Die gesundheitsfördernden Eigenschaften des Weinrebenkernextrakts und sein Einfluss auf ausgewählte biochemische Marker in Blut, Leber und Nieren von Rattus Norvegicus
Mar 10, 2022
Abstrakt:Cadmium (Cd) ist ein Schwermetall, das in allen Bereichen der Umwelt einschließlich der Nahrungskette vorkommt. Im Körper verursacht es oxidativen Stress, indem es freie Radikale produziert, die für die Zellen schädlich sind. Traubenkernextrakt (GSE) enthält eine breite Palette biologisch aktiver Komponenten, die helfen, die nachteiligen Auswirkungen freier Radikale zu neutralisieren. In dieser Studie wurden die Wirkungen von GSE, hergestellt aus der halbresistenten Rebsorte Season, die reich an Phenolen ist, auf biochemische Marker von Wanderratten, die den Wirkungen von Cadmium ausgesetzt waren, überwacht. GSE erhöhte die antioxidative Plasmaaktivität und in derNierenund der Leber wurde der Cd-Gehalt durch die gleichzeitige Gabe von GSE signifikant gesenkt. Dementsprechend wurden die durch Cadmium verursachte Zunahme des Kreatiningehalts und der Alanin-Aminotransferase-Aktivität sowie die Abnahme der Katalase- und Superoxid-Dismutase-Aktivitäten durch die gleichzeitige Verabreichung von GSE verlangsamt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Traubenkernextrakt eine Schutzwirkung gegen die Aufnahme von Schwermetallen in den Organismus bietet.
1. Einleitung
Cadmium (Cd) ist ein Schwermetall, das in allen Bereichen der Umwelt vorkommt; es ist Teil der Erdkruste, ist im Wasser enthalten, reichert sich in Pflanzen an und ist in Organismen vorhanden. Neben der Nahrungskette (in Bezug auf Pflanzen sind die meisten Getreide, Hackfrüchte und Gemüse Quellen, während unter den tierischen Organen vor allem die Leber uNierensind eine Quelle), eine wichtige Quelle von Cadmium für den Menschen ist Zigarettenrauch, Ausdünstungen aus verschiedenen Verbrennungsarten, metallurgische Industrien und einige Elektroinstallationen [1,2]. Im Körper bindet Cadmium überwiegend an Metallothionein, Albumin und andere Plasmaproteine im Blut. Cadmium ist ein gefährliches toxisches Metall, das oxidativen Stress verursacht, indem es freie Radikale produziert, die für die Zellen schädlich sind. Freie Radikale können Proteine, Lipide, Enzyme und DNA schädigen und müssen daher durch Antioxidantien neutralisiert werden, bevor sie in die Zellen gelangen [3].
Cd bewirkt, wenn es nicht neutralisiert wird, den Zerfall roter Blutkörperchen [4], reichert sich im Organismus – insbesondere in der Leber – anNieren– und aufgrund seiner Ähnlichkeit mit Zink, das ein essentielles Element ist, tritt es leicht in enzymatische Reaktionen ein und ist an biochemischen Prozessen beteiligt [5]. Es wird nur sehr langsam und schwer aus dem Organismus ausgeschieden [6]. Dass Antioxidantien vor oxidativem Stress und Schwermetallschäden schützen können, ist bekannt und wurde dieser experimentellen Arbeit zugrunde gelegt. Traubenkernextrakt (GSE) enthält eine breite Palette biologisch aktiver Komponenten in seiner Matrix [7], die dazu beitragen, die nachteiligen Auswirkungen freier Radikale zu neutralisieren. GSE schützt Zellen vor Schäden, indem es zelluläre oxidative Schäden reguliert, Organschäden reduziert, das Gleichgewicht zwischen Oxidantien und Antioxidantien verbessert und die Freisetzung von Entzündungsmediatoren reduziert. Es hat auch entzündungshemmende, antiapoptotische und proproliferative Wirkungen [8]. Von besonderer Bedeutung ist der hohe Gehalt an kondensiertem Flavan-3-ol oder Procyanidinen, die als alternative Behandlungsmethode für schwere Erkrankungen untersucht werden [9,10]. Der Gehalt und die Zusammensetzung der Traubenkernphenole sowie die antioxidative Aktivität des Samenextrakts können jedoch durch Rebsorte, Unterlage, klimatische Bedingungen oder Anbautechniken beeinflusst werden [11–13] und damit die antioxidativen Eigenschaften, wie z sowie Schutzwirkungen eines Betonextraktes nicht ohne weiteres vorherzusagen. Das Ziel dieser Arbeit war es, die protektive Wirkung von GSE, hergestellt aus der halbresistenten Rebsorte Cerason, auf biochemische Marker in Blut, Plasma, Leber und zu untersuchenNierenvon Wanderratten, die der Wirkung von Cadmium ausgesetzt waren.
Schlüsselwörter:Traubenkernextrakt; Antioxidantien; Cadmium; rattus norvegicus; biochemische Marker; Schutzwirkung; Niere, Niere
CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/NIERENFUNKTION VERBESSERN
2. Ergebnisse und Diskussion
2.1. Antioxidative Aktivität und phytochemische Zusammensetzung von Traubenkernextrakt
Der aus der halbresistenten Sorte Cerason hergestellte Traubenkernextrakt wurde auf antioxidative Aktivität, Gesamtpolyphenolgehalt und ausgewählte einzelne Antioxidantien getestet. Die antioxidative Aktivität wurde spektrophotometrisch unter Verwendung von vier Methoden bestimmt, die auf unterschiedlichen Prinzipien basieren (DPPH• , ABTS• plus , FRAP, FR) und die gesamten polyphenolischen Verbindungen wurden mit der Folin-Ciocalteu-Methode bestimmt. Abhängig von der verwendeten Methode lag die antioxidative Aktivität im Bereich von 7 bis 31 mg/g Gallussäureäquivalent (GAE) und der Gesamtpolyphenolgehalt betrug 9,3 mg/g GAE (Tabelle 1). Die Ergebnisse dieses Teils des Experiments wiesen auf das hohe antioxidative Potenzial in Traubenkernen hin.
2.2. In-vivo-Bestimmung der Traubenkernextraktwirkung bei der Ratte
2.2.1. Bestimmung des Cadmiumgehalts in Blut, Leber und NierenCadmium ist das am weitesten verbreitete toxische Metall in Futtermitteln. Nach oraler Verabreichung wird es aus dem Darm resorbiert, zur Leber transportiert und an Thiolgruppen von Metallothionein (MT) konjugiert. Abgesehen davon kann Cd auch an Albumin oder andere Proteine im Blut gebunden werden [14]. Anschließend reichert sich Cd im Körper an, wird nur langsam über Urin und Kot aus dem Körper ausgeschieden und hat eine biologische Halbwertszeit von etwa 20 Jahren. Die größte Menge (etwa ein Drittel) an Cadmium findet sich in derNiereKortex. Im Blut ist das meiste Cadmium (etwa 90 Prozent) in den roten Blutkörperchen vorhanden. Es ist für eine Vielzahl von Organen toxisch und die Hauptziele sind dieNieren, Knochen und Lunge [15–17]. Es wurde berichtet, dass GSE die Cadmiumkonzentrationen in den roten Blutkörperchen und im Blut senktNieren,während sein Gehalt in der Leber über eine Zunahme berichtet wurde [14]. Die Ergebnisse für den Cadmiumgehalt im Blut in dieser Studie sind in Abbildung 1A dargestellt. Im Blut der Tiere wurden zu Versuchsbeginn 3,2 µg/kg Cadmium gefunden. Während des Versuchs war nach 14 Tagen der mittlere Cadmiumwert in der Gruppe mit Zusatz von GSE und Cadmium signifikant höher als in anderen Gruppen (10,8 µg/kg, p=0,023). Nach 28 Tagen war die Variabilität der Daten zu hoch, um eine statistische Signifikanz zu beobachten.
