HPLC-Analysen quantifiziert (Tabelle 1) [20]. Zehn Hauptverbindungen wurden identifiziert: zwei Flavonoide (Catechin, Epicatechin) sowie acht Stilbenoide (Ampelopsin A, E-Resveratrol, E-Piceatannol, Hopeaphenol, Isohopeaphenol, E-ε-Vinifera, E-Miyabenol C und E-Vitamin B ). Die chemischen Strukturen der Verbindungen sind in Abbildung 1 dargestellt.

Acht Polyphenole wurden durch ihren Vergleich mit reinen Standards identifiziert, d. h. E-Resveratrol, E-Piceatannol, Catechin, Epicatechin, E-ε-Vinifera, Hopeaphenol, Ampelopsin A und E-Vitisin B. Zwei Verbindungen (Isohopeaphenol und E-Miyabenol C) wurden nach Elutionsreihenfolge, UV-Spektren und MS-Daten aus der Literatur zugeordnet [21]. HPLC-Analysen zeigten sehr hohe Konzentrationen an Gesamtpolyphenolen in GCE aus den fünf ausgewählten Sorten, die von 16,8 % ± 7,4 % für Sauvignon bis 39,4 % ± 3 % für Villard Noir reichten. Savagnin blanc GCE enthielt die höchste Konzentration an E-Resveratrol (12,0 Prozent ± 4,4 Prozent), während Villard Noir GCE durch die höchsten Gehalte an E-ε-Vinifera (3,6 Prozent ± 0) gekennzeichnet war. 0,2 Prozent) und E-Vitisin B (17,2 Prozent ± 1 Prozent). Diese sortenspezifischen Polyphenolzusammensetzungen könnten verschiedene Ebenen kosmetischer Aktivitäten antreiben.

2.2. Sirtuin-Aktivierung

In einem ersten Schritt haben wir die Anti-Aging-Wirkung von GCE von den fünf Sorten (Villard Noir, Sauvignon, Savagnin, Riesling und Magdeleine Noire des Charentes) bewertet. Abbildung 2A zeigt die Ergebnisse der Sirtuin-Aktivierung durch zwei reine Stilbenoide (E-Resveratrol und E-ε-Viniferin) in einem Konzentrationsbereich von 1–100 µM im Vergleich zu Nicotinamid als Negativkontrolle.

Wie in Abbildung 2A gezeigt, betrug die wirksame Konzentration beider Sirtuinaktivatoren (E-Resveratrol und E-ε-Viniferin) im Vergleich zur Kontrollprobe mindestens 5 µM und erreichte einen 3--fachen Anstieg bei 100 µM.E- Resveratrol führte im Vergleich zu E-ε-Viniferin (95 Prozent ± 15 Prozent bzw. 280 Prozent ± 24 Prozent) zu einer leicht höheren SIRT1-Aktivierung (von 130 Prozent ± 13 Prozent für 5 µM bis 307 Prozent ± 30 Prozent für 100 µM).

Es ist bereits bekannt, dass E-Resveratrol durch die Aktivierung von SIRT1 eine positive Wirkung auf den menschlichen Organismus entfaltet. Horwitz et al., 2003 [16] berichteten, dass E-Resveratrol die MichaelisMenten-Konstante von SIRT1 senkt und das Zellüberleben erhöht, indem es die SIRT1--abhängige Deacetylierung von p53 stimuliert. In Hefe ahmt E-Resveratrol die Kalorienrestriktion durch die Stimulation von SIR2 nach, erhöht die DNA-Stabilität und verlängert die Lebensdauer um 70 Prozent. Stacchiottiet al. (2016) [22] bestätigten, dass die erste Funktion von E-Resveratrol darin besteht, Entzündungen zu reduzieren und oxidative Schäden im Gewebe zu begrenzen. Die Anti-Aging-Eigenschaften von E-Resveratrol über die SIRT1-Aktivierung sind auch mit einer Verbesserung des oxidativen Stoffwechsels in entscheidenden Organen wie Herz, Gefäßen, Muskeln und Nieren verbunden [22]. In anderen Studien stimulierte E-Resveratrol in Gegenwart eines SIRT1-Inhibitors wie Nicotinamid SIRT1 [16]. Darüber hinaus wurden für seine Aktivität konzentrationsabhängige Wirkungen beobachtet. Darüber hinaus erhöht das E-Resveratrol-Molekül durch die Stimulierung der SIRT1--abhängigen Deacetylierung von p53 das Zellüberleben unter ungünstigen Bedingungen [16]. Es wurde auch gezeigt, dass E-Resveratrol die Fähigkeit hat, menschliche Zellen vor Lipidschäden zu schützen, was für die Verhinderung des Abbaus lipophiler Hautbarrierestrukturen von Bedeutung sein kann. Obwohl der vollständige Mechanismus der E-Resveratrol-Aktivität noch durch weitere Studien vollständig erklärt werden muss, ist die Sirtuin-Aktivierung die Hauptaktivität von E-Resveratrol beim Nachweis seiner verschiedenen gesundheitlichen Vorteile [23]. Trotz einer gut beschriebenen Sirtuin-Aktivierung durch E-Resveratrol [1,16] ist über die Wirkung von E-ε-Viniferin noch sehr wenig bekannt. Die Schutzfunktion von E-ε-Viniferin wurde von Fu et al. (2012) [24] in Zellmodellen der Huntington-Krankheit. Es wurde gezeigt, dass E-ε-Viniferin den Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verringert und den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials in Zellen verhindert, die das mutierte Huntington-Protein exprimieren. Die Expression dieses Proteins führt zu einer verringerten Deacetylase-Aktivität von SIRT3 und als Ergebnis zu einer Verringerung der zellulären NAD(plus)-Spiegel und der mitochondrialen Biogenese in Zellen. Den Studien zufolge aktiviert E-ε-Viniferin die AMP-aktivierte Kinase und verbessert die mitochondriale Biogenese [24]. In unserer Forschung haben wir gezeigt, dass E-ε-Viniferin ein Sirtuin-Aktivator ist, der E-Resveratrol entspricht. Wir haben das Potenzial des polyphenolreichen natürlichen GCE-Extrakts zur Aktivierung von SIRT1 weiter getestet. Die meisten GCE (Riesling, Magdeleine Noire, Villard Noir und Savagnin) zeigten im Vergleich zur Kontrollprobe eine relativ hohe SIRT1-Aktivierung. Riesling war mit 171 Prozent SIRT1-Aktivierung die vielversprechendste Sorte, gefolgt von Magdeleine Noire (165 Prozent), Villard Noir (162 Prozent) und Savagnin (142 Prozent). Lediglich GCE aus Sauvignon zeigte keine Induktionswirkung für SIRT1. Die SIRT1-Aktivierung durch GCE von Magdeleine Noire, Villard Noir und Savagnin war mindestens äquivalent zur Aktivierung durch 5 µME-Resveratrol. Die ersten Sirtuin-Aktivatoren wurden 2003 für SIRT1 entdeckt, und der stärkste war E-Resveratrol [1]. Mehrere Studien beschrieben auch die SIRT1-Aktivierung durch botanische Extrakte. Corbi et al., (2018) berichteten über vielversprechende Ergebnisse für Extrakte aus Zitronenstrauch (Lippia citriodora), Rettich (Raphanus sativus) und Tomaten (Solanum Lycopersicum) [25]. Wanget al. berichteten auch über die Sirtuin-Induktionsaktivität traditioneller chinesischer Arzneimittel. Es wurde berichtet, dass Milchklee (Astragalus membranaceus), Chinesischer Ginseng (Panax Ginseng) und Drei-Sieben-Wurzel (Panax Notoginseng) eine schützende Wirkung gegen oxidativen Stress in Mitochondrien ausüben. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Extrakte die deacetylierte Aktivität von SIRT1 verstärkten und die intrazelluläre Bildung reaktiver Sauerstoffspezies hemmten [26]. Dann stellt GCE vielversprechende natürliche Inhaltsstoffe zur Hautverjüngung dar, insbesondere im Vergleich zu den starken SIRT1-Aktivatoren wie E-Resveratrol und E-ε-Viniferin. Es wurde gezeigt, dass die Sirtuin-Regulation durch E-Resveratrol und seine Derivate über komplexe direkte Wechselwirkungen isoformspezifisch wirkt [27]. Resveratrol hemmt menschliches SIRT3 und stimuliert SIRT5 und SIRT1 in Abhängigkeit von komplexen Bindungen mit der katalytischen Tasche.

2.3. Tyrosinase-Hemmung

2.3.1. Enzym-Assay

Abbildung 3A präsentiertTyrosinaseHemmung durch zwei reine Stilbenoide (E-ε-Viniferin und E-Resveratrol) und Abbildung 3B zeigt die Tyrosinase-Hemmung durch GCE aus ausgewählten Sorten im Vergleich zu Kojisäure, E-Resveratrol und E-ε-Viniferin als positive Referenzverbindungen.