In den Lebern (Abbildung 1B) der Versuchstiere wurde zu Versuchsbeginn kein Cadmium nachgewiesen. Dementsprechend wurde in den Lebern der Tiere aus der Kontroll- und der GSE-Gruppe während des Versuchs kein Cadmium nachgewiesen. Dagegen betrug nach 14 Versuchstagen der mittlere Cadmiumwert in der Gruppe mit Cadmiumzusatz 5,8 mg/kg und in der Gruppe mit Cadmium- und GSE-Zusatz 5,2 mg/kg. Diese beiden Werte unterschieden sich signifikant von der Kontrollgruppe (p=0.002 und p=0.018 für die Gruppe nur mit Cadmium und die Gruppe mit Cadmium bzw. GSE). Nach 28 Tagen war der Mittelwert in der Gruppe mit Cadmium-Zusatz auf 6,7 mg/kg angestiegen, was sich signifikant von dem leicht auf 4,8 mg/kg gesunkenen Cadmium-Gehalt in der Gruppe mit Cadmium- und GSE-Zusatz unterschied (p=0.008).
Zu Beginn des Versuchs wurde kein Cadmium in der nachgewiesenNieren(Abbildung 1C) der Versuchstiere. Demnach wurde in der kein Cadmium nachgewiesenNierender Tiere aus der Kontroll- und GSE-Gruppe während des Versuchs. Dagegen betrug der Cadmium-Mittelwert nach 14 Tagen in der Gruppe mit Cadmium-Zusatz 9,5 mg/kg und in der Gruppe mit Cadmium- und GSE-Zusatz 6,5 mg/kg. Diese beiden Werte unterschieden sich signifikant von der Kontrollgruppe (p < 0,001="" für="" beide="" gruppen).="" nach="" 28="" tagen="" war="" der="" mittelwert="" in="" der="" gruppe="" mit="" cadmium-zusatz="" auf="" 16,6="" mg/kg="" angestiegen,="" was="" sich="" deutlich="" von="" dem="" nur="" geringfügig="" auf="" 10,4="" mg/kg="" angestiegenen="" cadmium-gehalt="" in="" der="" gruppe="" mit="" cadmium-="" und="" gse-zusatz="" unterschied.="" kg="" (p="0.009)." so="">Nierenund in der Leber wurde der Cd-Gehalt durch GSE-Verabreichung signifikant gesenkt. GSE enthält phenolische Verbindungen, die Cd chelatieren können, wodurch die Akkumulation von Cd verringert wird. Die Bildung dieser Chelate führte wahrscheinlich zu einer verringerten Fähigkeit der Proteine, Cd zu binden, wodurch dieses effektiver aus dem Körper ausgeschieden werden konnte [18].
2.2.2. Bestimmung des Kreatinin- und Harnstoffgehalts
In Bezug auf die Cadmiumakkumulation in derNieren, dasNiereist eines der wichtigsten Zielorgane der Cd-induzierten Toxizität. deshalb, dieNiereIm Plasma wurden die Marker Kreatinin und Harnstoff bestimmt. Die Bestimmung von Kreatinin ist ein guter Indikator für die glomeruläre Filtration und dient hauptsächlich der VerlaufskontrolleNierenerkrankung. Die Beziehung zwischen Kreatininkonzentration und glomerulärer Filtration ist hyperbolisch; mit abnehmender glomerulärer Filtration nimmt auch die Kreatininsekretion ab [19]. Eine erhöhte Aufnahme des Schwermetalls Cadmium führt zuNierenschäden, und daher reduzierte Kreatininsekretionseffizienz. Infolgedessen weist ein erhöhter Kreatininspiegel im Blut auf aNieren-Störung [20].
In unserer Studie wurden die Kreatininspiegel durch Cd erhöht, in Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Ergebnissen [21]. Der mittlere Wert des Kreatiningehalts (Abbildung 2A) bei den Versuchstieren betrug zu Beginn des Experiments 3,0 mg/l. In der Gruppe, die Cadmium erhielt, gab es einen signifikanten Anstieg der überwachten Werte auf 5,1 mg/L (nach 14 Tagen, p=0.015) und auf 6,2 mg/L (nach 28 Tagen, p < 0.001).="" in="" der="" gruppe,="" der="" gse="" zusammen="" mit="" cadmium="" verabreicht="" wurde,="" war="" der="" anstieg="" dieses="" markers="" geringer="" (4,2="" mg/l="" nach="" 14="" tagen="" und="" 5,5="" mg/l="" nach="" 28="" tagen)="" und="" nur="" nach="" 28="" tagen="" statistisch="" signifikant="" im="" vergleich="" zur="" kontrollgruppe="" (="" p="">< 0,001).="" somit="" wurde="" der="" anstieg="" der="" kreatininkonzentration="" durch="" die="" gleichzeitige="" gabe="" von="" gse="" verlangsamt,="" was="" auf="" eine="" verringerung="" der="" durch="" cadmium="" verursachten="" toxischen="" wirkung="" hindeutet.="" in="" der="" gruppe,="" die="" nur="" gse="" erhielt,="" gab="" es="" normale="">
Harnstoff ist das mengenmäßig wichtigste Abbauprodukt von Aminosäuren und Proteinen. Es wird in der Leber aus Ammoniak gebildet, das durch Desaminierungsreaktionen während des Aminosäurestoffwechsels freigesetzt wird. Aus dem Organismus wird es hauptsächlich durch die ausgeschiedenNierenB. durch glomeruläre Filtration und tubuläre Resorption [22]. Im Falle desNierenerkrankungen, übersteigt die Rate der Harnstoffproduktion die Rate seiner Clearance, was zu einem Anstieg des Harnstoffspiegels im Blut führt. Darüber hinaus hemmt Cadmium den Einbau von Aminosäuren in Proteine und verursacht Urämie [21]. Andererseits sinkt bei Versagen der Leberfunktion die Harnstoffsynthese und damit auch seine Konzentration im Plasma [20]. Somit hängt die Blutharnstoffkonzentration vom Nahrungseiweißgehalt ab,Nieren-Ausscheidung und die Stoffwechselfunktion der Leber.