Wie in Abbildung 3B gezeigt, sind alle getesteten GCE sowie E-Resveratrol und E-ε-Viniferin relativ aktive Tyrosinase-Inhibitoren. Das höchste Potenzial wurde für E-ε-Viniferin (76 Prozent ± 2 Prozent) und E-Resveratrol (75 Prozent ± 4 Prozent) gezeigt. GCE zeigte verschiedene HemmungskapazitätenTyrosinase. Riesling und Villard Noir GCE waren mit Hemmgraden von 62,5 Prozent bzw. 58,5 Prozent am aktivsten. Auch Magdeleine Noire des Charente GCE (42,5 Prozent) und Savagnin GCE (39,5 Prozent) zeigten sich relativ starkTyrosinaseHemmungsaktivität, während Sauvignon GCE weniger wirksam war, jedoch mit einem recht effizienten Hemmungsniveau (30,4 Prozent). Vitis vinifera L.-Blattextrakte wurden bereits in der Literatur als natürliche Quellen für Tyrosinase-Inhibitoren erwähnt [28]. Es wurde gezeigt, dass ein E-Resveratrol-Derivat, Oxyresveratrol, die Bräunung in trüben Apfelsäften bei einer Konzentration von nur 0,01 Prozent hemmt. Es wurde festgestellt, dass dieses Stilbenoid etwa 0,2 Prozent wirksamer war als Kojisäure [29].

Obwohl Weinstöcke viel mehr Stilbenoide ansammelten als Weinblätter, sind Tyrosinase-Hemmtests an Weinstöcken beispiellos. Tyrosinase-Hemmung von GCE im Vergleich zu Referenzverbindungen mit bekanntenAufhellungAktivität wie E-Resveratrol und E-ε-Viniferin bestätigten das Potenzial von GCE als neuartige kosmetische Wirkstoffe. Die vorliegende Studie zeigte, dass alle getesteten GCE sehr potente Tyrosinase-Inhibitoren waren, was entscheidend ist, um ihr Potenzial als Mittel zur Hautaufhellung zu berücksichtigen.

2.3.2. IC50-Bestimmung

Das kinetische Verhalten von PilzenTyrosinasewährend der Hemmung durch E-Resveratrol und E-ε-Viniferin untersucht. Die kinetischen Parameter für Pilztyrosinase, erhalten aus einem Lineweaver-Burkplot für die Hemmung durch E-Resveratrol (Abbildung 4A, Zeile 1), zeigen, dass Km gleich 1,02 (0 µM, Kontrolle)to war 3,43 (100 µM) mM und Vmax entsprach 74,63 µM/min (0 µM, Kontrolle) gegenüber einem Mittelwert von 66,38 ± 6,44 µM/min für die verschiedenen getesteten E-Resveratrol Konzentrationen. Ein Lineweaver-Burk-Plot für die Hemmung durch E-ε-Viniferin (Abbildung 4B, Zeile 2) zeigt, dass Km gleich 1,02 (0 µM, Kontrolle) bis 7,63 (100 µM) mM und Vmax gleich 74,63 µM/min (0 µM, Kontrolle) gegenüber einem Mittelwert von 73,01 ± 1,14 µM/min für die verschiedenen getesteten E-Resveratrol-Konzentrationen. Die in Fig. 4 dargestellten Ergebnisse zeigten, dass sowohl E-Resveratrol als auch E-ε-Viniferin kompetitive Inhibitoren sind, da eine Erhöhung der Konzentration der Verbindungen zu einer Linie mit einem gemeinsamen Schnittpunkt auf der 1/v-Achse, aber mit unterschiedlichen Steigungen führte. Die Hemmkonstanten jedes Inhibitors, KI für die Bindung an das freie Enzym (zur Bildung des EI-Komplexes) und KIS für die Bindung an den Enzym-Substrat-Komplex (zur Bildung des ESI-Komplexes) wurden unter Verwendung des sekundären Plots und des sekundären Replots bestimmt (Abbildung 4). beziehungsweise. Die sekundären Diagramme, die Steigungen (Km/Vmax) der doppelt reziproken Diagramme gegen die Inhibitorkonzentrationen darstellen, erlaubten uns, eine EI-Dissoziationskonstante (KI) von 46,25 bzw. 24,22 &mgr;M für E-Resveratro und E-ε-Viniferin zu berechnen. Die sekundären Replots, die Abschnitte der doppelt reziproken Beziehung gegen die Inhibitorkonzentrationen darstellen, erlaubten uns, eine ESI-Dissoziationskonstante (KIS) von 364,86 und 2355,73 µM für E-Resveratrol bzw. E-ε-Viniferin zu berechnen. Wenn diese Berechnungen eine mutmaßliche Bindung vorschlugen, die entweder an das freie Tyrosinase-Enzym oder an das mit seinem Substrat assoziierte Tyrosinase-Enzym erfolgen könnte (die vorliegenden Ergebnisse mit 7,9-- und 97,3--mal höheren KIS-Werten für E -Resveratrol bzw. E-ε-Viniferin), deuteten diese Ergebnisse stark auf eine viel schwächere Bindungsaffinität zum Tyrosinase-Enzym-Substrat-Komplex als zum freien Tyrosinase-Enzym hin, was darauf hindeutet, dass der vorherrschende Inhibitionsmechanismus jedes Inhibitors kompetitiv ist.