In unserer Studie wurden die Harnstoffspiegel durch Cd erhöht, in Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Ergebnissen [21]. Der mittlere Wert des Harnstoffgehalts (Abbildung 2B) bei den Versuchstieren betrug zu Beginn des Experiments 207 mg/L. In der Gruppe, die Cadmium erhielt, stiegen die überwachten Werte signifikant auf 329 mg/L (nach 14 Tagen) und 425 mg/L (nach 28 Tagen). In der Gruppe, bei der GSE zusammen mit Cadmium verabreicht wurde, war der Anstieg dieses Markers nur geringfügig geringer – 325 mg/L nach 14 Tagen und 381 mg/L nach 28 Tagen. Sowohl die Gruppen, die nur Cadmium als auch Cadmium zusammen mit GSE erhielten, unterschieden sich signifikant von der Kontrollgruppe nach 14 (p=0,001 bzw. p=0,002) und 28 Tagen des Experiments (p < 0,001="" für="" beide).="" in="" der="" gruppe,="" die="" nur="" gse="" erhielt,="" wurden="" normale="" werte="">
2.2.3. Bestimmung der Plasma-Antioxidans-Aktivität
Cadmium induziert eine Reihe von Wirkungen, die hauptsächlich mit oxidativem Stress zusammenhängen. Da Cd nicht redoxaktiv ist, erzeugt es nicht direkt reaktive Sauerstoffspezies. Dennoch wurde ihre Produktion nach Cd-Exposition in vielen Studien berichtet und von Cuypers et al. [23]. Zu den Mechanismen, die während der Cd-Exposition zu einer Redoxstörung führen, gehören der Abbau von reduziertem Glutathion, der durch die Affinität von Cd zu Thiolgruppen verursacht wird, der Ersatz von Fe durch Cd in Proteinen, was zu erhöhten Konzentrationen von redoxaktivem freiem Fe führt, mitochondriale Dysfunktion und die Induktion von NADPH-Oxidasen, die die Bildung von Superoxidradikalen katalysieren [23]. Während oxidativem Stress können antioxidative Verbindungen wie Phenole die Produktion neuer reaktiver Spezies durch ihre Umwandlung in stabile Radikalformen beenden. Daher können phenolreiche Pflanzenextrakte Schutzwirkungen gegen Cd oder Cd-haltige Verbindungen bieten [24].
In dieser Studie betrug der mittlere Wert der antioxidativen Aktivität im Plasma (Abbildung 3) bei den Versuchstieren zu Beginn des Experiments 0,71 mg/L. In allen Versuchsgruppen wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe ein leichter Anstieg beobachtet. Der einzige signifikante Unterschied war jedoch der zwischen der mit GSE behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe nach 28 Tagen (p=0.012), was eine positive Wirkung von GSE auf die Antioxidansaktivität im Plasma bestätigte. Zuvor gemeldete Ergebnisse sind mehrdeutig; manchmal wurde eine Erhöhung des antioxidativen Potentials im Plasma, verursacht durch GSE, festgestellt [25] und manchmal nicht [14].
2.2.4. Bestimmung von ALT- und AST-Aktivitäten
Oxidativer Stress hängt mit einem Verlust der funktionellen Integrität der Membranarchitektur zusammen, der durch eine erhöhte Lipidperoxidation verursacht wird. Die erhöhte Permeabilität der Zytoplasmamembran wiederum führt zum Austritt von hepatischen Markerenzymen (ALT und AST) ins Blut [14]. Tatsächlich sind ALT und AST selbst bei begrenzter Leberschädigung aufgrund einer Intoxikation diagnostisch signifikant, und ihre durch Cadmium verursachte Erhöhung des Serumspiegels wurde bereits früher berichtet [14] und wurde durch diese Studie bestätigt. Der mittlere ALT-Aktivitätswert (Fig. 4A) bei den Versuchstieren zu Beginn des Experiments war 0,84 µkat/L. In der Gruppe, die Cadmium erhielt, wurde ein signifikanter Anstieg der überwachten Werte auf durchschnittlich 1,52 µkat/L nach 14 Tagen (p < 0,001)="" und="" 1,87="" µkat/l="" nach="" 28="" tagen="" (p="" {{="" 13}}.004).="" in="" der="" gruppe,="" der="" gse="" zusammen="" mit="" cadmium="" verabreicht="" wurde,="" war="" der="" anstieg="" dieses="" markers="" signifikant="" langsamer="" als="" in="" der="" gruppe,="" die="" nur="" cadmium="" erhielt="" (1,23="" µkat/l="" nach="" 14="" tagen="" und="" 1,92="" µkat/l="" nach="" 28="" tagen).="" nach="" 14="" tagen="" des="" experiments="" unterschied="" sich="" diese="" gruppe="" sowohl="" von="" der="" kontrollgruppe="" (p="0.009)" als="" auch="" von="" der="" cadmiumgruppe="" (p="0.026)," während="" sie="" sich="" nach="" 28="" tagen="" signifikant="" unterschied="" nur="" aus="" der="" kontrollgruppe="" (p="0.003)." in="" der="" gruppe,="" die="" nur="" gse="" erhielt,="" stiegen="" die="" werte="" nach="" 14="" tagen="" ebenfalls="" auf="" 1,17="" µkat/l="" an.="" dieser="" wert="" unterschied="" sich="" signifikant="" von="" der="" kontrollgruppe="" (p="0.024)" und="" war="" vergleichbar="" mit="" dem="" wert="" der="" gruppe,="" die="" sowohl="" gse="" als="" auch="" cadmium="" erhielt.="" nach="" 28="" tagen="" ähnelten="" die="" werte="" der="" gse-only-gruppe="" denen="" der="">
Der mittlere AST-Gehaltswert (Abbildung 4B) bei den Versuchstieren zu Beginn des Experiments betrug 2,07 µkat/L. In der Gruppe, die Cadmium erhielt, wurde ein statistisch signifikanter Anstieg der beobachteten Werte erst nach 28 Tagen des Experiments verzeichnet (3,52 µkat/L, p=0,001). Überraschenderweise war der Anstieg dieses Markers in der Gruppe, der GSE zusammen mit Cadmium verabreicht wurde, sowohl nach 14 Tagen als auch nach 28 Tagen schneller und signifikant unterschiedlich von der Kontrollgruppe (2,67 bzw. 2,84 µkat/L, p {{15 }}.043 für beide), obwohl der Wert nach 28 Tagen etwas niedriger war als der der Nur-Cadmium-Gruppe. Die GSE-only-Variante hatte normale Werte.
In unserem Experiment war die Verabreichung von GSE in der Lage, den Anstieg der ALT-Aktivität zu verlangsamen. Dieser Effekt entspricht den zuvor berichteten Ergebnissen [14] und wird möglicherweise durch das Abfangen von Lipidperoxiden über eine Wasserstoffübertragung von einer phenolischen Verbindung auf das freie Radikale enthaltende Lipidperoxid verursacht. Andererseits war dieser Effekt längerfristig gering. Der durch Cadmium verursachte Anstieg der AST-Aktivität wurde durch GSE-Gabe eher beschleunigt. Langfristig kam es jedoch zu einer leichten Abnahme der AST-Aktivität. Somit kann GSE die toxische Wirkung von Cd auf Zellmembranen teilweise kompensieren.
2.2.5. Bestimmung von SOD- und CAT-Aktivitäten in der Leber
Zusätzlich zur direkten Teilnahme an oxidativen Reaktionen hemmt Cadmium die Aktivität antioxidativer Enzyme wie SOD und CAT, Enzyme, die Superoxidradikale bzw. Wasserstoffperoxid entgiften können [14]. SOD ist ein Enzym, das das Superoxidradikal effektiv quencht und es in das weniger toxische Wasserstoffperoxid umwandelt, das durch Katalase oder Peroxidase weiter zersetzt werden kann [26]. CAT ist ein Enzym, das in fast allen lebenden Organismen vorkommt, die Sauerstoff ausgesetzt sind. Es wirkt als Katalysator für die Zersetzung von Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff [27]. Es hat eine der höchsten Umwandlungszahlen unter den Enzymen [28] und ist als antioxidatives Enzym einer der Schutzmechanismen, die zur Aufrechterhaltung des Gleichgewichts im menschlichen Körper führen [29]. Der Mechanismus der Cd-induzierten Abnahme der Enzymaktivitäten ist wahrscheinlich die direkte Bindung von Cd an die aktiven Zentren der Enzyme [30].
Die Abnahmen der SOD- und CAT-Aktivitäten wurden auch in dieser Studie beobachtet. Zu Beginn des Experiments betrug die mittlere SOD-Enzymaktivität in der Leber (Fig. 5A) der Versuchstiere 18,4 U/mg des Proteins. Nach 14 Tagen des Experiments war die SOD-Aktivität in der GSE-erhaltenden Gruppe (21,1 U/mg) signifikant höher als in beiden Cadmium-erhaltenden Gruppen (p < 0.001="" und="" p="" {{="" 9}}.009="" für="" die="" gruppen,="" die="" nur="" cadmium="" bzw.="" cadmium="" mit="" gse="" erhielten),="" aber="" nur="" in="" der="" gruppe,="" die="" cadmium="" allein="" erhielt,="" war="" die="" sod-aktivität="" signifikant="" niedriger="" (16,7="" u/mg)="" als="" in="" der="" kontrollgruppe="" (p="0" .005).="" nach="" 28="" tagen="" des="" experiments="" unterschieden="" sich="" beide="" cadmium-erhaltenden="" gruppen="" signifikant="" von="" beiden="" kontrollgruppen="" (16,4="" u/mg,="" p="0,002" und="" 17,6="" u/mg,="" p="0,023" für="" cadmium="" nur="" cadmium="" bzw.="" cadmium="" mit="" gse)="" und="" die="" gruppe,="" die="" nur="" mit="" gse="" behandelt="" wurde="" (p="">< 0,001="" und="" p="0,005" für="" nur="" cadmium="" bzw.="" cadmium="" mit="">
Zu Beginn des Experiments betrug die mittlere CAT-Enzymaktivität in der Leber (Fig. 5B) 32,7 U/mg des Proteins. Nach 14 Tagen des Experiments war die CAT-Aktivität in der Gruppe, die GSE erhielt, signifikant höher (33,5 U/mg) als in beiden Gruppen, die Cadmium erhielten (p=0,002 und p=0,031 für die nur Cadmium bzw. Cadmium mit GSE-Gruppen), aber nur in der Gruppe, die Cadmium allein erhielt, war die CAT-Aktivität signifikant niedriger (23,8 U/mg) als in der Kontrollgruppe (p=0,005). Nach 28 Tagen nahm die CAT-Aktivität in der Gruppe, die GSE zusammen mit Cadmium erhielt, jedoch weiter auf 27,1 U/mg ab, erreichte die Werte der Gruppe, die nur Cadmium erhielt (25,8 U/mg), und unterschied sich signifikant von der Kontrollgruppe (p { {21}}.033). Die Gruppe, die nur mit GSE behandelt wurde, unterschied sich signifikant von beiden Cadmium-Gruppen (p=0.026 und p=0.012 für nur Cadmium bzw. Cadmium mit GSE). Interessanterweise wurden die durch Cadmium verursachten Abnahmen durch die gleichzeitige Gabe von GSE verlangsamt. Bei CAT wurden diese Wirkungen von GSE bereits früher beobachtet [14]. Die chelatbildende Wirkung der in GSE enthaltenen Phenolverbindungen verringert wahrscheinlich die Fähigkeit von Cadmium, an das aktive Zentrum des Enzyms zu binden.
2.2.6. Bestimmung des MT-Gehalts
Cadmium unterliegt keinen direkten Stoffwechselumwandlungen, sondern ist in allen Geweben hauptsächlich an Metallothionein (MT) gebunden. MT gehört zu einer Gruppe von intrazellulären, Cystein-reichen Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht und einem Molekulargewicht von 6–10 kDa. Die primäre Rolle von MT im Organismus umfasst die Aufrechterhaltung der Zinkhomöostase, die Entgiftung von Schwermetallen und den Schutz vor oxidativem Stress. Die MT-Expression wird durch viele exogene und endogene Faktoren wie UV-Strahlung, Schwermetalle, Stresshormone, freie Sauerstoffradikale, Entzündungsmediatoren, Infektionen, Traumata und Onkogenese induziert [31,32]. MT wird größtenteils in der Leber synthetisiert undNiereund ins Blut abgegeben. Obwohl MT für die Anreicherung von Cadmium im Gewebe verantwortlich ist, indem es dessen Ausscheidung verringert, schützt MT sowohl vor akuter als auch chronischer Cd-induzierter Toxizität [33]. In unserer Studie wurde der MT-Gehalt im Blut, in der Leber und überwachtNiere.
Der mittlere MT-Gehaltswert im Blut (Abbildung 6A) der Versuchstiere betrug zu Versuchsbeginn 23,9 nmol/g. Nach 14 Tagen waren die Änderungen minimal und nach 28 Tagen wurde eine große Variabilität zwischen den Wiederholungen beobachtet, was zu statistischen Unschlüssigkeiten führte (p=0.948). Der mittlere MT-Gehaltswert für dieNieren(Fig. 6B) der Versuchstiere zu Beginn des Experiments betrug 21,46 nmol/g. Die Werte änderten sich während des Experiments in keiner Versuchsgruppe signifikant (p=0,938). Der mittlere MT-Gehaltswert in der Leber (Fig. 6C) der Versuchstiere betrug zu Versuchsbeginn 17,15 nmol/g. Nach 14 Tagen stieg der MT-Gehalt in allen Versuchsgruppen leicht an und die Unterschiede zur Kontrollgruppe waren signifikant für die Cd-only-Gruppe und die GSE-only-Gruppe (p=0.008 und p=0 .046). Nach 28 Tagen kehrte der MT-Gehalt in der GSE-Gruppe auf den Wert der Kontrollgruppe zurück, während der MT-Gehalt in der Cd-Gruppe erhöht blieb und sich sowohl von der Kontroll- als auch der GSE-Gruppe unterschied (p=0.046 und p=0.035). In der Gruppe, die GSE zusammen mit Cadmium erhielt, unterschied sich der MT-Gehalt nicht signifikant von der Kontrollgruppe – was mit dem niedrigeren Cadmiumgehalt übereinstimmte, der in der Leber dieser Gruppe gefunden wurde – im Vergleich zur Gruppe, die nur Cd erhielt (der Unterschied war signifikant nach 28 Tage des Experiments).