Wir haben IC50-Werte von 52,93 µM für E-ε-Viniferin und 60,75 µM für E-Resveratrol berechnet. Diese IC50-Werte lagen im Bereich der in der Literatur angegebenen [13].

Die vorliegende Studie stellte fest, dass E-Resveratrol und E-ε-Viniferin das Enzym sehr effektiv hemmen. Auch GCE stellte ausTyrosinaseHemmung auf relativ hohem Niveau. Frühere Berichte zeigten, dass E-ε-Viniferin mit einem IC50=4.1 µM der aktivste Tyrosinase-Inhibitor ist. Es ist viermal wirksamer als Kojisäure (IC50=16,9 µM) und 62-mal aktiver als Ascorbinsäure (IC50=255 µM), um Tyrosinase zu hemmen. E-Resveratrol hat eine moderate inhibitorische Aktivität (IC50=52.8 µM), ganz ähnlich wie Arbutin (IC50=55.1 µM) [12].

2.4. Molekulares Docking für die Bindung von E-Resveratrol und E-ε-Viniferin mit Tyrosinase2.4. Molekulares Docking für die Bindung von E-Resveratrol und E-ε-Viniferin mit Tyrosinase

Abbildung 5 zeigt die Docking-Daten für E-Resveratrol und E-ε-Viniferin. Die Ergebnisse der Docking-Daten zeigen deutlich, dass E-Resveratrol und E-ε-Viniferin ein Tyrosinase-Hemmpotential aufwiesen. Die Affinität für E-ε-Viniferin ist jedoch etwas höher mit einer berechneten Affinität von –7,73 gegenüber –5,95 kcal/mol als Folge von Wechselwirkungen mit His85 und His244 durch Wasserstoffbindungen und π-π-Stapelung gegenüber nur einer Wasserstoffbindungs-Wechselwirkung mit Met280 für E-ε-Viniferin versus E-Resveratrol. Beide Affinitäten waren für diese beiden Stilbenoide stärker als die, die für Kojisäure (–5,7 kcal/mol [30]) sowie für Glabridin (–7,15 kcal/mol [31]) unter Verwendung eines ähnlichen Docking-Ansatzes beobachtet wurden. Im Vergleich zu l-DOPA binden diese beiden Stilbenoide anTyrosinasean derselben Stelle, was ihren kompetitiven Hemmungsmechanismus bestätigt [31]. Die Affinitäten für diese beiden Stilbenoide lagen im Bereich derjenigen, die für l-DOPA beobachtet wurden (dh –6,98 kcal/mol [31]).

Die Ergebnisse bestätigten die Ergebnisse früherer Enzymtests, bei denen E-ε-Viniferin ein potenterer Tyrosinase-Inhibitor war als E-Resveratrol.

TyrosinaseDysfunktionen schreiten mit zunehmendem Alter voran und können zum malignen Melanom sowie zu Pigmentstörungen wie Sommersprossen oder Melismen führen [17]. E-Resveratrol und E-ε-Viniferin-reiches GCE sind eine gute Alternative als natürliche Quelle dieser Stilbenoide zur Vorbeugung einiger Pigmentstörungen.

2.5. Bioverfügbarkeit und Hautdurchlässigkeitspotential

Abbildung 6 zeigt die entscheidenden physikalisch-chemischen Eigenschaften der Hauptbestandteile von GCE, die ihre allgemeine Bioverfügbarkeit und Hautdurchlässigkeit bestimmen.