Insgesamt wurden nur in der Leber statistisch signifikante Veränderungen des MT-Gehalts durch Cd beobachtet. Zuvor wurde über eine MT-Erhöhung im Blut von Versuchstieren berichtet, die Cadmium erhielten [34]. In diesem Fall legen die Ergebnisse nahe, dass die Entgiftung von Cd über MT eher in der Leber stattfinden könnte.
3. Materialien und Methoden
3.1. ExperimentdesignBraune Ratten der Gattung Wistar (acht Wochen alt, 235 ± 3 g) wurden in vier Gruppen von sechs Individuen eingeteilt: A) eine Kontrollgruppe von Ratten, die einer gewöhnlichen Ernährung folgten (n=6); B) eine Gruppe von Ratten, zu deren Ernährung GSE hinzugefügt wurde (200 mg GSE/Tag) (n=6); C) eine Gruppe erhielt Cadmium (2 mg Cd/Tag – konkret CdCl2 gelöst in Wasser) (n=6); und D) eine Gruppe, die eine cadmiumhaltige Nahrung (2 mg Cd/Tag) erhielt, der GSE zugesetzt wurde (200 mg GSE/Tag) (n=6). Der Extrakt wurde aus den Samen der Rebsorte Cerason gewonnen; seine Herstellung und Charakterisierung sind in Abschnitt 3.2 beschrieben. (Weinrebenkernextrakt). Der Extrakt wurde täglich in einer Dosis von 200 mg gewogen, bevor er den experimentellen braunen Ratten verabreicht wurde (200 mg GSE für jede Ratte; 0,85 g/l kg Körpermasse). Das GSE wurde mit Wasser verabreicht. Die Ratten erhielten ad libitum feuchte Futtermischungen und unbedenkliches (Säuglings-)Wasser. Einmal pro Woche wurde die Einstreu der Tiere gewechselt. Nach 14 und 28 Versuchstagen wurden drei Tiere jeder Gruppe eingeschläfert und ihr Blut wurde über eine Herzpunktion entnommen. Vor der Entnahme wurde eine intraperitoneale Medikation mit Fraxiparin (0,01 ml/kg) verordnet und danach erhielten die Tiere Diethylether unter Inhalationsnarkose. Anschließend wurde eine Blutprobe in mit Heparin beschichtete Mikroteströhrchen (bzw. Röhrchen mit EDTA – für Analysen von MT und Cadmium; ohne anschließende Zentrifugation) gesammelt, es folgte eine schonende Zentrifugation (800 g/10 min) und die Blutentnahme Plasma zur weiteren Analyse. Die Leber und rechtsNierewurden für weitere Analysen extrahiert. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt, und das Protokoll wurde von der Expertenkommission für die Sicherung des Wohlergehens von Versuchstieren der Mendel-Universität in Brünn (für das Projekt IGA-ZF/2016-AP011) genehmigt.
3.2. Weinrebenkernextrakt
Weinrebensamen (Sorte Cerason – Merlot × Seibel 13 666) wurden sortiert, gereinigt, getrocknet und gemahlen. Die Sortierung erfolgte über die Trester auf einer Trennmaschine, wo die Kerne von den Schalen getrennt wurden. Die so abgetrennten Samen wurden anschließend gespült, die leeren Samen entfernt und die restlichen Samen gereinigt. Die gereinigten und gewaschenen Samen wurden in einem Trockner bei 50 ◦C für 12 h getrocknet. Anschließend wurde das Saatgut mit einer Labormühle IKA MF 10 Basic (IKA Werke, Staufen im Breisgau, Deutschland) gemahlen. Die gemahlenen Samen wurden in 75-prozentigem Ethanol für 120 h (22 °C, geschüttelt mit 50 U/min; IKA KS 260 Basic, Hersteller: IKA Werke, Staufen im Breisgau, Deutschland) in einem Verhältnis von einem Teil gemahlener Samen zu zehn Teilen extrahiert Ethanol (m/m). Danach wurde der Extrakt in 25-ml-Reagenzgläser (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) gegeben und bei 4 °C und RCF 25, 000 × g zentrifugiert (Hettich MIKRO 220 Zentrifuge; Hettich, Westfalen, Deutschland). Aus dem Reagenzglas wurde eine zentrifugierte Probe entnommen und in einen Vakuumverdampfer-Destillationskolben (IKA RV 10 digital VC; IKA Werke, Staufen im Breisgau, Deutschland) überführt, wo das Ethanol verdampfte. Die Verdampfung erfolgte im Vakuum bei 90 °C, der Extrakt wurde in Petrischalen überführt und im Vakuum bei 53 °C lyophilisiert (Heto PowerDry PL 3000 Lyophilisator; Trigon-plus, Cestlice, Tschechische Republik). Der vorbereitete Extrakt wurde den Versuchstieren verabreicht.
CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENINFEKTIONEN VERBESSERN
3.3. Bestimmung der antioxidativen Aktivität und des Gesamtgehalts an Polyphenolen
Um die Objektivität der Ergebnisse zu gewährleisten, wurden vier grundsätzlich unterschiedliche Methoden zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität angewendet. Die Proben wurden auf einem automatischen BS-400-Spektrophotometer (Mindray, Shenzen, China) analysiert. Alle Proben wurden dreifach analysiert, wobei der resultierende Wert dem Durchschnitt dieser Messungen entsprach. Diese Analysen wurden in Anlehnung an Sochor et al. [35].
3.3.1. Bestimmung der antioxidativen Aktivität unter Verwendung des ABTS-Verfahrens
Eine Lösung zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität durch den ABTS-Assay wurde hergestellt, indem zwei Lösungen gemischt wurden – Lösung 1: 7 mM Lösung von ABTS, hergestellt durch Wiegen von m=9,60 mg pro 5 ml destilliertem Wasser; und Lösung 2: 4,95 mM Lösung von Kaliumpersulfat, hergestellt durch Wiegen von m=1,67 mg pro 5 ml destilliertem Wasser. Die resultierende Lösung wurde 1:10 mit destilliertem Wasser verdünnt und 12 h lang im Dunkeln und in der Kälte stehen gelassen. Dann wurden 150 µL Reagenz R1 (7 mM ABTS und 4,95 mM Kaliumpersulfat) in Plastikküvetten pipettiert, gefolgt von der Zugabe von 3 µL der Probe, und in einem Spektrophotometer (λ=660 nm) für 12 gemessen Mindest. Entsprechend der Eichkurve wurde die Extinktion in den äquivalenten Gehalt an Gallussäure umgerechnet; Die antioxidative Aktivität wurde anhand der Kalibrierungskurve unter Verwendung von Gallussäure als Standard (10–200 mg·L1) berechnet, und die Ergebnisse wurden als Gallussäureäquivalente ausgedrückt.
3.3.2. Bestimmung der antioxidativen Aktivität unter Verwendung des DPPH-Verfahrens
Zuerst wurden m {{0}},35 mg radikalisches DPPH gewogen. Diese Menge wurde in einen 250-mL-Messkolben überführt und mit Methanol aufgefüllt. Dann wurden 150 &mgr;l Reagenz R1 (0,095 mM DPPH) in Plastikküvetten pipettiert, gefolgt von der Zugabe von 15 &mgr;l der zu messenden Probe. Der DPPH-Test basiert auf der Fähigkeit des stabilen freien Radikals 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, mit Wasserstoffdonoren zu reagieren. DPPH zeigt eine starke Absorption im Ultraviolett-Vis-Spektroskopie (UV-VIS)-Spektrum. Die Absorption wurde 12 min bei λ=505 nm gemessen. Gemäß der Eichkurve wurde die Extinktion in den äquivalenten Gallussäuregehalt umgerechnet.
3.3.3. Bestimmung der antioxidativen Aktivität unter Verwendung der Ferric Reducing Antioxidant Power Method
Drei Lösungen wurden verwendet, um die antioxidative Aktivität unter Verwendung der Ferric Reduction Antioxidant Power (FRAP)-Methode zu bestimmen – (1) TPTZ-Lösung: 1 0 mM TPTZ (m=78,02 mg) gelöst in 25 ml von 40 mM HCl; (2) FeCl3-Lösung: 20 mM FeCl3 (m=135,13 mg) gelöst in 25 ml destilliertem Wasser; und (3) Acetatpufferlösung: 0,02 M Acetatpuffer, pH 3,6 (m=775 mg Natriumacetat, gelöst in 250 ml destilliertem Wasser, pH eingestellt mit Essigsäure). Die drei Lösungen wurden im Verhältnis 1:1:10 gemischt (TPTZ:FeCl3:Acetatpuffer). Dann wurden 150 &mgr;l Reagenz in Plastikküvetten pipettiert und 3 &mgr;l der Probe wurden hinzugefügt. Die Absorption wurde 12 min lang bei λ=605 nm gemessen. Die antioxidative Aktivität wurde anhand der Kalibrierungskurve unter Verwendung von Gallussäure als Standard (10–200 mg·L1) berechnet. Die Ergebnisse wurden als Gallussäureäquivalent ausgedrückt.
3.3.4. Bestimmung der antioxidativen Aktivität unter Verwendung der Chlorophyllin-Radikal-Methode
Insgesamt 200 µL Reagenz R1 (0,1 M HCl, Chlorophyllextrakt, Reaktionspuffer, Katalysator) wurden in Plastikküvetten pipettiert und anschließend 8 µL der Probe zugegeben. Dieses Verfahren nutzt die Fähigkeit von Chlorophyllin (Natrium-Kupfer-Salz des Chlorophylls), Elektronen aufzunehmen und abzugeben, während das Absorptionsmaximum stabil verändert wird. Dieser Prozess wird durch das alkalische Milieu und die Zugabe eines Katalysators bedingt. Die Absorption wurde 12 min bei λ=450 nm gemessen. Für die Berechnung wurden die letzten Messwerte verwendet. Die Ergebnisse wurden als Gallussäureäquivalent ausgedrückt.
3.3.5. Bestimmung der Gesamtpolyphenolkonzentration
Die Folin-Ciocalteu-Methode wurde verwendet, um die Gesamtpolyphenolverbindungen zu bestimmen. Alle Proben wurden dreifach analysiert, und der resultierende Wert wurde als Durchschnitt dieser Messungen erhalten. Eine 40-ul-Probe wurde in eine Küvette (3 ml) pipettiert und mit 1960 ul destilliertem Wasser verdünnt. Anschließend wurden 50 µL Folin-Ciocalteu-Reagenz in die Küvette gegeben. Die Mischung wurde gründlich geschüttelt und nach 3 min wurden 300 &mgr;l 20-prozentige Na2CO3-Decahydrat-Lösung zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde geschüttelt und 120 min bei 22 °C inkubiert. Nach dieser Zeit wurde die Extinktion (SPECORD 210; Carl-Zeiss, Jena, Deutschland) bei λ=750 nm gegen eine Blindprobe gemessen. Die Ergebnisse wurden als Gallussäureäquivalent ausgedrückt.
3.4. Bestimmung von Antioxidantien durch HPLC
Bestimmung einzelner antioxidativer Komponenten mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit Massenspektrometer. Analysen von Proben, die für die Abschätzung von Flavonoiden und Proanthocyanen verwendet wurden, wurden in einem Chromatographiesystem von Agilent Technologies 12{{10}}0 (Jet Stream Technologies, Santa Clara, CA, USA) durchgeführt, das aus dem folgende Geräte: Reservoirs für mobile Phasen, Entgaser, binäre Pumpe, Probenreservoir mit Autosampler und Massendetektor mit einem Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS (Jet Stream Technologies, Santa Clara, CA, USA). Die Trennung der Proben wurde in Zorbax SB C18-Chromatographiesäulen mit Abmessungen von 50 × 2,1 mm und einer Partikelgröße von 2,7 &mgr;m durchgeführt. Die Analysendauer betrug immer 6 min. Die Mitrate des Trägergases betrug 0,6 mL·min1. Die organische Komponente der mobilen Phase war von Methanolgradientqualität (Lösungsmittel B) und der wässrige Bestandteil enthielt 0,05 M Ammoniumformiat (Lösungsmittel A). Der Gradient der bewegten Phase war wie folgt: Zeit 0 min: 50 Prozent Lösungsmittel A und 50 Prozent Lösungsmittel B; Zeit 2,5 min: 100 Prozent Lösungsmittel A und 0 Prozent Lösungsmittel B; Zeit 5 min: 50 Prozent Lösungsmittel A und 50 Prozent Lösungsmittel B. Die Temperatur des Säulenthermostats wurde auf 45 °C eingestellt.
CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENSCHMERZEN VERBESSERN
3.5. Bestimmung ausgewählter biochemischer Marker
Biochemische Marker in Blut, Plasma, Leber undNiereder Tiere wurden überwacht, um die Schutzwirkung von GSE gegen die negativen Wirkungen von Cadmium zu bestimmen. Die folgenden Analysen wurden durchgeführt: (1) Plasmaanalysen: Gesamtplasmaantioxidansaktivität, Kreatinin, Harnstoff, ALT, AST. (2) Blutanalysen: MT. (3) Leberanalysen: SOD, CAT, MT. (4)NiereAnalysen: MT.