Die Permeabilitätsbewertung bewertet auf den ersten Blick die Hautpenetrationsfähigkeit eines Moleküls. Rosafarbene zentrale Zonen in den Radardiagrammen von Abbildung 6 stellen den optimalen Bereich für jede Eigenschaft dar. Der Logarithmus des Verteilungskoeffizienten logP (Lipophilie) sollte Werte zwischen −0,7 und plus 5 erreichen.0, das Molekulargewicht (Molekülgröße) sollte zwischen 150 und 500 g/M liegen , die Polarität (topologische polare Oberfläche, TPSA) sollte zwischen 20 und 130 Å2 liegen, die Löslichkeit (log S) sollte nicht höher als 6 sein, die Sättigung (Anteil der Kohlenstoffe in der sp3-Hybridisierung) sollte nicht weniger als 0,25 sein und die Flexibilität nicht mehr als 9drehbare Bindungen [32]. Basierend auf diesen Berechnungen wurde festgestellt, dass die GCE-Moleküle, die am wahrscheinlichsten vom Körper absorbiert werden, Catechin und Epicatechin (mit den gleichen physikalisch-chemischen Eigenschaften), E-Resveratrol, E-Piceatannol sowie Ampelopsin A sind. Diese Moleküle wurden durch die richtige Molekülgröße charakterisiert , Elektronenverteilung, Polarität und Molekülcharakter. Moleküle, die durch ein höheres Molekulargewicht gekennzeichnet sind, wie E-Miyabenol C, E-Vitisin B sowie Hopeaphenol und Isohopeaphenol (mit den gleichen physikalisch-chemischen Eigenschaften), sind aus physikalisch-chemischer Sicht für die Assimilation bemerkenswert, da sie die physikalischen Barrieren wie kaum überwinden Membranen sowie der Dermis. E-ε-vinifera erfüllt die meisten Regeln, die für eine gute Hautdurchlässigkeit erforderlich sind. Die Polarität, Lipophilie, Unlöslichkeit, Flexibilität und Molekülgröße der Moleküle wurden durch mathematische Gleichungen abgeschätzt. Hervorzuheben ist die Tatsache, dass es sich bei den Berechnungen nur um Schätzmethoden für die Durchlässigkeit der gesamten Haut handelt und dermale Penetrationstests erforderlich sind, um die Vorhersagen zu bestätigen.

In den vergangenen Jahrzehnten wurden verschiedene Regelwerke aufgestellt, die dabei helfen, geeignete Vorhersagen zur Arzneimittelabsorption zu definieren. Die beliebtesten Kriterien sind die Fünferregel von Lipinski [33], aber es gibt auch mehrere andere Ansätze [34–37]. Tabelle 2 enthält die Informationen über die Übereinstimmung von GCE-Polyphenolen mit allgemein bekannten Bioverfügbarkeitsregeln: Lipinski (MW < 500,="" logp="">< 4,15,="" anzahl="" der="" nor-o-atome="">< 10,="" anzahl="" der="" n-="" oder="" oh-gruppen="">< 5)="" [="" 33],="" ghose="" (160="">< mw="">< 480,="" −0,4="">< logp="">< 5,6,="" 40="">< mw="">< 130,="" 20="">< anzahl="" der="" atome="">< 70)="" [34],="" veber="" (anzahl="" drehbarer="" bindungen="">< 10,="">< 140)="" [35],="" egan="" (logp="" <="" 5.88,="" tpsa="" <="" 131.6)="" [36]="" and="" muegge="" (200="" <="" mw="" <="" 600,="" −2="" <="" logp="" <="" 5,="" tpsa="">< 150,="" numbers="" of="" rings="" <="" 7,="" number="" of="" carbons="" >="" 4,="" number="" of="" heteroatoms="" >="" 1,="" number="" of="" rotatable="" bonds="" <="" 15,="" nha="" <="" 10,="" nhd="" <="" 5)="">

Basierend auf diesen Berechnungen kann mit relativ hoher Wahrscheinlichkeit angegeben werden, welche Strukturen am ehesten die Hautbarriere durchdringen. GCE-Polyphenole mit MW über 500 g/mol (Hopeaphenol, Isohopeaphenol, E-Miyabenol C und E-Vitisin B) sind gleichzeitig zu lipophil (logP > 5) und durch eine ungeeignete Elektronenverteilung (TPSA > 140) sowie Wasserstoffbindungseigenschaften gekennzeichnet (NHD > 5 oder NHA > 10). Darüber hinaus können molekulare Volumina dieser Moleküle ihre Hautresorption einschränken und ihre molekularen Bindungsverletzungen würden räumlich gesehen ihre Fähigkeit, innerhalb der Hautstrukturen aktiv zu sein, zusätzlich einschränken. Solche Verbindungen verbleiben nach topischer Applikation als Rückstand auf der Oberfläche oder dringen je nach Hautzustand nur in äußere Schichten des hydrophoben Stratum corneum ein. Hautbarriereeigenschaften basieren auf Lipiddoppelschichten. Die erfolgreichen transdermalen Arzneimittel wurden durch Parameterschwellenwerte begrenzt, die noch restriktiver sind als die Fünferregel [19]. Daher erklären neu verfügbare statistische Berechnungen sehr genaue Regeln für die transdermale Verabreichung von Wirkstoffen. Die Grundlage bilden hauptsächlich ihre physikalisch-chemischen Parameter. Die neuen Schwellenwerte für aktuelle transdermale Arzneimittel sind MW < 335,="" nhd="" kleiner="" oder="" gleich="" 2,="" nha="" kleiner="" oder="" gleich="" 5="" und="" logp="">< 5="">