3.5.1. Bestimmung der Antioxidans-Gesamtaktivität im Plasma,Kreatinin, Harnstoff, ALT und AST Ein automatisiertes biochemisches Analysegerät BS{{0}} (Mindray, Shenzen, China) wurde verwendet, um die antioxidative Gesamtaktivität des Plasmas, Kreatinin, Harnstoff, ALT und AST zu analysieren. Bestimmung der antioxidativen Gesamtaktivität des Plasmas Die Methode der freien Radikale wurde verwendet, um die antioxidative Aktivität des Plasmas zu bestimmen [35]. Diese Methode nutzt die Fähigkeit von Chlorophyllin (dem Natrium-Kupfer-Salz des Chlorophylls), Elektronen aufzunehmen und abzugeben, während das Absorptionsmaximum stabil verändert wird. Dieser Prozess wird durch das alkalische Milieu und die Zugabe eines Katalysators bedingt. Insgesamt 200 µL Reagenz R1 (0,1 M HCl, Chlorophyllinextrakt, Reaktionspuffer und Katalysator) wurden in Plastikküvetten pipettiert, danach wurden 8 µL der Probe zugegeben. Die Extinktion wurde für 12 min bei λ=450 nm gemessen und der letzte Messwert zur Berechnung verwendet. Die antioxidative Aktivität wurde aus der Eichkurve unter Verwendung von Gallussäure als Standard berechnet und die Ergebnisse wurden als Gallussäureäquivalent ausgedrückt.
Bestimmung des KreatiningehaltsDas Prinzip der Methode ist die photometrische Bestimmung des Farbkomplexes von Kreatinin mit alkalischem Pikrat, dessen Bildungsgeschwindigkeit proportional zur Konzentration von Kreatinin in der Probe ist. Zur Bestimmung des Kreatinins wurde ein Diagnosekit der Firma Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Deutschland) verwendet. Insgesamt 180 µL Reagenz R1 (0,16 mM Natriumhydroxid) wurden in die Küvette pipettiert, gefolgt von der Zugabe von 10 µL der Probe und 30 µL des Reagenz R2 (4 mM Pikrinsäure). Die Extinktion wurde sechs Minuten lang bei λ=505 nm gemessen. Zur Berechnung wurde der Extinktionswert des Reagenzes R1 alleine mit der Probe und der Extinktionswert nach 6 min Inkubation mit Reagenz R2 verwendet.
Bestimmung der Alanin-AminotransferaseZur Bestimmung von ALT wurde ein Diagnosekit von Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Deutschland) verwendet. Zunächst wurden 150 µL Reagenz R1 (100 mM Tris-Puffer pH 7,5; 500 mM L-Alanin, 1200 U/L Laktatdehydrogenase) und 15 µL Plasmaprobe automatisch in die Küvetten pipettiert. Anschließend wurden 30 µL Reagenz R2 (15 mM 2--Oxoglutarat, 0,18 mM NADH) automatisch zupipettiert und die Mischung für 5 min inkubiert. Die Absorption wurde bei λ=340 nm gemessen. Zur Berechnung wurden die Extinktionswerte von Reagenz R1 alleine mit der Probe und die Extinktionswerte nach 5 min Inkubation mit der Probe verwendet. Das Ergebnis wurde gemäß Eichkurve auf die Enzymaktivität in µkat/L umgerechnet.
Bestimmung der Aspartat-AminotransferaseZur Bestimmung von AST wurde ein Diagnosekit von Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Deutschland) verwendet. Zunächst wurden 150 µL Reagenz R1 (80 mM Tris-Puffer pH 7,8, 240 mM L-Aspartat, 1200 U/L Malatdehydrogenase) und 15 µL Plasmaprobe von Versuchstieren automatisch in die Küvetten pipettiert. Anschließend erfolgten Mischen und Inkubation bei 37 °C für 270 s. Als nächstes wurden 30 µl R2-Reagenz (15 mM 2--Oxoglutarat, 0,18 mM NADH) automatisch pipettiert und die Mischung wurde für 5 min inkubiert. Die Absorption wurde bei λ=340 nm gemessen. Zur Berechnung wurden die Extinktionswerte von Reagenz R1 alleine mit der Probe und die Extinktionswerte nach 5 min Inkubation mit der Probe verwendet. Das Ergebnis wurde gemäß Eichkurve auf die Enzymaktivität in µkat/L umgerechnet.
Bestimmung von HarnstoffZur Bestimmung des Harnstoffs wurde wie folgt vorgegangen: 200 µL Reagenz R1 (Tris-Puffer pH 7,8, ADP, Urease und GLDH) und 200 µL Reagenz R2 (2-Oxoglutarat, NADH) wurden automatisch in Küvetten pipettiert, gefolgt von einer Probe mit einem Volumen von 4 µL, wonach die Mischung gemischt und 30 s lang bei 37 ◦C inkubiert wurde. Anschließend wurde die Extinktion bei λ=340 nm gemessen und nach weiteren 60 s wurde die Extinktion erneut gemessen. Zur Berechnung wurden die Extinktionswerte nach 30 s und nach weiteren 60 s verwendet. Die Werte wurden voneinander subtrahiert und das Ergebnis entsprechend der Eichkurve auf den Harnstoffgehalt umgerechnet.
Bestimmung der Gesamtproteine nach der Biuret-MethodeDie Bestimmung von Gesamtproteinen nach der Biuret-Methode ist in einer weiteren Veröffentlichung ausführlich beschrieben [9]. Insgesamt 180 µL Biuret-Reagenz (15 mM Natriumkaliumtartrat, 100 mM NaI, 5 mM KI und 5 mM CuSO4) wurden in die Küvette pipettiert, gefolgt von 45 µL der Probe. Nach zehnminütiger Inkubation bei 37 ◦C wurde die Extinktion bei der Wellenlänge λ=546 nm gemessen. Das Prinzip hierbei ist die Reaktion der Peptidbindung mit Cu(II) im alkalischen Milieu unter Ausbildung einer blauvioletten Farbe. Zur Berechnung wurden der Extinktionswert des Reagenzes allein und der Extinktionswert nach zehnminütiger Inkubation mit der Probe verwendet.
3.5.2. Bestimmung von Superoxiddismutase (SOD) und Katalase (CAT) Bestimmung der SOD-Aktivität, Ein kommerzieller Kit (19160 SOD, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) wurde verwendet, um die SOD-Aktivität (SOD, EC 1.15.1.1) zu bestimmen. Die Messung wurde in einer Plastikküvette auf einem automatischen Analysator BS 400 (Mindray, Shenzen, China) durchgeführt. Zunächst wurden 200 µL Reagenz R1 (20fach pufferverdünnte WST-Lösung) in die Küvette pipettiert und das Reagenz 108 s (1 min, 48 s) bei 37 °C inkubiert. Dann wurden 20 &mgr;l Probe pipettiert und bei 378 s (6 min, 18 s) wurde die Reaktion durch Zugabe von 20 &mgr;l Reagenz R2 (167 × pufferverdünnte Enzymlösung) gestartet. Die Mischung wurde für 72 s (1 min, 12 s) inkubiert und dann wurde die Extinktion bei λ=450 nm gemessen. Die Reaktionskinetik wurde für 180 s (3 min) gemessen und die Extinktion alle neun Sekunden abgelesen. Das Instrument berechnete gemäß der Kalibrierungsgleichung die durchschnittliche Extinktionszunahme pro Minute (∆A) und die SOD-Aktivität der gemessenen Proben. Die Ergebnisse wurden in U/ml ausgedrückt und anschließend in mg Protein umgerechnet.
3.5.3. Bestimmung des Metallothionein-GehaltsDie Bestimmung der Metallothionein-Konzentration in Blut, Leber uNierender braunen Ratten wurde unter Verwendung der adsorptiven Transfer-Stripping-Technik (AdTS) mit differentieller Pulsvoltammetrie (DPV) durchgeführt. Für die Analyse wurden 200 µL des analysierten Überstands entnommen und in einem Messgefäß mit 1 800 µL Brdiˇcka-Reagenz versetzt, wonach die eigentliche elektrochemische Bestimmung durchgeführt wurde. Der Assay wurde in Übereinstimmung mit einem zuvor beschriebenen Protokoll durchgeführt [37]. Es wurde ein klassischer Drei-Elektroden-Anschluss verwendet. Die Arbeitselektrode war eine hängende Quecksilbertropfenelektrode (HMDE) mit einer Tropfenfläche von 0,4 mm², während die Referenzelektrode Ag/AgCl/3 M KCl war und die Hilfselektrode eine Platinelektrode war. Der Basiselektrolyt (1 mmol·L1 [CO(NH3)6] Cl3 und 1 mol·L1 Ammoniumpuffer; NH3(aq) plus NH4Cl, pH 9,6) wurde für jede gemessene Probe gewechselt. Die DPV-Parameter waren wie folgt: Anfangspotential 0,7 V, Endpotential 1,75 V, Sprudeln 5 s, Abscheidungszeit 24 0 s, Modulationszeit 0,0 5 s, Intervallzeit 0,25 s, Potentialschritt 0,00105 V, Abtastrate 0,0042 V/s und Modulationsamplitude 0,02505 V. Die MT-Bestimmung wurde auf einem Messgerät durchgeführt, das aus einem 695 Autosampler, der mit einer Messeinheit VA Stand 693 verbunden und gesteuert wurde, bestand B. durch eine Kontrolleinheit 693 VA TraceAnalyser (alle Metrohm, Herisau, Schweiz). Das gesamte Messsystem wurde mit einem Julabo F25 (Julabo, Seelbach, Deutschland) auf 4 ◦C gekühlt. Die erhaltenen Voltammogramme wurden in das Programm VA Database 2.2 (Metrohm, Herisau, Schweiz) exportiert, und die analysierten Proben wurden durch aktives Sprudeln von Argon mit einer Reinheit von 99,999 Prozent desoxidiert.
3.5.4. Bestimmung des Cadmiumgehalts im Blut-, Leber- und Nierenaufschluss von Proben Ein Ethos One Mikrowellenextraktor (Milestone, Sorisole, Italien) wurde für die Zersetzung der Leber verwendet undNiereProben, und ein Multiwave 3000 Microwave Extractor (Anton Paar Graz, Österreich) wurde für den Aufschluss der Blutproben verwendet. Die Mineralisierung erfolgte auf nassem Weg unter Verwendung von 65-prozentiger Salpetersäure (HNO3 suprarein) (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) und 30-prozentigem Wasserstoffperoxid (H2O2 suprarein) (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland). Insgesamt 0,4 g Leber bzwNiereProbe wurde in eine Reihe von Teflflon-Behältern eingewogen und 5 ml 65-prozentiges HNO3, 3 ml 30-prozentiges H2O2 und 2 ml Milli Q H2O wurden der Probe zugesetzt. Die Behälter wurden verschlossen und das Instrument gemäß den Anweisungen des Herstellers gestartet. Die Mikrowellenzersetzung dauerte 40 min bei 210 ◦C. Anschließend wurden die Proben für 45 min gekühlt und bei 4 ◦C in PE-Behältern gelagert. Insgesamt 0,01 g einer Blutprobe wurden in eine Reihe von Glasbehältern eingewogen, und der Probe wurden 300 µl 65-prozentige HNO3 und 200 µl 30-prozentige H2O2 zugesetzt. Die Behälter wurden verschlossen und das Instrument gemäß den Anweisungen des Herstellers gestartet. Die Mikrowellenzersetzung dauerte 40 min bei einer Temperatur von 140 ◦C. Anschließend wurden die Proben für 45 min gekühlt und bis zur Bestimmung durch AAS bei 4 ◦C gelagert.
Bestimmung von Cadmium durch AtomabsorptionsspektrometrieDas Cadmium wurde auf einem Agilent 280/240 Series AA Systems Gerät (Agilent Technologies) bestimmt. Die Leber uNiereDie Proben wurden in einer Acetylen-Luft-Flamme (Fa AAS) und die Blutproben durch elektrothermische Atomisierung (ETA AAS) bei einer Wellenlänge von 228,8 nm analysiert. Aus einer Standardlösung von Cadmium (Analytika Praha, Prag, Tschechische Republik), mit einer Konzentration von 1,000 ± 0,002 g·L1. Es folgte eine Messung der Eichreihenlösungen und Erstellung der Eichkurven, wonach die Mineralisierung von Blut, Leber uNiereProben wurden gemessen.
3.6. Statistische AnalyseAlle Messungen wurden dreifach durchgeführt. Ausreißerwerte wurden mit dem Grubbs-Test identifiziert und ausgeschlossen (insgesamt wurden zwei Ausreißer gefunden). Vor der statistischen Analyse wurden die Daten durch logarithmische Transformation transformiert und durch einfache ANOVA (jeden Zeitpunkt separat) mit einem Tukey-HSD-Post-hoc-Test analysiert. Der Schwellenwert für die statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05="">
4. Schlussfolgerung
In jüngster Zeit hat es einen pharmazeutischen und wirtschaftlichen Trend gegeben, unter sekundären Pflanzenmetaboliten nach neuen Arzneimitteln zu suchen, bei denen es sich um Substanzen handelt, die zum Schutz vor einer Reihe von Krankheiten beitragen können. Dank der wichtigen biologisch aktiven Komponenten, die Weinrebensamen in ihrer Matrix enthalten, können (und werden) sie für medizinische Zwecke verwendet. Es ist bekannt, dass Traubenkernextrakte das Gewebe vor Schäden durch oxidativen Stress schützen, die durch das giftige Schwermetall Cadmium verursacht werden. Dieser Schutz wird wahrscheinlich durch die phenolische Zusammensetzung der verwendeten Traubenkerne beeinflusst. In dieser Studie wurde ein aus der halbresistenten Sorte Cerason hergestellter Traubenkernextrakt mit einem eher hohen Phenolgehalt auf Schutzwirkung gegen cadmiuminduzierte Veränderungen getestet. Das untersuchte GSE war in der Lage, die antioxidative Plasmaaktivität zu erhöhen, wenn es allein verabreicht wurde, und den Cadmiumgehalt in der Leber und zu senkenNierender Ratten bei gleichzeitiger Verabreichung. Dementsprechend sind die Erhöhungen des hepatischen Markerenzyms ALT undNiereMarker Kreatinin, verursacht durch Cadmium, wurden durch GSE verlangsamt. Darüber hinaus wurde die durch Cadmium verursachte Abnahme der Aktivitäten der antioxidativen Enzyme SOD und CAT durch die gleichzeitige Verabreichung von GSE verlangsamt. Diese Ergebnisse zeigen, dass GSE ein wirksames Schutzmittel gegen die Auswirkungen von Schwermetallen ist.