Trotz ihrer Unfähigkeit, die Stratum-corneum-Barriere zu überwinden, bleiben hochmolekulare Stilbenoide (Trimere und Tetramere von Resveratrol) aufgrund ihrer vorteilhaften Wirkungen für die Haut immer noch von großem Interesse. Wie bereits in vielen Studien gezeigt, weisen diese Metaboliten starke antioxidative Eigenschaften auf [38] und zeichnen sich parallel aufgrund ihres Charakters durch eine hohe Kompartimentierung für interzelluläre Zementbestandteile und die lipophile Schutzbarriere der Haut aus. Bei schädigenden Zuständen und übertrockener Haut können diese Polyphenole eine wichtige Rolle als aktive Weichmacher mit regenerativer und antioxidativer Wirkung auf der Hautoberfläche spielen [39].

Unter Berücksichtigung der oben genannten Regeln für die Hautpenetration sind die potentesten Kandidaten für kosmetische Wirkstoffe dann Catechin, Epicatechin, E-Piceatannol, E-Resveratrol und E-ε-Vinifera. Unsere Berechnungen sagen voraus, dass diese Polyphenole Hautbarrieren überwinden und wirken können innerhalb der Struktur der Dermis, die in ihrer Aktivität für enzymatische Funktionen der Haut besonders wichtig ist. Bestätigte ModulationsfähigkeitTyrosinaseund Sirtuin-Aktivität und ihre gute Vorhersage für die Hautpenetration ermöglichen es den niedermolekularen Stilbenoiden (Monomere und Dimere von Resveratrol) wie E-Resveratrol und E-ε-Vinifera, als verjüngende und verjüngende Wirkung zu wirkenAufhellungAgenten. Darüber hinaus sorgt ihre hohe antioxidative Aktivität für eine mehrstufige Wirkung auf die Hautzellen. GCE sind Mischungen von Polyphenolen, die verschiedene biologische Aktivitäten aufweisen und sich durch unterschiedliche physikalisch-chemische Eigenschaften auszeichnen. Daher gewährleisten die Extrakte multidirektionale therapeutische Wirkungen sowie einen wirksamen Schutz für die menschliche Haut.

Daher kann behauptet werden, dass polyphenolreiches GCE in Hautpflegebehandlungen vorteilhafter wäre als eingekapselte reine Stilbenoide [22]. Weitere Experimente an Hautmodellen sind noch erforderlich, um das Potenzial von GCE als natürlicher multifunktionaler Inhaltsstoff für umweltfreundliche Dermokosmetika zu bestätigen.

3. Materialien und Methoden

3.1. Chemikalien und Reagenzien

E-Resveratrol und andere Standards wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) gekauft. E-&egr;-vinifera wurde wie zuvor beschrieben aus Weinstöcken gereinigt [40]. PilzTyrosinaseLösung und L-DOPA wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) erhalten. Ultrareines Wasser wurde von einem Millipore Milli-Q Wasserreinigungssystem (Merck Millipore, Stadt, Deutschland) erhalten.

3.2. Pflanzenmaterial

Trauben von fünf ausgewählten Rebsorten (Villard Noir, Sauvignon, Savagnin, Riesling und Magdeleine Noire des Charentes) wurden im Januar 2016 im INRA-Traubendepot „Domaine de Vassal“ (34340 Marseillan-Plage, Frankreich: http://www .1.montpellier.inra.fr/vassal).Für jede Sorte wurden 25 Traubenstengel geerntet, nachdem fünf Stengel von fünf verschiedenen Reben beschnitten worden waren. Traubenstängel wurden in 10 cm lange Stücke geschnitten und 10 Wochen lang bei 20 ◦C im Dunkeln gelagert, was eine Akkumulation von E-Resveratrol und E-Piceatannol nach der Ernte ermöglicht. Anschließend wurden Traubenstiele zunächst mit einer gekühlten Analysenmühle (Ika-Werke, Staufen, Deutschland) und zusätzlich mit einer Schneidmühle (Polymic PX-MFC 90 D, Kinematica AG, Luzern, Schweiz) auf 1 mm Korngröße gemahlen. Das Pulver wurde lyophilisiert und bis zur Extraktion bei −20 °C gelagert [41]. Insgesamt wurden 20 g getrocknetes Pulver mit 500 ml einer Ethanol/Wasser-Mischung (60/40; v/v) extrahiert. Die Proben wurden 45 min unter Rückfluss bei 83 °C extrahiert und filtriert. Dann wurden die Überstände unter Verwendung eines Heidolph 94200 Rotationsverdampfers (Bioblock, Schwabach, Deutschland), gekoppelt mit einer Vakuumpumpe (Vacuubrand PC500 Serie, Wertheim, Deutschland), eingedampft. Die resultierenden Extrakte wurden lyophilisiert, wodurch getrocknetes GCE für weitere In-vitro-Assays verfügbar wurde.

3.3. HPLC-Analysen

Das HPLC-System bestand aus einem Waters 717 plus Autosampler, einem Waters 996 Photodioden-Array-Detektor und einer Waters 600 Controller-Pumpe (Waters, Milford, MA, USA) und wurde durch die Empower 2-Software (Waters , Milford, MA, USA). Wir erreichten die Analyttrennung durch die Injektion von 20 µL Extrakten auf eine mit 3 µm Partikeln (250 × 4 mm, Multospher 120 RP18HP; CS-Service, Langerwehe, Deutschland) gepackte Säule bei 24 ◦C. Die mobile Phase bestand aus 0,1 % Phosphorsäure (Lösungsmittel A) und Acetonitril (Lösungsmittel B), gepumpt mit 0,5 ml min–1. Wir verwendeten einen linearen Gradienten, der bei 5 Prozent B begann und in 60 Minuten auf 72,5 Prozent anstieg. Die Quantifizierung erfolgte unter Verwendung reiner Standards unter Verwendung einer Fünfpunkt-Kalibrierungskurve (0–100 ppm) im Maxplot-Detektionsmodus. Das Isohopeaphenol wurde unter Verwendung der Hopeaphenol-Eichkurve quantifiziert.

3.4. Sirtuin-Aktivierung

Die Bewertung der Sirtuin-Aktivierung (SIRT1) wurde mit GCE bei 50 µg/ml im Vergleich zu 10 µM reinem E-Resveratrol und E-ε-Viniferin (als Aktivatoren) und Nicotinamid (als Inhibitor) durchgeführt. Die SIRT1-Aktivität wurde mit SIRT1 bestimmt Assay-Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers und unter Verwendung eines Fluoreszenzspektrometers (Biorad VersaFluor, Marnes-la-Coquette, Frankreich) mit 340 nm Anregungs- und 430 nm Emissionswellenlänge. Die relative SIRT1-Aktivität wurde als relativer Prozentsatz zur entsprechenden Kontrolle (Zugabe des gleichen Volumens an Extraktionslösungsmittel) für jeden Extrakt angegeben.

3.5. Tyrosinase-Hemmung

3.5.1. Enzym-Assay

Der Tyrosinase-Hemmtest wurde wie von Neely et al. (2009) [42]. Jeder 1-ml-Test enthielt eine Endkonzentration von 100 mM Natriumphosphat (pH 6,5) und 2 mM L-DOPA. Schließlich wurden 0,2 mg/ml Pilz-Tyrosinase-Lösung (Sigma-Aldrich) zu der Mischung gegeben. Kontrolle, mit einer gleichen Menge des Extraktionslösungsmittels, das den Extrakt ersetzt, wurde routinemäßig durchgeführt. Reaktionsprozesse wurden unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (BioTek ELX800; BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) bei einer Wellenlänge von 475 nm verfolgt. DasTyrosinasedie Hemmwirkung wurde als Prozentsatz der Hemmung relativ zur entsprechenden Kontrolle für jeden Extrakt ausgedrückt. Die in einer Studie angewendeten Standardverbindungskonzentrationen betrugen 100 µM und die Konzentration der getesteten Extrakte betrug 50 µg/ml. Die Experimente wurden dreimal wiederholt und die durchschnittlichen Ergebnisse mit Standardabweichungswerten sind in Fig. 3B angegeben.

Cistanche hemmen die Tyrosinase-Expression

3.5.2. IC50-Bestimmung

Um den Bereich der für die Berechnung des IC50-Wertes benötigten Inhibitormengen anzunehmen, wurden verschiedene Konzentrationen von E-Resveratrol und E-ε-Viniferin verwendet. Die für die Berechnungen verwendeten Assays wurden innerhalb des Bereichs von Inhibitoren von 1 bis 100 &mgr;M hergestellt. Im Fall einer signifikanten Änderung der Form der Aktivitäts-Zeit-Kurve wurden die Frequenzen auf der Grundlage von Steady-State-Frequenzbereichen berechnet. Die Konzentration des Inhibitors, die die 50-prozentige Hemmung der Tyrosinase-Aktivität verursacht, wurde aus den Prozent-Aktivitäts-Inhibitor-Kurven extrapoliert [42]. Die Experimente wurden dreimal wiederholt und der Durchschnitt der IC50-Werte ist in den Fig. 4A und 4B angegeben.

3.6. Andockdaten für die Bindung von E-Resveratrol und E-ε-Viniferin mit Tyrosinase

Molekulare Docking-Simulation von E-Resveratrol und E-ε-Viniferin wurde mit der Software Ligplot plus (European Bioinformatics Institute, Cambridge, UK), Autodock Vina (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA) und Pymol v2.1.1 ( Schrödinger, New York, NY, USA), um die Konformation dieser Molekülliganden innerhalb der geeigneten Zielbindungsstelle vorherzusagenTyrosinase(PDB: 2Y9X).

3.7. Bioverfügbarkeit und Hautdurchlässigkeitspotential

Das Arzneimittelähnlichkeitspotential sowie die Hautdurchlässigkeit als entscheidende Faktoren für die Wirksamkeit des aktiven Moleküls können als ein komplexes Gleichgewicht verschiedener physikalisch-chemischer Eigenschaften und Strukturmerkmale definiert werden, die bestimmen, ob das Molekül den bekannten Arzneimitteln ähnlich ist. Diese Eigenschaften, hauptsächlich Hydrophobizität, elektronische Verteilung, Wasserstoffbindungseigenschaften, Molekülgröße, Flexibilität und das Vorhandensein verschiedener pharmakophorischer Merkmale, beeinflussen das Verhalten von Molekülen in einem lebenden Organismus, einschließlich Bioverfügbarkeit, Transporteigenschaften, Affinität zu Proteinen, Reaktivität, Toxizität, Stoffwechsel Stabilität und viele andere [43]. Einfache Zählkriterien (wie Grenzwerte für das Molekulargewicht, logP oder die Anzahl der Wasserstoffbrückendonoren oder -akzeptoren) haben ebenfalls eine relativ begrenzte Anwendbarkeit und sind nur nützlich, um einige der potenziell aktiven Moleküle aus der weiteren Forschung auszuschließen [19]. Die Molecular Polar Surface Area (TPSA)-Werte für alle Strukturen wurden basierend auf der von Ertl et al. veröffentlichten Methodik berechnet. [44] als Summe der Fragmentbeiträge im gesamten Molekül. O- und N-zentrierte Polarfragmente wurden ebenfalls berücksichtigt. Verfahren zur Berechnung des Molekülvolumens sowie Werte des Logarithmus des Verteilungskoeffizienten (log) wurden unter Verwendung von SwissADME entwickelt [32]. 3D-Molekülgeometrien für einen Trainingssatz wurden vollständig durch die semi-empirische AM1-Methode optimiert [45,46]. Lipinskis „Rule of Five“ besagt, dass die meisten „wirkstoffähnlichen“ Moleküle einen logP-Wert von weniger als oder gleich 5, ein Molekulargewicht von weniger als oder gleich 500, eine Anzahl von Wasserstoffbindungsakzeptoren von weniger als oder gleich 10 und eine Anzahl von Wasserstoffbindungsdonoren von weniger aufweisen größer oder gleich 5. Moleküle, die gegen mehr als eine dieser Regeln verstoßen, können eine sehr geringe oder gar keine Bioverfügbarkeit aufweisen [33]. Berechnungen zur Vorhersage der biologischen Aktivität basieren auf Bayes'scher Statistik, um Strukturen von repräsentativen Liganden, die auf dem bestimmten Ziel aktiv sind, mit Strukturen von inaktiven Molekülen zu vergleichen und Substrukturmerkmale (die wiederum physikalisch-chemische Eigenschaften bestimmen) zu identifizieren, die für aktive Moleküle typisch sind [47].

4. Schlussfolgerung

Mit Polyphenol angereichertes GCE war in der Lage, SIRT1 in ähnlichen Konzentrationen wie 5 µM E-Resveratrol oder E-ε-Viniferin zu aktivieren. HautAufhellungPotenzial überTyrosinaseDer Inhibitionsassay zeigte, dass die GCE-Kapazitäten mit denen von reinem E-Resveratrol und E-ε-Viniferin vergleichbar waren. Besonders Villard Noir und Riesling GCE könnten als Hautaufhellungsmittel nützlich sein und können gegen dunkle Flecken in der Dermokosmetik verwendet werden. Darüber hinaus zeigte die Arzneimittelähnlichkeit von GCE-Komponenten verschiedene Fähigkeiten bei der Hautpermeation, was eine ausreichende Wirksamkeit in verschiedenen Dermisstrukturen bereitstellt. Hautphysiologische Prozesse, die durch diese Wirkstoffe unterstützt werden, gewährleisten die richtigen Hautbarrierefunktionen sowie eine effiziente Regeneration des Hautgewebes. Zusammenfassend ist die mögliche Anwendung von GCE nicht nur für die Industrie von enormem Interesse, sondern auch für Verbraucher, die zunehmend natürliche Inhaltsstoffe fordern, die in der sogenannten „Öko-Kosmetik“ benötigt werden.

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